La manipolazione genetica del topo sviluppo dell'ipotalamo attraverso In utero Elettroporazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di trasfettare il DNA plasmatico nell'ipotalamo di embrioni di topo che si sviluppano in utero al fine di attivare o reprimere la funzione di un gene di interesse. Ciò si ottiene anestetizzando prima la topolina incinta ed esponendo l'utero attraverso la laparotomia. Il secondo passo consiste nell'iniettare la soluzione di DNA nel terzo ventricolo del cervello embrionale.

Successivamente, l'elettrodo positivo viene posizionato all'interno dell'utero tra la placenta e la testa embrionale. L'elettrodo negativo viene posizionato sulla superficie uterina esterna e vengono applicati impulsi elettrici. Il passaggio finale consiste nel rimuovere i cervelli embrionali trasfettati sei giorni dopo.

In definitiva, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per analizzare le alterazioni fenotipiche delle cellule trasfettate, il numero, la forma, la posizione, l'espressione dei marcatori, ecc. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la trasfezione virale sono in primo luogo, non richiede precauzioni speciali e, essendo due strutture, in secondo luogo è possibile il targeting di una regione specifica. E in terzo luogo, con l'elettroporazione Ute, lo screening dei geni candidati è più veloce.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché l'iniezione della soluzione di DNA nel terzo ventricolo e il corretto posizionamento dell'elettrodo dell'ago richiedono un'inclinazione manuale avanzata insieme a una certa esperienza. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo dello sviluppo ipotalamico, in particolare quelle relative alla migrazione cellulare, nonché al modo in cui le singole regioni e i nuclei sono geneticamente specificati. Inizia questa procedura tirando alcune micro pipette di vetro di buona qualità in quanto sono essenziali per ridurre l'alto tasso di aborto iniziale dovuto alla perdita di liquido amniotico.

Per preparare il DNA, sciogliere il DNA plasmatico privo di endotossine purificato in PBS contenente lo 0,1% di verde veloce a una concentrazione finale di uno o due microgrammi per microlitro. Il verde veloce renderà visibile la soluzione iniettata nel ventricolo cerebrale embrionale. Quindi, caricare 10 microlitri della soluzione di DNA nella micropipetta di vetro.

Quindi collegare la micropipetta di vetro al sistema di iniezione o a una pipetta per la bocca. In questa fase, preparare il tavolo operatorio con un termoforo e gli strumenti chirurgici Accendere le fonti di luce fredda per facilitare la visualizzazione degli embrioni. Quindi disinfettare gli strumenti chirurgici utilizzando uno sterilizzatore a microsfere di vetro.

Quindi, anestetizzare un topo gravido con fluoro. Dopo che il topo è stato anestetizzato, applicare un unguento sugli occhi per evitare che si secchi. Successivamente applicare la maschera sul viso per mantenere l'anestesia continua.

Ora posiziona il mouse su un termoforo con la pancia in su. Fissa il suo corpo in posizione fissando i suoi quattro arti con del nastro adesivo. Assicurati che il topo sia completamente anestetizzato pizzicando la coda per il reflusso.

Quindi radere la superficie addominale e disinfettarla con una soluzione di iodio. Praticare un'incisione longitudinale lunga circa un centimetro e mezzo sulla pelle addominale. Successivamente, taglia il peritoneo.

Quindi posizionare una garza di cotone attorno all'incisione. Sciacquare la garza con PBS. Esporre un corno uterino estraendolo con cautela con una pinza smussata.

Evitare di tirare forte il miometrio o l'utero. Poiché l'alta pressione all'interno dell'utero aumenterà le possibilità di perdita di liquidi embrionali al momento dell'iniezione, con conseguente aborto. Quindi posiziona il corno uterino su una garza risciacquata con PBS e risciacqualo con PBS ogni pochi minuti per mantenerlo inumidito.

Ora, al microscopio, tieni l'utero in modo tale che i ventricoli cerebrali possano essere visualizzati. Non riposizionare eccessivamente l'embrione che si trova in una posizione sfavorevole. Questo non fa che aumentare le possibilità di aborto.

Guarda la testa dell'embrione dall'alto per individuare lo spazio in cui si fessura tra gli emisferi corticali sinistro e destro. Gli emisferi sono facili da distinguere e i ventricoli laterali al loro interno possono solitamente essere percepiti come forme un po' più scure. Se si scopre che un embrione è perfettamente orientato per l'iniezione di DNA, è possibile perforare la parete uterina ed entrare immediatamente nel terzo ventricolo.

Tenere la micropipetta di vetro con il DNA preparato in precedenza a 45 gradi rispetto alla parete uterina e perforarla all'estremità rostrale della fessura interemisferica, penetrando a circa un millimetro di profondità. In questo modo, la punta della micropipetta di vetro entrerà nel terzo ventricolo del cervello e non nel ventricolo laterale. Dopo aver iniettato circa un microlitro di soluzione di DNA nel terzo ventricolo, il fluido verde riempirà il ventricolo in una buona iniezione, ripeterà la stessa procedura con tutti gli embrioni dello stesso corno uterino.

Ciò consentirà alla soluzione di DNA di mescolarsi uniformemente con il fluido ventricolare e raggiungere l'intero neuroepitelio. Ora accendi l'elettro e regola le impostazioni in base all'età embrionale. Utilizzare l'elettrodo ad ago in acciaio inossidabile come polo positivo e l'elettrodo piatto rotondo come polo negativo, selezionare gli embrioni con il lato dorsale rivolto verso l'alto per l'elettroporazione.

Quindi perforare la parete uterina vicino alla testa dell'embrione tra il sacco amniotico e la placenta spingendo la punta dell'elettrodo dell'ago verso il basso attraverso di essa. Quindi usa l'indice dell'altra mano come blocco di spinta. Circa cinque millimetri della punta dell'elettrodo dovrebbero essere tra il sacco amniotico e la parete uterina all'incirca a livello del mesencefalo.

Poiché questo è l'elettrodo di puntamento, la sua posizione determinerà quale parte del neuroepitelio ipotalamico ha maggiori probabilità di essere trasfetta. Quindi, posiziona l'elettrodo piatto rotondo all'esterno della parete dell'utero sul lato opposto della testa dell'embrione con l'altra mano. Quindi schiacciare delicatamente l'embrione tra gli elettrodi.

Utilizzare l'interruttore a pedale per applicare voltage. Dopodiché, estrarre lentamente l'elettrodo dell'ago dall'utero tenendo indietro l'utero con l'indice dell'altra mano. Se il liquido amniotico viene perso attraverso la parete perforata, di solito l'embrione subisce l'aborto.

Dopo l'iniezione e l'elettroporazione di tutti gli embrioni, riposizionare l'utero nell'addome del topo con molta attenzione e posizionarli esattamente come prima. Quindi inumidire la cavità peritoneale con soluzione fisiologica prima di chiuderla. Sutura il peritoneo con l'intestino chirurgico del gatto, quindi sutura la pelle con una sutura più resistente.

Disinfettare la superficie dell'addome con una soluzione di iodio e iniettare un antinfiammatorio non steroideo per via sottocutanea per alleviare il dolore. Quindi, rimuovi la madre dalla macchina per l'anestesia e mettila in una gabbia, riscaldata da un termoforo. Monitorare il topo fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia e controllarlo quotidianamente per assicurarsi che si stia riprendendo dalla procedura senza alcun segno di infezione o dolore.

In questa fase, prelevare gli embrioni o i postnatali in base al giorno di analisi desiderato. Seleziona gli embrioni a cui è stato iniettato il DNA ed elettroporati e seziona il cervello sotto questo stereomicroscopio. Quindi verificare la presenza di segnale fluorescente verde nella regione appropriata.

Per analizzare il cervello dell'embrione selezionato, fissare il tessuto per un breve periodo in paraldeide al 4%. Quindi, incorporalo in aros 4% o in albumina di gelatina. Quindi sezionare il cervello sul vibrato.

Queste figure mostrano l'ipotalamo dopo la trasfezione in utero del DNA plasmatico, che trasporta geni reporter fluorescenti, GFP o CFP a E 12,5. Questa è una sezione sagittale che mostra un ipotalamo trasfettato da rostrale a coccolare, e qui c'è la sezione trasversale con le cellule marcate a diversi livelli lungo l'asse laterale del mezzo. Questa sezione sagittale mostra un corpo mammillare specificamente trasfettato e l'etichettatura del suo caratteristico albero assonale, e sul lato della parata elettronica di questa sezione trasversale mostra una banda etichettata corrispondente ai neuroni nati su E 12.5.

Per analizzare le sezioni più da vicino. Sono state preparate le sezioni orizzontali parallele al piano dei processi gliali radiali emanati dall'incavo mammillare. I neuroni ambi O nati dal neuroepitelio trasfettato il giorno E 12.5 sono stati identificati il giorno E 18.5 per mezzo di anticorpi contro la GFP.

In questo esempio, l'anticorpo ha marcato un gruppo ristretto di cellule MBO. Questo gruppo era localizzato tra due aree MBO laterali e mediali non marcate corrispondenti ai neuroni MBO, nati prima e dopo E 12.5, e la colorazione co con un anticorpo contro il nidone. In rosso mostra la modalità di migrazione dei neuroni marcati individualmente sui processi gliali radiali dell'epitelio neuro Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come iniettare il DNA nel terzo ventricolo e di come posizionare l'ago come elettrodo positivo tra l'embrione, la testa e la placenta per colpire in modo efficiente l'ipotalamo. Seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'immunoistochimica o l'ibridazione inide, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande sul fenotipo dei neuroni trasfettati.