Micromanipolazione di espressione genica in Zebrafish adulti cervello con microiniezione Cerebroventricular di Morpholino oligonucleotidi
May 23rd, 2013
In questo articolo, abbiamo dimostrato un metodo per la manipolazione dell'espressione genica nelle cellule ventricolari del telencefalo zebrafish adulto utilizzando oligonucleotidi antisenso morpholino. Presentiamo questo metodo come protocollo efficiente e rapido che può essere utilizzato per studi funzionali nel cervello dei vertebrati adulto.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di microiniettare oligonucleotidi morph nel ventricolo cerebrale del cervello adulto di zebrafish e di abbattere l'attività dei geni nelle cellule radiogliali. Ciò si ottiene anestetizzando prima il pesce zebra. Successivamente, viene generata una fessura nel cranio, sovrapponendo il tum ottico utilizzando un ago per ammaccature spinato.
Quindi la soluzione morpho viene iniettata attraverso il sito di incisione nel liquido ventricolare cerebrale. Infine, l'efficienza e l'accuratezza dell'iniezione vengono verificate al microscopio a fluorescenza. In definitiva, si può ottenere un blocco troppo efficiente e diffuso della produzione di proteine dai geni di interesse nelle cellule gliali radiali del cervello adulto di zebrafish attraverso il knockdown genico morfo-mediato, che può essere analizzato mediante sezioni istologiche e colorazioni immunoistochimiche.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come gli approcci transgenici o i metodi di somministrazione basati su elettrooperazioni, è che la CVMI richiede meno tempo, è più efficiente nel mirare all'intera popolazione di cellule radiogliali. Quelli regolabili e molti geni possono essere abbattuti allo stesso tempo. Per preparare la miscela per iniezione, iniziare preparando una soluzione madre di Morpho 500 micromolari.
Utilizzando PBS per 10 iniezioni, preparare 10 microlitri di miscela per iniezione combinando nove microlitri di soluzione morpho diluita o non diluita con un microlitro di un colorante tracciante fluorescente. Conservalo a temperatura ambiente. Utilizzare un estrattore per aghi per preparare i capillari di iniezione in vetro secondo i seguenti parametri.
Accendere la fonte di pressione e regolare le impostazioni di pressione su 50 PSI o 3.5 bar. Regolare le impostazioni del microiniettore come segue. Pressione di mantenimento, pressione di espulsione 20 PSI, 10 PSI, valore del periodo: 2,5 e 100 millisecondi.
Gamma di gating. Accendere l'illuminatore anulare e posizionare l'anello sopra il tavolino del microscopio. Posizionare il supporto capillare in una posizione appropriata accanto al microscopio.
Inserire il capillare di vetro nel supporto e regolare l'angolo di iniezione a 45 gradi. Utilizzando la pinza terminale di ricerca, staccare la punta del capillare di vetro e calibrare la pressione in uscita dall'orifizio. Immergendo la punta dell'ago nell'acqua del pesce e applicando un impulso di pressione continuo, le bolle d'aria dovrebbero formare un'unica fila che indica la pressione ottimale o la dimensione dell'orifizio.
Caricare il capillare di vetro con la soluzione iniettabile. Evitando bolle d'aria, applicare una pressione per rimuovere l'aria tra la punta del capillare di vetro e la soluzione di iniezione caricata. Dopo aver preparato una soluzione di gambo allo 0,1% dell'anestetico meab, trasferire il numero desiderato di pesci in un contenitore di trasporto con acqua di pesce.
Preparare una soluzione di lavoro di anestetico mescolando 200 millilitri di acqua di pesce con cinque millilitri di soluzione madre MISP. Riempi a metà una capsula di Petri con l'anestetico da utilizzare per le iniezioni. Incubare un pesce nell'anestetico fino a quando non smette di muoversi.
Quindi utilizzare una rete per trasferirlo nella capsula di Petri dell'anestetico. Per facilitare l'incisione, utilizzare la pinza per tenere delicatamente il pesce e orientarlo con la testa leggermente inclinata verso il basso. Usando la punta di un ago spinato calibro 30, fai una piccola fessura sul cranio senza penetrare troppo in profondità poiché ciò causerà danni al tessuto cerebrale.
Continuando a tenere il pesce, inserire la punta del capillare di vetro attraverso il sito di incisione di circa mezzo millimetro e, evitando il contatto con il tessuto cerebrale, orientarlo verso il cefalone. Iniettare la soluzione, dovrebbe disperdersi immediatamente. Trasferite il pesce in acqua fresca e lasciatelo recuperare.
Circa 30 minuti dopo, anestetizzare nuovamente il pesce e controllarlo al microscopio a fluorescenza per verificare la distribuzione diffusa del liquido. Basato sulla fluorescenza rossa. Rimetti il pesce nella sua vasca e rimettilo in circolo.
Fino all'uso per analisi comportamentali o per la preparazione di campioni di tessuto come si vede qui, un'iniezione accurata porta alla dispersione della soluzione iniettata in tutto il cervello e a un targeting efficiente delle cellule vicino alla superficie ventricolare. Tuttavia, le iniezioni in cui il capillare di vetro si impala nel tessuto cerebrale avranno un segnale fluorescente denso nel punto di iniezione. E se la quantità iniettata non è sufficiente, si osserverà un debole segnale fluorescente.
Questa figura dimostra che vivo morphos può penetrare alcuni diametri cellulari all'interno della superficie ventricolare, e quindi può colpire in modo efficiente le cellule ventricolari rispetto al controllo. Morfo. L'iniezione di morpho contro PCNA abbatte efficacemente l'espressione genica nelle cellule ventricolari. In queste immagini di immunofluorescenza, l'immunocolorazione BRDU e QCD dopo l'esperimento di inseguimento dell'impulso A-B-R-D-U dimostra che il knockdown di PCNA con morfosi antisenso porta a una significativa riduzione dei neuroni neonati, suggerendo che CVMI può essere utilizzato per abbattere geni endogeni che successivamente danno origine a conseguenze funzionali.
Quindi, dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare i meccanismi molecolari coinvolti nella risposta di neurogenesi rigeneratrice del cervello adulto di pesce.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per manipolare l'espressione genica nelle cellule ventricolari del telencefalo di pesci zebra adulti utilizzando oligonucleotidi morpholino antisenso. Il protocollo è efficiente e veloce, rendendolo adatto per studi funzionali nel cervello di vertebrati adulti.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Espressione genica
- Biologia dello sviluppo
Contesto
- Le tecniche di manipolazione genica sono cruciali per comprendere la funzione cerebrale.
- Gli oligonucleotidi morpholino antisenso possono efficacemente ridurre l'espressione genica.
- I pesci zebra sono un modello prezioso per studiare la neurogenesi dei vertebrati.
- I metodi esistenti possono essere lunghi e meno efficienti.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo rapido ed efficiente per il knockdown genico nei pesci zebra.
- Facilitare gli studi funzionali dei ruoli genici nel cervello adulto.
- Migliorare le tecniche di manipolazione genica esistenti.
Metodi utilizzati
- Microiniezione di oligonucleotidi morpholino nel ventricolo cerebrale.
- Anestesia dei pesci zebra prima dell'iniezione.
- Utilizzo di un microscopio a fluorescenza per valutare l'efficacia dell'iniezione.
- Analisi istologiche e immunoistochimiche per valutare gli effetti del knockdown genico.
Risultati principali
- Mirate efficaci sulle cellule gliali radiali nel cervello dei pesci zebra.
- Il knockdown riuscito dell'espressione genica porta a conseguenze funzionali osservabili.
- La tecnica permette il targeting simultaneo di molteplici geni.
- I risultati dimostrano il potenziale per studiare i meccanismi di neurogenesi.
Conclusioni
- Questo metodo migliora la capacità di studiare la funzione genica nei pesci zebra adulti.
- Fornisce uno strumento prezioso per la ricerca in neuroscienza.
- Gli studi futuri possono sfruttare questa tecnica per esplorare la rigenerazione e la neurogenesi.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Cerebroventricular microinjection (CVMI) of morpholino oligonucleotides enables rapid, widespread gene knockdown in adult zebrafish radial glial cells, supporting functional studies of neurogenesis mechanisms. This approach provides a scalable, reproducible method for target validation in vertebrate brain models, reducing reliance on transgenic systems. The technique accelerates hypothesis testing in discovery neuroscience by delivering efficient, pan-ventricular transduction with quantifiable phenotypic readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in adult ventricular progenitor cells to clarify mechanistic roles in neurogenesis pathways.
- Operational Value: Facilitates rapid, multiplexed knockdown of multiple genes simultaneously, increasing throughput for target de-risking.
- Predictive Value: Generates functional consequences (e.g., reduced newborn neurons) that link target modulation to phenotypic outcomes, supporting go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, fluorescently tracked injection solutions for consistent delivery and visualization of ventricular distribution.
- Quantitative Output: Enables histological and immunohistochemical assessment of knockdown efficiency and downstream effects on cell proliferation markers.
- Scalability: Uses adjustable pressure parameters and calibrated capillaries to ensure reproducible injection volumes across experiments.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models adult vertebrate neurogenesis regulation, offering insight into conserved mechanisms relevant to human CNS repair and neurodegenerative disorders.
- Translational Continuity: Connects acute gene knockdown in progenitor cells to functional neurogenic responses, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Allows dissection of gene-specific contributions to regeneration phenotypes, reducing ambiguity in target pathway interpretation.
Pipeline & Workflow Integration
CVMI fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to functional validation, enabling rapid iteration between gene modulation and phenotypic assessment in zebrafish models.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation by knocking down genes in radial glial cells to observe effects on neurogenesis.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with widespread ventricular distribution for reliable compound or genetic perturbation evaluation.
- Analytics: Generates quantitative histological and immunohistochemical readouts (e.g., PCNA, BRDU, QC) to measure knockdown efficiency and functional consequences.
- Translational Research: Links ventricular target modulation to neurogenic output, providing a disease-relevant system for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for rapid gene interrogation across multiple targets, reducing time and cost compared to transgenic line generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target function by linking ventricular gene knockdown to measurable neurogenic phenotypes.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized anesthetic preparation, pressure calibration, and fluorescent tracking controls.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by enabling early, efficient target de-risking in a physiologically relevant adult vertebrate brain model.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on functional consequences observed in widespread ventricular knockdown models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microsurgery, and microinjection techniques.
- Depends on pressure-regulated microinjectors, fluorescent microscopy, and histological staining infrastructure.
- Necessitates standardization of injection volume, tracking dye use, and post-injection recovery protocols across teams.
- Must account for variability in ventricular access and diffusion efficiency when translating across different zebrafish strains or ages.
- Limited to acute gene knockdown; not suitable for chronic or conditional modulation studies without repeated injections.
