Generazione di cardiomiociti umani: Un protocollo di differenziazione da alimentatore-Free umani cellule staminali pluripotenti indotte

L'obiettivo generale di questa procedura è differenziare cardiomiociti umani da cellule iPS umane coltivate in condizioni prive di feeder. Ciò viene ottenuto innanzitutto seminando le cellule iPS in piastre a adesione ultra ridotta per formare corpi embrionali. Il secondo passaggio della procedura consiste nel trasferire i corpi embrionali formati in piatti rivestiti con gelatina.

Quando compaiono le aree contrattili, vengono dissezionate manualmente al microscopio stereoscopico e seminate in piatti rivestiti con fibronectina. Per una ulteriore differenziazione, l'ultimo passaggio consiste nell'ottenere cardiomiociti singoli mediante digestione enzimatica di aggregati contrattili. In definitiva, i risultati possono dimostrare la differenziazione di cellule simili a cardiomiociti che esprimono marcatori strutturali tipici, ad esempio la troponina cardiaca, mediante microscopia a fluorescenza immunologica.

Questo metodo può contribuire a rispondere a una domanda fondamentale nel campo della biologia cardiovascolare, ad esempio: quali sono i meccanismi che guidano la differenziazione e la disfunzione cardiaca durante lo sviluppo cardiaco e le malattie a livello del cardiomiocita umano? Si tratta di una tecnica molto interessante perché consente la generazione in vitro di cardiomiociti a partire da pazienti umani e individui umani. Inoltre, in un secondo momento, permette la riproduzione della malattia in provetta, in modo da poter sperimentare nuovi farmaci in vitro prima di passare agli studi in vivo.

Avviare l'esperimento con colture cellulari IPS confluenti coltivate su piastre da 35 millimetri rivestite con matrigel. Sostituire il mezzo di crescita con un millilitro di PBS contenente un milligrammo di diss. Esaminare le cellule utilizzando pipette di vetro a punta arrotondata.

Rimuovere le regioni con cellule differenziate, come strutture crateriformi o cistiche al centro delle colonie. Rimuovere anche le aree in cui le cellule si sono separate, appiattite e sembrano migrare verso l'esterno. Incubare ora le cellule rimanenti a 37 gradi Celsius sotto una cappa da coltura fino a quando i bordi delle colonie diventano più luminosi e iniziano a staccarsi.

Questo richiede di solito tra cinque e sette minuti. A questo punto, rimuovere la soluzione dispa e lavare le cellule con un millilitro di HESM. Quindi scartare la soluzione di lavaggio.

In un nuovo millilitro di HESM, utilizzare un cell lifter per raccogliere le colonie. Raccogliere le colonie in un tubo da 15 millilitri. Successivamente, lavare le cellule con un altro millilitro di HESM e centrifugare a 1000 ×g per quattro minuti.

Quindi procedere con la semina delle cellule su matrigel e cambiare il mezzo ogni giorno durante la coltura. Iniziare prelevando le colonie IPS indifferenziate come descritto nella sezione precedente. Una volta isolate le popolazioni indifferenziate, sospenderle delicatamente in un millilitro di EBM 20.

Utilizzando una pipetta da due millilitri, non disperdere troppo gli aggregati cellulari. Limitare la pipettaggio a due o tre movimenti. Controllare le dimensioni delle colonie al microscopio stereoscopico tra un movimento e l'altro.

Quando le colonie hanno tutte dimensioni simili, non è necessario alcun ulteriore mescolamento. Piastrare ora le cellule su piastre a basso attaccamento, riempiendo una piastra a sei pozzetti per ogni piastra di cellule raccolte. Non dimenticare di risciacquare il tubo con un millilitro di EBM 20 e distribuire il risciacquo sulla piastra.

Dopo il terzo giorno di incubazione, sostituire il mezzo utilizzando un microscopio per evitare la rimozione dei corpi embrionali. Mantenere la pipetta vicino al bordo della piastra. Al settimo giorno, trasferire i corpi embrionali in piastre rivestite con Gelatina 0,1% riscaldata a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Aggiungere da 35 a 40 corpi embrionali in ciascuna piastra da 35 millimetri con due millilitri di mezzo. Durante la coltura, sostituire il mezzo due volte alla settimana regolarmente.

Controllare i corpi embrionali alla ricerca di aree pulsanti e segnare la posizione in cui si trovano tali aree. Sulla superficie del coperchio della piastra, le aree contrattili dovrebbero apparire dopo circa 10-20 giorni. Quando compaiono aree con contrazione spontanea, sostituire il mezzo con EBM due. Dopo l'apparizione delle aree contrattili, continuare la coltura e il monitoraggio delle altre aree della piastra per un periodo fino a un mese.

In totale. In EBM due carenze del processo di differenziazione dipendono fortemente da diversi fattori, tra cui i più critici sono le linee cellulari specifiche e il lotto di siero utilizzato per indurre la differenziazione cardiaca. Per ottenere la massima efficienza, testare diverse linee per il potenziale cardiogenico e vari lotti di siero. Iniziare rivestendo 12.

Piastre a pozzetti con cinque microgrammi per centimetro quadrato di fibronectina in PBS, 300 microlitri per pozzetto, devono coprire completamente la superficie di ogni pozzetto. Lasciare le piastre asciugare scoperte in un'appaio di coltura cellulare. Per rimuovere l'area di aggregazione della coltura cellulare, utilizzare una pipetta di vetro tirata e un bisturi.

Quindi, utilizzando una pipetta da un millilitro, trasferire da quattro a cinque clamp in ciascun pozzetto di una piastra rivestita con fibronectina. Una volta completate tutte le raccolte, aggiungere un millilitro di EBM due nei pozzetti caricati sulla piastra di raccolta e segnare le aree da cui sono state rimosse le cellule. Successivamente, sostituire il mezzo e reinserire la piastra nell'incubatore.

Se sono richiesti piccoli aggregati pulsanti sotto un microscopio stereoscopico, far passare le aree espiantate attraverso una pipetta. Questo produce piccoli cluster contenenti alcune cellule pulsanti. In coltura.

Cambiare il mezzo due volte alla settimana fino a quando i campioni sono pronti per l'analisi. Preparare innanzitutto delle camere a due scomparti quadrate di quattro centimetri, rivestendole con 20 microgrammi di fibronectina diluiti in una quantità sufficiente di PBS per coprire la superficie. Se si utilizza un supporto in vetro, aggiungere ulteriori 20 microgrammi di laminina.

Iзолare l'area della coltura su microsfera come precedentemente descritto. Utilizzando una pipetta da un millilitro, trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri contenente 500 microlitri di collaghenasi. Incubare le cellule per 15 minuti e agitare il tubo una volta durante l'incubazione.

Dopo 15 minuti, passare le cellule attraverso una pipetta da 200 microlitri per rimuovere eventuali grumi, se ancora presenti. Trasferire le cellule in collaghenasi due e ripetere l'incubazione quando non rimangono grumi di grandi dimensioni. Terminare la digestione aggiungendo tre millilitri di EBM due senza acido ascorbico, come preparati separatamente.

Conservare le provette in un portaprovette riscaldato sotto cappa, quindi centrifugarle a 1000 × g per quattro minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, preparare una sospensione delle frazioni cellulari provenienti dallo stesso campione iniziale in un millilitro di tripsina EDTA al 0,25% in PBS. Successivamente, incubare la sospensione per cinque minuti nel blocco riscaldato e inattivare la tripsina con quattro millilitri di EBM2 senza acido ascorbico.

Successivamente, passare le cellule attraverso un ago da 18 gauge collegato a una siringa da 2,5 millilitri fino a sette volte, fino a quando non si osservano più grossi aggregati al microscopio. Quindi, centrifugare le cellule a 1000 ×g per quattro minuti. Ora risospendere il pellet cellulare in E BM due e seminare su vetrini a due pozzetti.

Le cellule saranno pronte per le analisi dopo due o tre giorni di incubazione. I CMS sono stati generati da diverse linee cellulari IPS. Queste linee sono state inizialmente generate su uno strato di cellule nutritizie di metilcellulosa e successivamente trasferite immediatamente su matrigel utilizzando un mezzo definito.

Le cellule mostravano una morfologia simile a quella delle cellule staminali embrionali umane, con margini luminosi in fase e nuclei prominenti. L'analisi mediante immunofluorescenza ha mostrato che le cellule IPS esprimevano correttamente il fattore di trascrizione T four e l'antigene di superficie TRA one 60. L'analisi citofluorimetrica ha confermato l'espressione di tipici antigeni di superficie di pluripotenza, SS EEA four e TRA one 60.

La strategia di gating è mostrata nel grafico a dispersione a sinistra. È stata inoltre eseguita un'analisi cariotipica delle cellule IP FS coltivate su gel di matrice. L'induzione nella linea cardiaca è stata indotta dall'aggregazione delle cellule IPS in ebs, insieme alla coltura in presenza di un tipo specifico di siero.

E poiché le aree con contrazioni da acido sorbico rappresentavano dal 20 al 35% dell'intera coltura, a seconda della linea cellulare utilizzata, i CMS contrattili sono stati isolati da queste regioni mediante digestione enzimatica e analizzati per l'espressione proteica. La RT-PCR ha rilevato l'espressione di canali ionici specifici del tessuto cardiaco nelle cellule battenti derivate da IPS, ma non nelle cellule non battenti.

Questi canali includevano un alfa uno, una subunità di un canale del calcio dipendente dal voltaggio, una subunità alfa di un canale del sodio voltaggio-dipendente di tipo cinque, un canale del potassio voltaggio-dipendente della sottofamiglia KQT, simile, e entrambe le forme della miosina. L'analisi mediante immunofluorescenza della catena pesante ha rivelato che singoli cardiomiociti derivati da IPS esprimevano le proteine strutturali, actina alfa sarcomerica, troponina I cardiaca e la giunzione specifica cardiaca, connexina 43. In definitiva, questa tecnica ha effettivamente aperto la strada alla modellizzazione delle malattie miocardiche in vitro e consente la sperimentazione di farmaci in un contesto umano senza iniettare i farmaci nei corpi umani.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come mantenere le cellule iPS in condizioni libere da sierio e di come differenziarle in cardiomiociti attraverso un metodo basato sull'aggregazione di corpi embrionali.