Micromanipolazione di espressione genica in Zebrafish adulti cervello con microiniezione Cerebroventricular di Morpholino oligonucleotidi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di microiniettare oligonucleotidi morph nel ventricolo cerebrale del cervello adulto di zebrafish e di abbattere l'attività dei geni nelle cellule radiogliali. Ciò si ottiene anestetizzando prima il pesce zebra. Successivamente, viene generata una fessura nel cranio, sovrapponendo il tum ottico utilizzando un ago per ammaccature spinato.

Quindi la soluzione morpho viene iniettata attraverso il sito di incisione nel liquido ventricolare cerebrale. Infine, l'efficienza e l'accuratezza dell'iniezione vengono verificate al microscopio a fluorescenza. In definitiva, si può ottenere un blocco troppo efficiente e diffuso della produzione di proteine dai geni di interesse nelle cellule gliali radiali del cervello adulto di zebrafish attraverso il knockdown genico morfo-mediato, che può essere analizzato mediante sezioni istologiche e colorazioni immunoistochimiche.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come gli approcci transgenici o i metodi di somministrazione basati su elettrooperazioni, è che la CVMI richiede meno tempo, è più efficiente nel mirare all'intera popolazione di cellule radiogliali. Quelli regolabili e molti geni possono essere abbattuti allo stesso tempo. Per preparare la miscela per iniezione, iniziare preparando una soluzione madre di Morpho 500 micromolari.

Utilizzando PBS per 10 iniezioni, preparare 10 microlitri di miscela per iniezione combinando nove microlitri di soluzione morpho diluita o non diluita con un microlitro di un colorante tracciante fluorescente. Conservalo a temperatura ambiente. Utilizzare un estrattore per aghi per preparare i capillari di iniezione in vetro secondo i seguenti parametri.

Accendere la fonte di pressione e regolare le impostazioni di pressione su 50 PSI o 3.5 bar. Regolare le impostazioni del microiniettore come segue. Pressione di mantenimento, pressione di espulsione 20 PSI, 10 PSI, valore del periodo: 2,5 e 100 millisecondi.

Gamma di gating. Accendere l'illuminatore anulare e posizionare l'anello sopra il tavolino del microscopio. Posizionare il supporto capillare in una posizione appropriata accanto al microscopio.

Inserire il capillare di vetro nel supporto e regolare l'angolo di iniezione a 45 gradi. Utilizzando la pinza terminale di ricerca, staccare la punta del capillare di vetro e calibrare la pressione in uscita dall'orifizio. Immergendo la punta dell'ago nell'acqua del pesce e applicando un impulso di pressione continuo, le bolle d'aria dovrebbero formare un'unica fila che indica la pressione ottimale o la dimensione dell'orifizio.

Caricare il capillare di vetro con la soluzione iniettabile. Evitando bolle d'aria, applicare una pressione per rimuovere l'aria tra la punta del capillare di vetro e la soluzione di iniezione caricata. Dopo aver preparato una soluzione di gambo allo 0,1% dell'anestetico meab, trasferire il numero desiderato di pesci in un contenitore di trasporto con acqua di pesce.

Preparare una soluzione di lavoro di anestetico mescolando 200 millilitri di acqua di pesce con cinque millilitri di soluzione madre MISP. Riempi a metà una capsula di Petri con l'anestetico da utilizzare per le iniezioni. Incubare un pesce nell'anestetico fino a quando non smette di muoversi.

Quindi utilizzare una rete per trasferirlo nella capsula di Petri dell'anestetico. Per facilitare l'incisione, utilizzare la pinza per tenere delicatamente il pesce e orientarlo con la testa leggermente inclinata verso il basso. Usando la punta di un ago spinato calibro 30, fai una piccola fessura sul cranio senza penetrare troppo in profondità poiché ciò causerà danni al tessuto cerebrale.

Continuando a tenere il pesce, inserire la punta del capillare di vetro attraverso il sito di incisione di circa mezzo millimetro e, evitando il contatto con il tessuto cerebrale, orientarlo verso il cefalone. Iniettare la soluzione, dovrebbe disperdersi immediatamente. Trasferite il pesce in acqua fresca e lasciatelo recuperare.

Circa 30 minuti dopo, anestetizzare nuovamente il pesce e controllarlo al microscopio a fluorescenza per verificare la distribuzione diffusa del liquido. Basato sulla fluorescenza rossa. Rimetti il pesce nella sua vasca e rimettilo in circolo.

Fino all'uso per analisi comportamentali o per la preparazione di campioni di tessuto come si vede qui, un'iniezione accurata porta alla dispersione della soluzione iniettata in tutto il cervello e a un targeting efficiente delle cellule vicino alla superficie ventricolare. Tuttavia, le iniezioni in cui il capillare di vetro si impala nel tessuto cerebrale avranno un segnale fluorescente denso nel punto di iniezione. E se la quantità iniettata non è sufficiente, si osserverà un debole segnale fluorescente.

Questa figura dimostra che vivo morphos può penetrare alcuni diametri cellulari all'interno della superficie ventricolare, e quindi può colpire in modo efficiente le cellule ventricolari rispetto al controllo. Morfo. L'iniezione di morpho contro PCNA abbatte efficacemente l'espressione genica nelle cellule ventricolari. In queste immagini di immunofluorescenza, l'immunocolorazione BRDU e QCD dopo l'esperimento di inseguimento dell'impulso A-B-R-D-U dimostra che il knockdown di PCNA con morfosi antisenso porta a una significativa riduzione dei neuroni neonati, suggerendo che CVMI può essere utilizzato per abbattere geni endogeni che successivamente danno origine a conseguenze funzionali.

Quindi, dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare i meccanismi molecolari coinvolti nella risposta di neurogenesi rigeneratrice del cervello adulto di pesce.