Analisi immunoistochimica nel Sistema Nervoso Centrale e Periferico Rat linfa nodo del tessuto Sezioni

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di mirare a una proteina specifica nel tessuto del ratto. Ciò si ottiene isolando, fissando e incorporando il tessuto con paraffina, quindi sezionando il tessuto e montandolo su vetrini. Il secondo passo consiste nel deparaffinare e reidratare le sezioni di tessuto incluse in paraffina, quindi bloccare la perossidasi endogena.

Successivamente, gli epitopi vengono scoperti mediante il recupero dell'antigene. Successivamente, viene eseguito il blocco per ridurre il legame aspecifico prima di introdurre gli anticorpi. Il passaggio finale consiste nel rilevare l'epitopo specifico mediante immunomarcatura con anticorpi primari e secondari e nello sviluppare il segnale dall'anticorpo secondario marcato.

Infine, il segnale viene visualizzato utilizzando la microscopia ottica per mostrare il modello di localizzazione delle proteine nelle sezioni di tessuto. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla localizzazione delle proteine e sui modelli di espressione nel sistema nervoso centrale del ratto e nei linfonodi periferici, può essere applicato anche ad altri organi e specie. Per dimostrare la procedura sarà un tecnico.

Il suo nome è Katalin Benedek, della struttura principale del centro di microbiologia, tumori e biologia cellulare presso il Karolinska Institutet. Per iniziare la preparazione del tessuto, immergere il cervello sezionato, il midollo spinale e il tessuto linfonodale periferico nel quattro percento di paraformaldeide e posizionarlo a quattro gradi Celsius per 24 ore. Dopo che i tessuti sono stati fissati, trasferire il tessuto in PBS e conservarlo a quattro gradi Celsius fino a un'ulteriore elaborazione.

Per iniziare a lavorare il tessuto, utilizzare una lama di rasoio per tagliare il tessuto in porzioni di circa cinque millimetri. Quindi, avviare il processo di indurimento dei tessuti con un processore di infiltrazione sotto vuoto. La procedura standard si basa sull'immersione in concentrazioni crescenti di etanolo, seguita da xilolo e infine paraffina.

Quindi, metti il fazzoletto in uno stampo. Versare la paraffina liquida intorno al campione per formare un blocco di paraffina e conservarlo a temperatura ambiente. Prima di sezionare il fazzoletto, raffreddare il blocco di paraffina per una notte sulla piastra fredda o in frigorifero.

Dopo che il blocco di paraffina si è raffreddato, posizionare il blocco nel supporto fisso di un microtomo a slitta che può muoversi avanti e indietro attraverso un coltello. Quindi, regolare il blocco e il coltello del microtomo all'angolazione ottimale, che dipende dalla geometria del coltello e dalla velocità e tecnica di taglio. Tagliare tre sezioni trasversali spesse cinque micron dal blocco di paraffina.

Quindi, trasferire le sezioni tagliate in un contenitore per l'acqua e montare le sezioni dall'acqua su un vetrino adesivo prerivestito in commercio. Quindi, premere con cautela la sezione montata contro un tovagliolo di carta per rimuovere l'acqua residua e le potenziali bolle d'aria. Asciugare le guide montate per un paio d'ore in una stufa impostata a 50-60 gradi Celsius.

Una volta che i vetrini sono asciutti, immergerli due volte nello xilolo per 15-20 minuti ciascuno. Quindi, sciacquare ogni vetrino con etanolo al 99%. Per bloccare l'attività endogena della perossidasi, incubare le sezioni per 30 minuti in una soluzione di metanolo contenente lo 0,25% di perossido di idrogeno.

Quindi, continuare a reidratare le sezioni di tessuto risciacquando con soluzioni di etanolo contenenti un contenuto d'acqua crescente. Eseguire l'ultima fase di reidratazione in acqua distillata. Assicurarsi di mantenere le sezioni umide fino a quando i vetrini coprioggetti non sono montati.

Per recuperare l'antigene, riscaldare i vetrini con un piroscafo per uso domestico e un tampone EDTA a pH 8,5 per 60 minuti. Quindi, raffreddare i vetrini a temperatura ambiente per circa un'ora. Una volta che i vetrini si sono raffreddati, sciacquare ogni vetrino da tre a cinque volte in soluzione salina tamponata con Tris, o TBS.

Successivamente, incubare le sezioni di tessuto a temperatura ambiente per 30 minuti in una soluzione bloccante contenente il 10% di siero fetale di vitello e il 90% di tampone di lavaggio per bloccare eventuali reazioni di fondo non specifiche. Dopo che le sezioni di tessuto sono state bloccate, diluire la quantità richiesta di anticorpi primari nella soluzione bloccante e incubare i vetrini in questa soluzione di anticorpi primari durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, sciacquare i vetrini da tre a cinque volte con il tampone T-B-S.

Quindi incubare i vetrini con anticorpi secondari diluiti nella soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, risciacquare nuovamente i vetrini da tre a cinque volte con il tampone T-B-S. Quindi, incubare i vetrini con il complesso avidin rafano perossidasi, diluito da uno a 100 nella soluzione bloccante, per un'ora a temperatura ambiente.

Una volta completata l'incubazione di un'ora, sciacquare i vetrini da tre a cinque volte con tampone T-B-S. Dopo aver preparato la soluzione blu veloce come descritto nel protocollo di testo, agitare leggermente la pirofila e filtrare il composto ottenuto. Versare la soluzione sui vetrini della cuvetta di vetro.

Inizia l'incubazione a 37 gradi Celsius e osserva il processo di sviluppo al microscopio ottico ogni 15-30 minuti. Una volta completata l'incubazione, sciacquare i vetrini da tre a cinque volte con il tampone T-B-S, quindi trasferire successivamente i vetrini nel tampone P-B-S. Per realizzare la soluzione di sviluppo del perossido di idrogeno D-A-B, diluire prima un millilitro di una soluzione madre D-A-B in 49 millilitri di P-B-S.

Aggiungere 16,5 microlitri di perossido di idrogeno, quindi filtrare la soluzione. Versare la soluzione sui vetrini e assicurarsi di controllare il processo di sviluppo al microscopio ottico per evitare un fondo elevato che può mascherare il segnale specifico. Quindi, sciacquare i vetrini da tre a cinque volte con PBS, seguito da un lavaggio finale con acqua distillata o acqua di rubinetto.

Montare gli scivoli con vetrini coprioggetti direttamente dall'acqua, utilizzando un mezzo di montaggio acquoso. Evitare la formazione di bolle d'aria tra il vetrino coprioggetto e il vetrino. Dopo aver montato le sezioni, incubare i vetrini per una notte a quattro gradi Celsius per consentire al mezzo di montaggio di asciugarsi completamente.

Conservare i vetrini asciutti a temperatura ambiente. La doppia colorazione di sezioni di tessuto linfonodale periferico isolate da ratti il settimo giorno dopo l'immunizzazione ha rivelato che i linfociti T CD8 positivi non secernevano la chemochina C-C-L 11. In alternativa, si è scoperto che C-C-L 11 co-localizza con E-D one, un marcatore per la proteina lisosomiale nei macrofagi attivati.

La doppia colorazione I-H-C del midollo spinale di un ratto ha identificato la produzione di C-C-L undici nei pericaria neuronali, nei dendriti e negli assoni, ma non nei macrofagi I-B-A one positivi e nelle cellule microgliali residenti nel cervello. Inoltre, la maggior parte dei macrofagi E-D one positivi e delle cellule microgliali residenti nel cervello sono risultati non essere C-C-L 11 positivi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un targeting immunoistochimico specifico e affidabile della proteina direttamente in sezioni di tessuto.