Generazione di cardiomiociti umani: Un protocollo di differenziazione da alimentatore-Free umani cellule staminali pluripotenti indotte

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di differenziare i cardiomiociti umani dalle cellule IPS umane coltivate in condizioni di feeder free. Ciò si ottiene placcando prima le cellule IPS in piastre di attacco ultra basse per formare corpi embrionali. La seconda fase della procedura consiste nel trasferire i corpi embrionali formati in piatti rivestiti di gelatina.

Quando compaiono aree di contrazione, queste vengono sezionate manualmente al microscopio stereoscopico e piastrate su piastre rivestite di fibronectina. Per un'ulteriore differenziazione, il passaggio finale consiste nell'ottenere singoli cardiomiociti mediante digestione enzimatica dei cluster contratti. In definitiva, i risultati possono mostrare la differenziazione di cellule simili a cardiomiociti che esprimono marcatori strutturali tipici, cioè la troponina cardiaca attraverso la microscopia a immunofluorescenza.

Questo metodo può aiutare a rispondere a una domanda chiave nel campo della biologia cardiovascolare, come ad esempio, quali sono i meccanismi che guidano la differenziazione e la disfunzione cardio durante lo sviluppo cardiovascolare e le malattie a livello del cardiomiocita umano. Questa è una tecnica molto interessante perché permette la generazione di cardiomiociti in vitro da pazienti umani e individui umani. E in secondo luogo, consente la ricapitolazione della malattia in provetta in modo che i nuovi farmaci possano essere sperimentati in vitro prima di andare in vivo.

Sperimentazione: Iniziate con colture cellulari IPS confluenti coltivate su piastre rivestite di matrigel da 35 millimetri. Sostituire il terreno di coltura con un millilitro di PBS contenente un milligrammo di diss. Esaminare le cellule utilizzando pipette di vetro polled.

Rimuovere le regioni con cellule differenziate come crateri o strutture cistiche al centro delle colonie. Rimuovi anche tutte le aree in cui le cellule si sono separate, appiattite e sembrano migrare verso l'esterno. Ora incuba le cellule rimanenti a 37 gradi Celsius sotto una cappa di coltura fino a quando i bordi della colonia diventano più luminosi e iniziano a staccarsi.

Questo di solito richiede tra i cinque e i sette minuti. A questo punto, rimuovere la soluzione di dispa e lavare le celle con un millilitro di HESM. Quindi scartare la soluzione di lavaggio.

In un millilitro fresco di HESM, usa un sollevatore di cellule per raccogliere le colonie. Raccogli le colonie in una provetta da 15 millilitri. Quindi, sciacquare le celle con un altro millilitro di HESM e centrifugarle a 1000 volte G per quattro minuti.

Quindi procedere con la placcatura delle cellule su matrigel e cambiare il terreno ogni giorno durante la coltura. Inizia raccogliendo colonie di IPS indifferenziate come descritto nella sezione precedente. Una volta isolate le popolazioni indifferenziate, sospenderle delicatamente in un millilitro di EBM 20.

Usando una pipetta da due millilitri, non rompere troppo i grumi cellulari. Limitare il pipettaggio a due o tre corse. Controlla le dimensioni delle colonie sotto lo stereoscopio tra un colpo e l'altro.

Quando le colonie hanno tutte all'incirca le stesse dimensioni, non hanno bisogno di ulteriore mescolamento. Ora piastrate le cellule su piastre ad attacco ultra basso, riempiendo una piastra a sei pozzetti per ogni piastra di cellule raccolte. Non dimenticare di sciacquare il tubo con un millilitro di EBM 20 e distribuire il risciacquo sulla piastra.

Dopo il terzo giorno di incubazione, cambiare il terreno utilizzando un microscopio per evitare la rimozione dei corpi embrionali. Tenere la pipetta vicino al bordo della piastra. Il settimo giorno, spostare i corpi degli embrioni su piastre rivestite con gelatina allo 0,1% riscaldata a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Aggiungere da 35 a 40 corpi embrionali in ogni piatto da 35 millimetri in due millilitri di terreno. Durante la coltura. Cambia regolarmente il mezzo due volte a settimana.

Controllare i corpi degli embrioni per le aree di battitura e segnare dove si trovano le aree di perline. Sulla parte superiore del coperchio del piatto, le aree di contrazione delle perline dovrebbero apparire dopo circa 10-20 giorni. Quando compaiono aree con contrazione spontanea, passare al loro mezzo in EBM due Dopo la comparsa delle aree contraenti, continuare a coltivare e monitorare altre aree sulla piastra per un massimo di un mese.

In totale. Nell'EBM due La carenza del processo di differenziazione dipende fortemente da diversi fattori, i più critici dei quali sono le specifiche linee cellulari e il lotto di siero utilizzato per indurre la differenziazione cardio. Per ottenere la massima efficienza, testare diverse linee per il potenziale cardiogeno e vari lotti di siero Iniziare con il rivestimento 12.

Le piastre a pozzetti con cinque microgrammi per centimetro quadrato di fibronectina in PBS 300 microlitri per pozzetto dovrebbero coprire completamente la superficie di ciascun pozzetto. Lasciare asciugare le piastre scoperte in una cappa per colture cellulari. Per rimuovere l'area di perline della coltura cellulare, utilizzare una pipetta di vetro tirata e un bisturi.

Quindi, utilizzando una pipetta da un millilitro, trasferire da quattro a cinque pinze in ciascun pozzetto di una piastra rivestita di fibronectina. Una volta effettuate tutte le raccolte, aggiungere un millilitro di EBM due ai pozzetti caricati sulle aree di contrassegno della piastra di raccolta in cui sono state rimosse le cellule. Quindi cambiare il terreno e rimettere la piastra nella cappa di coltura.

Se sono necessari grumi di battitura più piccoli al microscopio stereoscopico, passare le aree espiantate attraverso una pipetta. Questo produce piccoli grappoli contenenti alcune cellule battenti. Nella cultura.

Cambia il mezzo due volte alla settimana fino a quando non sono pronti per l'analisi. Per prima cosa, preparare vetrini quadrati di quattro centimetri a due camere rivestendoli con 20 microgrammi di fibronectina diluita in abbastanza PBS da coprire la superficie. Se si utilizza un supporto in vetro, aggiungere altri 20 microgrammi di laminina.

Isolare l'area di coltura delle perline come descritto in precedenza. Utilizzando una pipetta da un millilitro, trasferire le cellule in una provetta da 15 millilitri contenente 500 microlitri di provetta di collagenasi. Incubare le cellule per 15 minuti e agitare la provetta una volta durante l'incubazione.

Dopo 15 minuti, spostare le cellule attraverso una pipetta da 200 microlitri per rimuovere i grumi se ne rimangono. Trasferire le cellule nella collagenasi 2 fresca e ripetere l'incubazione quando non sono rimasti grumi di grandi dimensioni. Termina la digestione aggiungendo tre millilitri di EBM, due senza acido soico come vengono preparati.

Conservare le provette in una griglia riscaldata sotto la cappa, quindi centrifugarle a 1000 volte G per quattro minuti a temperatura ambiente. Una volta centrifugata, effettuare una sospensione delle frazioni cellulari dello stesso campione iniziale in un millilitro di tripsina EDTA allo 0,25% in PBS. Quindi incubare la sospensione per cinque minuti nel blocco riscaldato, inattivare la tripsina con quattro millilitri di E BM due senza acido soico.

Successivamente, passare le cellule attraverso un ago calibro 18 su una siringa da 2,5 millilitri fino a sette volte fino a quando non sono visibili grossi grumi al microscopio. Quindi centrifugare le celle a 1000 volte G per quattro minuti. Ora risospendere il pellet della cella in E BM due e piastrirli su due vetrini della camera del pozzetto.

Le cellule saranno pronte per le analisi dopo due o tre giorni di incubazione. Le CMS sono state generate da diverse linee cellulari IPS. Queste linee sono state inizialmente generate su uno strato di alimentazione di metanfetamina e immediatamente posizionate su matrigel utilizzando un mezzo definito.

Le cellule mostravano una morfologia simile alle ESC umane con bordi luminosi di fase e nuclei prominenti. L'analisi in immunofluorescenza ha mostrato che le cellule IPS esprimevano correttamente il fattore di trascrizione T 4 ed esprimevano l'antigene di superficie TRA one 60. L'analisi citofluorimetrica ha confermato l'espressione dei tipici antigeni della pluripotenza di superficie, SS EEA four e TRA one 60.

La strategia di gating è mostrata nella dispersione a sinistra. È stata inoltre eseguita un'analisi del cariotipo delle cellule IP FS cresciute su gel della matrice. L'induzione nel lignaggio cardiaco è stata innescata dall'aggregazione delle cellule IPS in ebs, insieme alla coltura in presenza di un tipo specifico di siero.

E poiché l'acido sorbico si contrae, le aree rappresentavano dal 20 al 35% della coltura totale, a seconda della linea cellulare utilizzata. Le CMS contratte sono state isolate da queste regioni mediante digestione enzimatica e analizzate per l'espressione proteica. R-T-P-C-R ha trovato l'espressione di canali ionici cardiaci specifici espressi nelle cellule battinti derivate da IPS, ma non nelle cellule non battibili.

Questi canali includevano uno alfa, una subunità di un canale del calcio voltaggio-dipendente, una subunità alfa di un canale del sodio voltaggio-dipendente di tipo cinque, un canale voltaggio-dipendente del potassio del KQT, sottofamiglia simile, ed entrambe le forme di miosina. L'analisi dell'immunofluorescenza a catena pesante ha rivelato che singoli cardiomiociti derivati da IPS esprimevano le proteine strutturali, alfa sarcomerico, actina, troponina cardiaca I e la giunzione cardiaca specifica, conexion 43. Dopotutto, questa tecnica ha davvero aperto la strada alla modellazione delle malattie miocardiche in vitro e consente la sperimentazione di farmaci in ambito umano senza iniettare il farmaco nel corpo umano.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come mantenere le cellule IPS in condizioni libere e libere e differenziarle in cardiomiociti attraverso un metodo basato sull'aggregazione dei corpi embrionali.