Name: La manipolazione genetica del topo sviluppo dellipotalamo attraverso In utero Elettroporazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Impara l'elettroporazione in utero per manipolare geni nell'ipotalamo embrionale del topo. Questo metodo consente di attivare o reprimere funzioni geniche specifiche nello sviluppo neurobiologico.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla German Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

1. Preparazione del DNA e vetro Micropipette per Iniezione <ol><li> Buone micropipette di vetro di qualità sono essenziali per ridurre il tasso iniziale aborto elevato a causa della perdita di liquido amniotico. La procedura di tirare micropipette di vetro è stato ben documentato 13,18,25. Uso 1.2 mm di diametro capillari tirato in un convenzionale Sutter P-97 dispositivo con le impostazioni P = 500; calore = 300; Pull = 40; Velocità = 50; Tempo = 50. Montare l&#39;estrattore con 3 millimetri filamenti &quot;di valle&quot; (Sutter Instrument FT330B). Le due millimetri filamenti dimensioni hanno prodotto per noi i risultati meno soddisfacenti. D&#39;altra parte, smussatura della micropipetta punte non sembra migliorare i risultati per noi. </li><li> Sciogliere purificato, DNA plasmidico privo di endotossine in PBS (Cell Culture Grade) contenente 0,1% Verde fast ad una concentrazione finale di 1 a 2 mg / mL. Il oVerde renderà la soluzione iniettata visibile nel ventricolo cerebrale embrionale. </li><li> Carico 10 microlitri della soluzione di DNA nel micropipetta di vetro. </li&gt; <li> Collegare la micropipetta di vetro al sistema di iniezione (pompa Pico) o bocca pipetta. </li></ol> 2. Anestesia Preparare il tavolo chirurgico con una piastra elettrica e gli strumenti chirurgici. Accendere le sorgenti di luce fredda per facilitare la visualizzazione degli embrioni. Disinfettare gli strumenti chirurgici utilizzando per esempio una perlina di vetro sterilizzatore. Sono possibili tre diverse procedure di anestesia per questo protocollo (vedi discussione). Qui descriveremo quello che consideriamo il meglio, utilizzando inalazione isoflurano per l&#39;induzione dell&#39;anestesia (portata 0,5 l / min) e di manutenzione (portata 1 l / min). <ol><li> Introdurre il mouse incinta in un piccolo trasparente (così il mouse rimane visibile) contenitore collegato al Komesaroff Mark 5 anestetico dispositivo da un breve tratto di tubo. </li><li> Riempire il vaporizzatore con isoflurano, quindi aprire la bombola di ossigeno collegato al dispositivo. Saltare uno o due impulsi di isoflUrane / ossigeno (0,5 l / min) nel contenitore tenendo premuto il mouse e guardare per narcosi a prendere piede </li><li> Prendete il mouse fuori, coprire gli occhi con unguento per evitare che si secchi e si adattano la maschera anestesia flusso sulla sua testa immediatamente. </li></ol> 3. Laparotomia <ol><li> Posizionare il mouse a pancia in su sul pad riscaldamento (altrimenti la sua temperatura corporea scende molto velocemente, diminuendo le possibilità di recupero) e fissare il suo corpo in posizione fissando le sue quattro gambe ai lati con del nastro adesivo. Valutare la profondità dell&#39;anestesia controllando per la perdita di risposta alla stimolazione riflessa (es. punta o la coda pizzico con una forte pressione). </li><li> Radersi la superficie addominale e disinfettarlo con il iodophorpovidone-iodio (Braunoderm). </li><li> Effettuare una incisione longitudinale (lungo da 1 a 1,5 cm) sulla cute addominale. Poi tagliare il peritoneo. Posizionare garza di cotone intorno alla incisione. Fai un corno uterino visibile ed estrarlo con cautela con una pinza smussato sulla PBS-risciacquato gauze. Risciacquare dell&#39;utero con PBS molto spesso per mantenerlo sempre inumidito (Figure 2A e 2B). Durante l&#39;intera procedura di evitare di tirare il mesometrio o dell&#39;utero stretto, poiché l&#39;alta pressione all&#39;interno dell&#39;utero trasmetterà all&#39;embrione aumentando le probabilità di perdita di fluido in fase di iniezione con conseguente aborto. </li></ol> 4. Iniezione DNA nel ventricolo cerebrale <ol><li> Tenere l&#39;utero in modo tale che i ventricoli cerebrali possono essere visualizzati. Non estesamente riposizionare un embrione che si trova in una posizione sfavorevole - questo aumenta solo le probabilità di aborto. </li><li> Guardando la testa dell&#39;embrione dall&#39;alto, localizzare visivamente il gap o fessura tra gli emisferi corticali destro e sinistro. Gli emisferi sono facili da distinguere e ventricoli laterali al loro interno (per non essere presi di mira) di solito possono essere percepite come forme un po &#39;più scuri. Se un embrione è risultato essere perfettamente orientato per l&#39;iniezione del DNA (Figures 2C e 2D), è possibile perforare la parete uterina e entrano nel terzo ventricolo in una volta. Tenere la micropipetta di vetro a 45 ° rispetto alla parete uterina e puntura alla fine rostrale del divario tra emisferi corticali, penetrando per circa 1 mm. In questo modo la punta della micropipetta di vetro entrerà nel terzo ventricolo del cervello (non il ventricolo laterale) (Figure 2C e 2D). In embrioni meno favorevolmente orientati è utile prima perforare la parete uterina (sempre a 45 °) in prossimità della testa embrionale, posizionare la punta micropipetta nella giusta posizione tra gli emisferi corticali e solo allora perforare il cervello. Iniettare circa 1 ml di soluzione di DNA nel terzo ventricolo (una buona iniezione riempie il ventricolo con liquido verde). Ripetere la stessa procedura con tutti gli embrioni di un corno dell&#39;utero. Questo permette un certo tempo per la soluzione di DNA per mescolare uniformemente con il fluido ventricolare e raggiungere il entire neuroepitelio. </li></ol> 5. Targeting l&#39;ipotalamo per elettroporazione <ol><li> Accendere il elettroporatore e regolare le impostazioni in base all&#39;età embrionale (per E12.5 usiamo 5 impulsi a onda quadra, 50 V, 50 msec ON/950 msec OFF). Utilizzare come polo positivo all&#39;elettrodo ago in acciaio inossidabile (CUY550-10) e come polo negativo di un elettrodo piatto rotondo (CUY700P4L). (È importante che gli elettrodi sono più piccoli l&#39;embrione, poiché altrimenti la corrente scorre dietro l&#39;embrione ma non attraverso esso.) </li><li> Selezionare per elettroporazione quegli embrioni la cui parte dorsale è alto (cioè rivolta verso lo sperimentatore) (come la maggior parte di loro sono), e scartare quelle il cui orientamento non è favorevole. Ora è possibile toccare l&#39;utero con le dita etanolo-disinfettate o con i guanti. Tenendo dell&#39;utero con una pinza, tuttavia, potrebbe interferire con il flusso di corrente durante elettroporazione. </li><li> Perforare la parete uterina per la testa dell&#39;embrione tra il amnsac iotico e la placenta dalla spinta verso il basso attraverso di essa con la punta dell&#39;elettrodo dell&#39;ago. Utilizzare il dito indice dell&#39;altra mano come blocco di spinta. Circa 5 mm della punta dell&#39;elettrodo deve essere ora tra il sacco amniotico e la parete uterina, circa al livello del mesencefalo (figure 2E e 2F). Ricordate che questo è il &quot;mira elettrodo&quot;, quindi la sua posizione determinerà quale è più probabile ottenere trasfettate parte del neuroepitelio ipotalamico. L&#39;embrione deve essere molto gentilmente &quot;spremuto&quot; tra gli elettrodi. </li><li> Con l&#39;altra mano, posizionare l&#39;elettrodo piatto tondo esterna della parete dell&#39;utero sul lato opposto della testa dell&#39;embrione (figure 2E e 2G). </li><li> Utilizzare l&#39;interruttore a pedale per applicare tensione (50 V, 50 ms ON, 950 ms OFF, 5 impulsi a onda quadra). </li><li> Tirare lentamente l&#39;elettrodo ad ago fuori dell&#39;utero, mentre trattenendo l&#39;utero con il dito indice dell&#39;altra mano - se amniotic liquido viene perso attraverso la parete forata, di solito l&#39;embrione subirà aborto. Ripetere la procedura con tutti gli embrioni. </li><li> Ritorna il corno dell&#39;utero nell&#39;addome e ripetere l&#39;iniezione ed elettroporazione nel corno residuo. </li></ol> 6. Completamento della Chirurgia <ol><li> Dopo l&#39;iniezione ed elettroporazione di tutti gli embrioni, posizionare l&#39;utero torna in addome con molta attenzione, posizionato esattamente come erano prima e umide cavità peritoneale con soluzione fisiologica prima di chiuderlo. </li><li> Sutura del peritoneo con catgut (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914). Per la chiusura della pelle uso &quot;interruppe stitch&quot; methodwith una sutura più resistente (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner TO 07171L). </li><li> Disinfettare la superficie dell&#39;addome con povidone-iodio (Braunoderm) e iniettare un non-steroidei anti-infiammatori per via sottocutanea (ad esempio 100 ml di una soluzione 1:10 di Rimadyl in 0.9% NaCl) o, meglio ancora, un oppioide come buprenorphine (Temgesic, da 0.05 a 0.1 mg / kg di peso corporeo in 0.9% NaCl) per alleviare il dolore. </li><li> Rimuovere la madre dalla macchina anestetica e metterlo in una gabbia che è riscaldata da una piastra elettrica. Monitorare il mouse continuamente fino a quando non è completamente recuperato dal anestesia. Successivamente, controllare gli animali ogni giorno per assicurare che si stanno riprendendo dalla procedura senza alcun segno di infezione o dolore. </li></ol> 7. Analisi dei risultati <ol><li> Raccogliere gli embrioni (o postnatals) secondo il giorno desiderato di analisi. Topi postnatale (1-2 giorni di età) vengono uccisi per decapitazione. </li><li> Separare ogni embrione secondo il precedente elettroporazione annotazione. Sezionare il cervello allo stereomicroscopio e controllare al microscopio per segnale fluorescente verde (GFP dal reporter) nella regione appropriata. </li><li> Il cervello selezionato può essere analizzato &quot;fresco&quot;: fissare il tessuto per un breve periodo in paraformaldeide al 4% e incorporare nel agarosio 4% o in gelatina-albumin, poi sezione su un dispositivo vibratomo-type (Figura 3). Per l&#39;analisi immunoistochimica dettagliata (Figura 4), ​​crio-proteggere il cervello in soluzione di saccarosio al 30%, incorporare nel montaggio Ottobre medio (Tissue Tek) poi tagliare 20 sezioni micron in un criostato. </li></ol>

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<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+targeting+mechanism+of+Angiopep-conjugated+poly%28ethylene+glycol%29-co-poly%28epsilon-caprolactone%29+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles.</a> Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+for+stable+expression+of+foreign+genes+in+mammalian+cells+by+use+of+the+untranslated+leader+sequence+from+EMC+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus.</a> Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+promoters+for+driving+efficient+transgene+expression+in+neonatal+porcine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets.</a> Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Circa l&#39;anestesia: Poiché elettroporazione in utero nell&#39;ipotalamo può essere tecnicamente ardua e richiedono tempi più lunghi narcosi, preferiamo indurre e mantenere l&#39;anestesia mediante somministrazione di una miscela di ossigeno e isoflurano. Nella nostra esperienza, gli animali possono rimanere adeguatamente anestetizzato in questo modo, per periodi fino a un&#39;ora almeno, la ripresa della madre è molto veloce, e la sopravvivenza dell&#39;embrione migliorata. Altri approcci per l&#39;anestesia...

Manipolazione genetica del cervello di topo embrionale è un approccio preferito per conoscere regolazione dello sviluppo. La generazione di linee mutanti topo però è lento e costoso. Un metodo efficace per introdurre specifici cambiamenti genetici nello sviluppo di neuroni del cervello dei mammiferi è elettroporazione in utero. In sostanza, la tecnica consiste transfecting DNA nel cervello embrionale neuroepithelium mediante impulsi elettrici, consentendo quindi l&#39;embrione di sopravvivere per un certo periodo di tempo, raccogliere il cervello e li esamini per possibili romanzo, fenotipi informativi. In questo modo, l&#39;sperimentatore può verificare ipotesi quasi immediatamente senza i lunghi periodi di attesa necessari per la produzione di mutanti di topo. Trasfezione di DNA in via di sviluppo è iniziato con embrioni in elettroporazione ovo su embrioni di pollo 1. L&#39;essenziale proof-of-concept per il mouse è stata eseguita in cultura <sup&gt; 2. Questo è stato presto seguito dalle prime descrizioni della tecnica del mouse in utero 3,4. Il problema principale è quello di transfettare il cervello di embrioni in via di sviluppo in utero senza ucciderli o della madre. Apprendimento per eseguire l&#39;intervento necessario (laparotomia, iniezione, elettroporazione) richiede un lungo periodo di formazione. Una volta che l&#39;intervento chirurgico è stato masterizzato al punto in cui il rapporto di sopravvivenza degli embrioni è accettabile, la prossima domanda chiave è: quali strutture cerebrali sono accessibili? Non a caso, i primi documenti pubblicati mostrano risultati ottenuti con elettroporazione in utero focalizzati su sviluppo corticale 5-9. Questo è ancora vero per la maggior parte delle pubblicazioni utilizzando questa tecnica, poiché la regione del cervello di sviluppo del mouse più accessibile per procedure chirurgiche è la corteccia (Figura 1). La procedura per elettroporazione in utero nella corteccia è stata descrittain stampa 10 e in video 11-14. Una modifica della tecnica può essere utilizzata per indirizzare una parte ventrale del telencefalo, i gangli della base 15. Al di là del telencefalo, il diencefalo (classicamente suddiviso in talamo e ipotalamo) è una regione del prosencefalo più difficile da raggiungere. Un piccolo numero di documenti di report di targeting della sua parte dorsale e più accessibile, il talamo 16-19. L&#39;ipotalamo è la parte più ventrale del prosencefalo, quindi quello localizzato più profondamente dalla superficie dorsale (corteccia) (Figura 1). Questa regione rimane una sfida difficile per i ricercatori impegnati a manipolare geneticamente il cervello di topo in utero. A nostra conoscenza, solo pochissimi articoli riferire sui risultati di in utero trasfezione nell&#39;ipotalamo del mouse 20,21. Tuttavia, l&#39;importanza funzionale dell&#39;ipotalamo cannot essere sottovalutata, in quanto regola i comportamenti come il mangiare e il bere, l&#39;accoppiamento, l&#39;allevamento e la genitorialità 22. Inoltre, alterazioni dello sviluppo dell&#39;ipotalamo contribuiscono ad originare in seguito a condizioni di vita come l&#39;obesità, l&#39;ipertensione, il diabete e la pubertà precoce 23. Essere in grado di modificare geneticamente l&#39;ipotalamo durante lo sviluppo potrebbe fornire uno strumento molto potente per capirlo. Il protocollo chirurgico di base per la laparotomia di topo gravide che utilizziamo qui è simile a quella utilizzata in altri protocolli 11,13,14,24. Noi li descrivono brevemente qui per completezza. Chiave del nostro procedimento, invece, sono il tipo di anestesia, il luogo di iniezione, del tipo di elettrodi e l&#39;inserimento e la posizione dell&#39;elettrodo positivo rispetto alla testa del embrione. Preferiamo indurre e mantenere l&#39;anestesia per inalazione gas su semplice anestesia intraperitoneale, poiché il primo consente l&#39;un po &#39;più lunghi periodi di narcosi necessari per un intervento chirurgico difficile. Risultati inalazione isoflurano in veloce recupero dall&#39;anestesia, dal momento che di solito la madre dimostra un comportamento normale già minuti dopo l&#39;intervento chirurgico. Il più facile punto di iniezione della soluzione di DNA con la micropipetta di vetro è il ventricolo laterale, che però è completamente inadatto per ipotalamo elettroporazione. Iniezione diretta del terzo ventricolo è infatti cruciale per indirizzare le strutture diencefaliche profonde. È possibile trasfettare all&#39;ipotalamo da E12.0 E12.5 o con elettrodi standard, off-the-shelf. Abbiamo trovato alcuni degli elettrodi fabbricati da Nepa Gene (Chiba, Giappone) particolarmente adatta a questo scopo. Con la nostra procedura otteniamo trasfezione di tutta neuroepitelio ipotalamica o parziale, trasfezione regionale a seconda dell&#39;orientamento elettrodo. Qui mostriamo la tecnica transfettando corpo mammillary, discutibilmenteil più profondo e incasso di tutti i nuclei ipotalamici. Inoltre, mostriamo analisi istologica dettagliata delle cellule trasfettate giù al livello cellulare di risoluzione. Un confronto di elettroporazione in utero ad altri procedimenti di trasfezione sviluppo cerebrale topo in utero può essere trovata nella sezione di discussione.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>REAGENTS</td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Sanofi GmbH</td><td></td><td>anestetico</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>HDG9623</td><td>anestetico</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Pharma GmbH</td><td></td><td>anestetico</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Fluka</td><td>44715</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer</td><td></td><td>antinfiammatorio non steroideo</td></tr><tr><td>Braunoderm Braun</td><td></td><td>3887138</td><td>tampone povidone-iodio</td></tr><tr><td>fosfato soluzione salina PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Temgesic (buprenorfina)</td> <td>Essex Pharma</td><td></td><td>oppioide analgesico</td></tr><tr><td>unguento per gli occhi</td><td>Pan-Ophtal</td><td>7136926</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Bayer</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Dispositivo anestetico Komesaroff Mark-5</td><td>Medical Developments Australia</td><td>ACN 004 903 682</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Estrattore capillare P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Presstome</td><td>Precisionary Instr.</td><td>VF-300</td><td>Dispositivo di tipo vibratomo</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Elettroporatore</td><td>Nepa Gene Co. Ltd.</td><td>CUY21EDIT</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Elettrodo 1</td><td>Nepa Gene Co. Ltd.</td><td>CUY550-10</td><td>Elettrodo ad ago in acciaio inox, punta 10 mm, diametro 0,5 mm.</td></tr><tr><td>Elettrodo 2</td><td>Nepa Gene Co., Ltd.</td><td>CUY700P4L</td><td>Coperchio Piastra rotonda in platino diametro 4 mm</td></tr><tr><td>Sorgente di luce fredda in fibra ottica</td><td>Leica</td><td>KL2500 LCD&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Capillari in vetro</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC120T-15</td><td>1,2 mm O.D. x 0,94 mm I.D.</td></tr><tr><td>sterilizzatore a microsfere di vetro</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>Harvard Apparatus</td><td>py872-5272</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dispositivo di iniezione</td><td>World Precision Instruments</td><td>Pompa pneumatica Pico PV820</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sutura con filo di sutura rivestita in Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>V4914</td> Sutura <td>peritoneale</td></tr><tr><td>Thr. Supramid</td><td>Serag Wiessner</td><td>TO07171L</td><td>Sutura cutanea</td></tr></tbody></table>

la manipolazione genetica del topo sviluppo dell&#39;ipotalamo attraverso<em&gt; in utero</em&gt; elettroporazione

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Modificazione genetica di specifiche regioni del cervello dei mammiferi è sviluppare un approccio sperimentale molto potente. Tuttavia, generando nuovi mutanti di topo è spesso frustrante lentezza. È stato dimostrato che l&#39;accesso al cervello di sviluppo del mouse in utero con ragionevole sopravvivenza post-operatoria è possibile. Ancora, risultati con questa procedura sono stati riportati quasi esclusivamente per la parte più superficiale e facilmente accessibile del cervello di sviluppo, cioè la corteccia. Il talamo, una regione stretto e più mediale, è dimostrato più difficile da bersaglio. Trasfezione in nuclei più profondo, specialmente quelli dell&#39;ipotalamo, è forse il risultato più impegnative e, pertanto, molto pochi sono stati segnalati. Qui mostriamo una procedura per individuare l&#39;intera neuroepitelio ipotalamica o parte di essa (regioni ipotalamiche) per trasfezione mediante elettroporazione. Le chiavi del nostro approccio sono più volte narcosi, l&#39;iniezione in tHird ventricolo, e tipo e posizionamento degli elettrodi appropriata. Inoltre, vi mostriamo i risultati di targeting e la successiva analisi istologica del nucleo ipotalamico più incassata, il corpo mammillary.

La maggior parte dei neuroni dell&#39;ipotalamo sono nati tra E11.5 a E15.2, secondo l&#39;analisi nascita-dating nel ratto 26 tradotto nella po &#39;più breve di sviluppo del mouse 27,28. Il picco della neurogenesi ipotalamica è raggiunta a E12.5 29-31. Conseguentemente, all&#39;età trasfezione scelto per questo studio (E12.5), una grande proporzione di neuroni ipotalamici può essere etichettata ad ogni dato livello rostro-caudale. Analisi alla E18.5 su sezi...

Nonostante l&#39;importanza funzionale e mediche dell&#39;ipotalamo,<em&gt; In utero</em&gt; Manipolazione genetica del suo sviluppo è stato raramente tentata. Mostriamo una procedura dettagliata per<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione nell&#39;ipotalamo mouse e mostrano risultati rappresentativi (regionale) trasfezione ipotalamo totale e parziale.

La manipolazione genetica del topo sviluppo dell&#39;ipotalamo attraverso<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

L'obiettivo generale di questa procedura è trasfettare il DNA plasmidico nell'ipotalamo di embrioni di topo in sviluppo in utero, al fine di attivare o reprimere la funzione di un gene di interesse. Questo viene realizzato anestetizzando innanzitutto il topo gravido ed esponendo l'utero mediante laparotomia. Il secondo passaggio consiste nell'iniettare la soluzione di DNA nel terzo ventricolo del cervello embrionale.Successivamente, l'elettrodo positivo viene posizionato all'interno dell'utero tra la placenta e la testa dell'embrione. L'elettrodo negativo viene collocato sulla superficie esterna dell'utero ed vengono applicati impulsi elettrici. L'ultimo passaggio consiste nel rimuovere i cervelli embrionali transfettati sei giorni dopo.Infine, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per analizzare le alterazioni fenotipiche delle cellule trasfettate, come numero, forma, posizione, espressione di marcatori, ecc. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la trasfezione virale, sono innanzitutto l'assenza di necessità di precauzioni speciali e, in secondo luogo, la possibilità di indirizzare una regione specifica. Inoltre, grazie all'elettropor

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In Utero iniezione intraventricolare e Elettroporazione di E15 embrioni di topo

Elettroporazione in utero permette per la consegna rapida in un gene-spazialmente e temporalmente modo controllato nello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC). Qui descriviamo altamente adattabile a protocollo di elettroporazione utero che possono essere usati per fornire costruisce espressione in più domini embrionale del SNC, tra cui il diencefalo telencefalo, e della retina.

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

Un metodo di trasferimento genico nel cervello del mouse di sviluppo è descritta utilizzando un metodo unico chirurgico e la forma speciale di elettrodi. Questa tecnica unica consente la trasfezione di DNA plasmidico temporalmente e spazialmente, che aiuterà molti neuroscienziati a studiare lo sviluppo del cervello.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

In Elettroporazione vitro del labbro inferiore Rombico di embrioni di topo Midgestation

Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo per elettroporare in utero della corteccia cerebrale e l'ippocampo a E14.5 nei topi. Abbiamo anche dimostrato che questo è un metodo valido per studiare dendriti e spine in queste due regioni cerebrali.

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

Qui presentiamo un protocollo che fornisce uno strumento per esaminare i meccanismi di regolazione di geni specifici durante lo sviluppo dell'ippocampo. L'impiego dell'elettroporazione ex utero e della coltura organotipica di fette consente l'up- e down-regolazione dell'espressione di geni di interesse in singole cellule e segue il loro destino durante lo sviluppo.

Ex utero elettroporazione e Organotipica Fetta Cultura del mouse ippocampale Tissue

Questo protocollo descrive in dettaglio come trasfettare in modo specifico diverse regioni del sistema nervoso centrale C57BL/6 tramite elettroporazione in utero. Incluso in questo protocollo ci sono istruzioni dettagliate per le trasfezioni delle regioni che si sviluppano nella corteccia, nell'ippocampo, nel talamo, nell'ipotalamo, nel nucleo del setto laterale e nello striato.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, laterale del setto Nucleus- e Striatum specifici<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione in C57BL / 6 del mouse

Eterotopia nodulare periventricolare (PNH) è la forma più comune di malformazione dello sviluppo corticale (MCD) nell'età adulta, ma la base genetica rimane sconosciuta nei casi più sporadici. Recentemente abbiamo sviluppato una strategia per identificare nuovi geni candidati per MCDs e confermare direttamente loro ruolo causativo in vivo.

Una nuova strategia che unisce Array-CGH, sequenziamento dell'intero-esoma e nell'Utero elettroporazione in roditori per identificare geni causativi per le malformazioni del cervello

Il ruolo dei geni associati alle malattie recentemente scoperti nella patogenesi dei disturbi neuropsichiatrici rimane oscuro. Un bilaterale modificato nella tecnica di elettroporazione utero consente il trasferimento genico in grandi popolazioni di neuroni e l'esame degli effetti causali dei cambiamenti di espressione genica sul comportamento sociale.

Una pipeline che utilizza l'elettroporazione bilaterale in utero per interrogare le influenze genetiche sul comportamento dei roditori

In questo protocollo, descriviamo come iniettare lentivirus nella cavità amniotica del topo a E7.5, portando a una trasduzione uniforme dell'intera piastra neurale, con effetti dannosi minimi sulla sopravvivenza o sullo sviluppo embrionale.

Targeting della placca neurale murina mediante nano-iniezione in utero (NEPTUNE) al giorno embrionale 7.5

Impara l'elettroporazione in utero per manipolare geni nell'ipotalamo embrionale del topo. Questo metodo consente di attivare o reprimere funzioni geniche specifiche nello sviluppo neurobiologico.

La manipolazione genetica del topo sviluppo dell'ipotalamo attraverso

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