Name: Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine in ripiegamento Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: Impara a monitorare il ripiegamento proteico in vivo in Saccharomyces cerevisiae usando saggi accoppiati di microscopia a fluorescenza e attività enzimatica. Questo metodo quantifica l'efficienza di riattivazione delle proteine denaturate.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health (NIGMS-074.696) per KAM e un American Society of Microbiology Robert D. Watkins Graduate Student Research Fellowship alla JLA Ringraziamo anche John Glover presso l&#39;Università di Toronto per la fornitura del FFL -GFP plasmide sorgente.

1. Costruzione di ceppi contenenti FFL-GFP plasmide Per questo studio, Saccharomyces cerevisiae ceppo BY4741 (MAT una, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) è stato usato in concomitanza con una delezione ceppo Hsp104 dalla collezione ko lievito (Open Biosystems / Thermo Scientific). La delezione è stata confermata usando un anticorpo Hsp104-specifico per l&#39;analisi Western blot. FFL-GFP è stata espressa da p426MET25-FFL-GFP, costruito da una fonte LEU2 basata plasmide ottenuto dal laboratorio Glover presso l&#39;Università di Toronto, 17 e ottenere, su richiesta agli autori. Espressione della proteina di fusione GFP-FFL plasmide è controllata dal promotore MET25 metionina-reprimibile. Il plasmide è stato trasformato in ogni ceppo utilizzando un protocollo è stato adattato da Gietz et. al, 1995: <ol><li> Centrifugare 25 ml o<html> f log cellule di fase in una provetta da 50 ml a 4.400 rpm per 2 minuti, lavare con 500 ml di doppia distillata H 2 0 (DDH 2 O), e scartano supernate. </li><li> Risospendere le cellule in 250 microlitri di TE / Liac (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 M di acetato di litio). Incubare a 30 ° C senza miscelare per 20 min. </li><li> Trasferire 50 ml di cellule competenti in una nuova provetta con 5 ml (50 microgrammi) di DNA vettore e 5 microlitri (0,1-5 mg) di DNA plasmidico. Aggiungere 300 ml di PEG / TE / Liac (come TE / Liac più il 40% di glicole polietilene) di questa miscela, e le cellule incubare a 30 ° C per altri 30 min. </li><li> Aggiungere 1/10 del volume (v / v) di DMSO (36 mL) a questa miscela e shock termico a 42 ° C per 6 min. </li><li> Centrifugare miscela a 6.000 rpm per 30 sec e rimuovere supernate. Risospendere le cellule in 100 l di sterili DDH 2 0 e cellule piastra su un supporto completi sintetici privi uracile (SC-URA). </li></ol> 2. Induzione di FFL-GFP nt &quot;&gt; FFL-GFP è indotto volta cellule sono in fase logaritmica quindi la maggior parte della proteina prima heat-shock, di nuova costruzione per evitare le proteine ​​che sono terminalmente aggregate nel tempo a causa inadeguatezze cellulari associate all&#39;invecchiamento. <ol><li> 1 ° giorno: le cellule incubare 5 ml di SC-URA a 30 ° C di rotazione O / N. </li><li> Giorno 2: Misura OD 600 e colture fresche inoculare in 5 ml di SC-URA OD 600 ~ 0.2. </li><li> Incubare culture con rotazione a 30 ° C fino a raggiungere log fase OD 600 ~ 0.8-1.0. </li><li> Centrifugare le cellule in 15 ml provette coniche a 4.400 rpm per 3 minuti, decantare supernate e risospendere il pellet cellulare in 500 ml di DDH 2 0; soluzione di trasferimento in una provetta. </li><li> Centrifugare a 6.000 rpm e scartare supernate. </li><li> Risospendere le cellule in 5 ml di SC-URA-MET. Le cellule devono essere incubate rotante in questo media per 1 ora a 30 ° C. </li><li> Centrifugare le cellule e lavare ripetere in DDH 2 0 e scartare supernate. </li><li> Resuspecellule nd in 5 ml supporti SC-URA contenenti 100 mg / ml di cicloeximide di inibire l&#39;espressione della proteina, e procedere immediatamente al punto 3. </li></ol> 3. Enzimatica FFL-GFP Recovery Assay Questo saggio è un metodo quantitativo per determinare i livelli di enzima attivo in una popolazione. <ol><li> La preparazione di questo saggio: <ol class="lroman"><li> Misurare OD 600 per ogni campione. </li><li> Preparare necessaria quantità di D-luciferina necessario in base al numero di campioni e numero di repliche aggiungono circa 1.200 microlitri per il tubo desiderato. Concentrazione finale di D-luciferina è ~ 23 mg per 100 ml di cellule. Inizialmente si è disciolta in acqua ad una concentrazione della soluzione di 7,5 mg / ml e diluiti a 455 ug / ml in SC prima dell&#39;esperimento. Nella figura 2, tre repliche per ogni campione sono stati analizzati per un totale di 2,4 ml di D-luciferina utilizzato. </li><li> Lettore di piastre di programma per il flash lumisaggio nescence (adattato da Biotek Gen5 &quot;luminescenza Assay Flash con iniezione&quot;, per gli altri strumenti seguono le indicazioni del produttore) <ol class="lalpha"><li> Impostare la temperatura a 30 ° C </li><li> Impostare lettore di piastre per aggiungere D-luciferina, agitare e leggere ogni bene individualmente. </li><li> Leggi luminescenza (lettura finale, 5 sec il tempo di integrazione, 180 livelli di sensibilità) </li><li> Per i test di recupero tra ogni scossa lettura per 5 min, 20 min ritardare, e agitare un ulteriore 5 min. </li><li> Pipettare 50 ml di D-luciferina da un iniettore. </li></ol></li></ol></li><li> Preriscaldare-shock luminescenza è misurato immediatamente dopo che le cellule vengono aggiunti supporti contenenti cicloeximide per fermare la sintesi proteica. <ol class="lroman"><li> Trasferire 100 microlitri di cellule per ogni campione con numero desiderato di repliche in un solido bianco piastra da 96 pozzetti. </li><li> I controlli devono comprendere un vuoto d&#39;acqua e le cellule che contengono un vettore vuoto. </li><li> Avviare la lettura con la specifich elencati sopra. </li></ol></li><li> Per denaturare la porzione di FFL FFL-GFP, incubare la coltura 5 ml in una provetta di coltura di vetro a 42 ° C agitando per 25 min. </li><li> Letture luminescenza saggio di recupero iniziano subito dopo le cellule vengono rimosse dal termostato, che è punto zero tempo. Misura di luminescenza come sopra descritto per il primo punto temporale e ogni 30 min per 90 min. </li><li> Normalizzare i campioni di preriscaldare-shock valori di luminescenza che sono state regolate in base al diametro esterno 600 (dividere i valori di preriscaldamento-shock da OD 600). </li></ol> 4. Microscopia a fluorescenza Questo saggio è un metodo semi-quantitativo per determinare solubilizzazione degli aggregati nel tempo in una popolazione di cellule. <ol><li> L&#39;induzione è la stessa descritta nella sezione 2, punti 1-8 di protocolli. </li><li> Gli stessi punti di tempo sono presi come descritto sopra (sezione 3, punto 4), ma per il microfonoroscopy raccogliere 1 ml di cellule a preriscaldare-shock e ogni punto di tempo di recupero, e campioni incubare rotanti a 30 ° C in tubo di cultura. </li><li> Visualizzazione: <ol class="lroman"><li> Centrifugare 1 ml di cellule a 6.000 rpm per 30 sec e rimuovere supernate. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 2 ml di DDH 2 O. </li><li> Miscelare 2 ml di cellule più 2 ml di 2% basso punto di fusione agarosio sul vetrino e aggiungere un vetrino. Per ottenere un unico piano di cellule premere leggermente dito nel centro del vetrino e ruotare finché il vetrino è difficile da spostare. </li><li> Le cellule sono visualizzati tramite oggettiva olio 100X sul microscopio a fluorescenza; utilizzare DIC per visualizzare le cellule e il filtro FITC per visualizzare fluorescenza GFP. </li><li> Prendere più immagini per ogni ceppo ad ogni tempo per la quantificazione. I campi per le immagini devono contenere ~ 15-30 cellule per l&#39;analisi post-sperimentale quantitativa. </li><li> Per calcolare la percentuale di cellule che contengono aggregati, contare 50Cellule -100 totale e dividere il numero di celle che contengono aggregati. </li></ol></li></ol> 5. Singolo Microscopia cellulare Questo metodo è usato per seguire la solubilizzazione dei singoli aggregati in una singola cella nel tempo. <ol><li> Indurre l&#39;espressione FFL-GFP, come descritto nella sezione 2, punti 1-8. </li><li> Dopo heat-shock, le cellule da centrifuga da 15 ml tubo conico a 4.400 rpm per 2 min. </li><li> Lavare le cellule con 500 ml di acqua e risospendere in 20 ml di DDH 2 O. </li><li> Per ogni ceppo, tagliare una sezione di 5x5 mm su una piastra di agar SC-URA e utilizzando la superficie che era in contatto con la piastra di Petri, Pipetta 4 microlitri di cellule e diffuso in tutto superficie di agar con puntale. Lasciate riposare per circa 1 min. </li><li> Utilizzare le pinzette per posizionare sezione cubo agar a faccia in giù su un ~ 55 millimetri di vetro fondo piatto n ° 0 e premere leggermente. </li><li> Visualizzazione: <ol class="lroman"><li> Vedere i-iii a Sectione 4. </li><li> Impostare le coordinate di 2-4 punti focali per ogni ceppo a seconda della densità della cultura. </li><li> Impostare fotocamera per scattare foto con una Z-stack con gamma appropriata (- / + 15 micron di spessore fetta 0.5-1.0 micron) ogni 5 min per un periodo di 90 min. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo articolo l&#39;proteina modello FFL-GFP è stato usato per dimostrare che il disaggregase lievito, Hsp104 contribuisce alla proteina re-solubilizzazione e riparazione. I saggi enzimatici e microscopia differenzialmente interrogato lo stato della stessa proteina substrato per determinare ripiegamento efficienza e la resa. Risultati dei saggi enzimatici recupero suggeriscono che non solo è il massimo recupero nel hsp104D ceppo mutante inefficiente, ma la grandezza iniziale della sollecitazione dispiegars...

Negli esseri umani malattie neurodegenerative tra cui l&#39;Alzheimer, il Parkinson e le malattie di Huntington sono stati collegati a misfolding e aggregazione 10. Le cellule impiegano chaperon molecolari per prevenire intrappolamento cinetica delle proteine ​​cellulari in strutture inattive mal ripiegate 6. Accompagnatori partecipano a reti di interazione complessi all&#39;interno della cellula, ma non è completamente noto come la somma di queste interazioni contribuisce a proteostasis organismal. Uno degli accompagnatori principali responsabili della maggior parte dei citosolica ripiegamento delle proteine ​​è il 70 kD proteina da shock termico (Hsp70) famiglia 19. È stato dimostrato che la perdita di lievito Hsp70 diminuisce la capacità di piegare nascente FFL heterologously espresso e ripiegare la proteina endogena, ornitina transcarbamoylase, in vivo 18, 7. La capacità di analizzare pieghevole con risoluzione tempo quasi reale faciliterà la comprensione di come ulteriore fattori cellulari contribute a questo processo Hsp70-dipendente. Inoltre, piegatura / ripiegamento reazioni potrebbe non essere completamente dipendente da queste proteine ​​che contribuiscono, in modo dosaggi devono essere abbastanza sensibile per rilevare piccole e grandi cambiamenti nella cinetica e di efficienza. Il disaggregase cellula di lievito, Hsp104, svolge un ruolo fondamentale nella riparazione di proteine ​​mal ripiegate aggregati. Sebbene Hsp104 omologhi sono stati identificati in funghi e piante, questa famiglia sembra essere assente in metazoi. E &#39;stato proposto che altri chaperon come quelle della famiglia Hsp110 eseguire alcuni dei noti Hsp104 attività nei mammiferi 16. Hsp104 è un +, complesso proteico esamerica AAA che funziona in lievito di aggregati proteici rimodellare, contribuendo a ripiegamento e riparazione 13. Hsp104, insieme con il lievito Hsp70, Ssa1, e il lievito Hsp40, Ydj1, necessario per il ripristino di FFL denaturato in cellule di lievito 5, 8. La piccola proteina da shock termico, Hsp26, ha anche dimostrato di essere requirosso per disaggregazione Hsp104-mediata di FFL 2. FFL è una proteina due dominio che lega il substrato luciferina nel sito attivo e seguendo un cambiamento conformazionale che richiede ATP e ossigeno, decarbossila il substrato rilasciando oxyluciferin, anidride carbonica (CO 2), adenosina monofosfato (AMP), e la luce 11, 9, 3. Il substrato disponibile in commercio FFL, D-luciferina, provoca emissione di luce tra 550-570 nm che possono essere rilevati usando un luminometro 15. FFL è squisitamente sensibile alla denaturazione da trattamenti chimici o di calore e aggrega rapidamente a dispiegarsi. Se esposto a temperature tra 39-45 ° C FFL è reversibile spiegato ed inattivato 12. In contrasto, GFP e suoi derivati ​​sono altamente resistenti alla proteina dispiegarsi sollecitazioni 14. Pertanto fusione di queste due proteine ​​permette FFL aver operato come frazione sperimentalmente labile in grado di colpire G funzionaleFP a intracellulare depositi che possono essere visualizzati mediante microscopia a fluorescenza sia la popolazione e livelli di cellule singole. Applicazione del saggio enzimatico in un lettore di piastre multimodale semi-automatico accoppiato con microscopia automatizzata consente la valutazione simultanea senza precedenti di cinetica e di rendimento di ripiegamento reazioni. Inoltre, la genetica molecolare facili del modello eucariote Saccharomyces cerevisiae consente sia precisa manipolazione della rete di controllo della qualità delle proteine ​​e l&#39;opportunità di approcci basati scoperta per identificare nuovi giocatori che contribuiscono alla risposta allo stress cellulare e proteostasis. In questo studio, i ceppi wild-type (WT) e Hsp104 cancellazione esprimono FFL-GFP sono soggetti a denaturazione delle proteine ​​da shock termico. FFL-GFP ripiegamento viene monitorata attraverso sia un saggio enzimatico e microscopia come visualizzatore proxy per la riparazione del proteoma espresso in un corso di tempo di ripristino. Se paragonato alle cellule WT, mostriamo the Hsp104 ceppo cancellazione è ~ 60% meno efficiente a ripiegamento FFL-GFP, sostenendo risultati precedenti che istituisce un ruolo per Hsp104 nella riattivazione di denaturato FFL 2.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenti</td></tr><tr><td>Synergy MX Lettore di micropiastre</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81-ZDC Microscopio confocale invertito</td><td>Olympus, Tokyo Giappone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumitrac 200 piastre bianche a 96 pozzetti</td><td>USA Software</td> di microscopia digitale Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 5.0</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Tris Base Fisher</td><td></td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>(LiAc) Acetato di litio</td><td>Sigma</td><td>L6883</td><td></td></tr><tr><td>PEG (glicole polietilene)</td><td>Fisher</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Malinckrodt</td><td>4948</td><td></td></tr><tr><td>SC</td><td>Sunrise</td><td>1300-030</td><td></td></tr><tr><td>SC-URA</td><td>Sunrise</td><td>1306-030</td><td></td></tr><tr><td>cicloesimide</td><td>Acros Organics</td><td>357420050</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina</td><td>Sigma</td><td>L9504</td><td></td></tr><tr><td>agarosio a basso punto di fusione</td><td>NuSieve</td><td>50082</td><td></td></tr><tr><td>olio da immersione</td><td>Cargille</td><td>16484</td><td></td></tr></tbody></table>

saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, definiti come i processi combinati di proteine ​​pieghevole / biogenesi, ripiegamento / riparazione, e il degrado, è un delicato equilibrio cellulare che deve essere mantenuta per evitare conseguenze deleterie 1. Fattori esterni o interni che sconvolgono questo equilibrio può portare ad aggregazione proteica, la tossicità e la morte cellulare. Negli esseri umani questo è un fattore importante che contribuisce ai sintomi associati a patologie neurodegenerative come la corea di Huntington, il morbo di Parkinson e il morbo di Alzheimer 10. È pertanto essenziale che le proteine ​​coinvolte nel mantenimento di proteostasis essere identificati per sviluppare trattamenti per queste malattie debilitanti. In questo articolo vengono descritte le tecniche per il monitoraggio in ripiegamento delle proteine ​​vivo a risoluzione quasi in tempo reale utilizzando il modello di proteina lucciola luciferasi fusa alla proteina fluorescente verde (GFP-FFL). FFL-GFP è una proteina chimerica modello unico come la frazione FFL è estremamente sensibile allo stress indotto misfolding e aggregazione, che inattiva l&#39;enzima 12. Attività di luciferasi è monitorata utilizzando un saggio enzimatico, e la frazione GFP fornisce un metodo di visualizzazione FFL solubile o aggregate utilizzando la microscopia automatizzata. Questi metodi accoppiati incorporano due approcci paralleli e tecnicamente indipendenti per analizzare sia ripiegamento e riattivazione funzionale di un enzima dopo stress. Attività di recupero può essere direttamente correlata con la cinetica di disaggregazione e ri-solubilizzazione per capire meglio come proteine ​​fattori di controllo di qualità come chaperon proteine ​​collaborano per eseguire queste funzioni. Inoltre, delezioni o mutazioni geniche possono essere usati per testare contributi di proteine ​​specifiche o subunità proteiche a questo processo. In questo articolo esaminiamo i contributi della proteina disaggregase Hsp104 13, nota di collaborare con il fattore di scambio Hsp40/70/nucleotide (NEF) Sistema 5 ripiegamento, di ripiegamento delle proteine ​​per validare questo approccio.

Lievito dipende dalla disaggregase, Hsp104 per ripiegare efficientemente proteine ​​denaturate termicamente. L&#39;attività di FFL-GFP è stata monitorata dopo uno shock termico 25 min, utilizzando un flash assay luminescenza Figura 1. I risultati di questo test automatizzati illustrato nella figura 2 hanno rivelato un aumento graduale dell&#39;attività durante 90 min ha permesso di ottenere un recupero&gt; 80% in cellule WT. Il ceppo hsp104Δ recuperato il 19% dell&#39;attività ...

Questo articolo descrive l&#39;uso di una proteina di fusione GFP-luciferasi lucciola per indagare<em&gt; In vivo</em&gt; Folding delle proteine ​​in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Usando questo reagente, ripiegamento di una proteina modello denaturato al calore può essere monitorato contemporaneamente mediante microscopia a fluorescenza e un saggio enzimatico per sondare i ruoli dei componenti di rete proteostasis nel controllo di qualità delle proteine.

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare la risolubilizzazione e il ripiegamento delle proteine in vivo in tempo quasi reale mediante microscopia a fluorescenza e saggi enzimatici. Questo viene ottenuto innanzitutto trasformando le cellule con un plasmide contenente la luciferasi della lucciola fusa alla proteina verde fluorescente o F-F-L-G-F-P. Il secondo passaggio consiste nell'indurre l'espressione della proteina F-F-L-G-F-P, seguito dal trattamento con cicloesimide per arrestare la produzione della proteina.Successivamente, misurare l'attività della luciferasi prima e per un certo periodo di tempo dopo la denaturazione termica. L'ultimo passaggio consiste nel visualizzare le cellule per determinare la solubilità della proteina F-F-L-G-F-P. In definitiva, la microscopia a fluorescenza e i saggi enzimatici vengono utilizzati per quantificare l'efficienza del ripiegamento di un enzima modello denaturato in ceppi multipli.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi a punto finale, è che consente di correlare l'attività della proteina allo stato di aggregazione nel tempo. Per determinare la relazione tra questi due fenomeni, questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'omeostasi proteica, ad esempio in che modo specifiche chaperine e chaperine COS partecipano alla disgregazione e al ripiegamento di una proteina modello e come queste due attività all'interno della cellula siano interdipendenti. La proteina di fusione luciferasi di lucciola-proteina fluorescente verde F-F-L-G-F-P viene espressa da questo plasmide sotto il controllo del promotore MET25, reprimibile dal metionina.Utilizzando un protocollo modificato mediato da acetato di litio, il plasmide viene trasformato in due ceppi croce visier, un ceppo di tipo selvaggio e un ceppo privo di HSP 1 0 4, un disgregasi del lievito che svolge un ruolo fondamentale nella riparazione di proteine mal ripiegate aggregate. Poiché il successo di questo esperimento dipende dalla sua esecuzione tempestiva, è necessario preparare quanto segue prima dell'induzione delle colture di F-F-L-G-F-P: provette contenenti terreno, microcentrifuga, provette e luciferina. La quantità di luciferina necessaria è calcolata in base al numero di campioni e al numero desiderato di repliche, più circa 1.200 microlitri per il tubo.Riscaldare preventivamente il bagnomaria a 42 gradi Celsius. Impostare la temperatura del lettore di piastre per il saggio di luminescenza rapida a 30 gradi Celsius. Impostare il lettore di piastre in modo che aggiunga luciferina, agiti e legga ogni pozzetto singolarmente per la lettura della luminescenza, configurata come lettura finale. Tempo di integrazione di cinque secondi e livello di sensibilità 180 per il saggio di recupero; tra ogni lettura, impostare un’agitazione di cinque minuti, un ritardo di 20 minuti e un’ulteriore agitazione di cinque minuti.Caricare delucci nell'iniettore e impostare l'iniettore per erogare 50 microlitri di Lucifer per ottenere una concentrazione finale di circa 23 microgrammi per campione per avviare la procedura di induzione di F-F-L-G-F-P. Incubare le cellule in cinque millilitri di mezzo sintetico completo privo di uracile SC meno YURA a 30 gradi Celsius sotto agitazione per tutta la notte. Il giorno seguente, misurare l'OD 600 e inoculare colture fresche in cinque millilitri di SC meno yura fino a un OD 600 di circa 0,2. Incubare le colture sotto agitazione a 30 gradi Celsius fino al raggiungimento della fase logaritmica, corrispondente a un OD 600 compreso tra 0,8 e 1,0. Centrifugare le cellule in provette coniche da 15 millilitri a 4.400 giri al minuto per tre minuti.Decantare, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di acqua bidistillata. Trasferire le cellule risospese in una provetta da microcentrifuga e centrifugare a 6.000 giri al minuto per 30 secondi, quindi scartare il soprannatante. Risospendere le cellule in cinque millilitri di mezzo sintetico completo privo di uracile e metionina (SC meno ura meno met) e incubare le cellule in questo mezzo sotto lento agitazione a 30 gradi Celsius per un'ora. La rimozione della metionina indurrà l'espressione di F-F-L-G-F-P. Dopo un'ora, centrifugare le cellule, rimuovere il soprannatante e lavare con DD H2O. Dopo aver scartato l'acqua bidistillata, risospendere le cellule in cinque millilitri di mezzo SC meno privo di metionina contenente 100 microgrammi per millilitro di ciclossimide per inibire l'espressione proteica.Procedere immediatamente al saggio enzimatico di recupero di F-F-L-G-F-P. Iniziare questa procedura immediatamente dopo la risospensione delle cellule nel mezzo contenente cicloesimide. Prelevare un millilitro da ogni campione per la misurazione successiva di D 600 al fine di misurare la luminescenza pre-shock termico.Impostare innanzitutto i controlli, inclusi un bianco d'acqua e cellule contenenti un vettore vuoto, in una piastra solida bianca a 96 pozzetti; quindi trasferire 100 microlitri di cellule per ogni campione con il numero desiderato di replicati. Avviare la lettura della piastra con le specifiche programmate per denaturare il FFL MOTY di F-F-L-G-F-P. Incubare la coltura di cinque millilitri a 42 gradi Celsius sotto agitazione per 25 minuti.Iniziare immediatamente le letture di luminiscenza per il saggio di recupero non appena le cellule vengono rimosse dall'incubatore, che corrisponde al tempo 0,0. Misurare la luminiscenza per il primo punto temporale e ogni 30 minuti per 90 minuti. Per preparare le cellule per la microscopia a fluorescenza, centrifugare un millilitro di cellule a 6.000 giri al minuto per 30 secondi ed eliminare il soprannatante resus.Sospendere il pellet cellulare in due microlitri di DDH due o. Mescolare due microlitri di cellule e due microlitri di agarosio al 2% a basso punto di fusione su un vetrino e aggiungere un coprioggetto. Per ottenere un singolo piano di cellule, premere leggermente con un dito al centro del coprioggetto e ruotare finché il coprioggetto risulta difficile da muovere.Le cellule vengono visualizzate al microscopio a fluorescenza utilizzando un obiettivo ad immersione in olio da 100x. Utilizzare il contrasto di fase DIC per visualizzare le cellule e il filtro Fitz per visualizzare la fluorescenza GFP. Acquisire più immagini per ogni ceppo a ciascun punto temporale.Per i campi di quantificazione, le immagini dovrebbero contenere circa da 15 a 30 cellule per l'analisi quantitativa post sperimentale. Per iniziare questa procedura, indurre l'espressione di F-F-L-G-F-P e sottoporre le cellule a shock termico come dimostrato in precedenza, quindi centrifugare le cellule in un tubo conico da 15 millilitri a 4.400 giri al minuto per due minuti. Rimuovere il soprannatante e lavare le cellule con 500 microlitri di acqua.Dopo aver scartato l'acqua, risospendere le cellule in 10-15 microlitri di SC privo di yura. Per ogni ceppo, ritagliare una sezione di cinque per cinque millimetri di una piastra in agar SC privo di yura. Posizionare la sezione di agar su una piastra di vetro con fondo numero zero di circa 55 millimetri, con la superficie dell'agar che era sul fondo della piastra.Posizionare rivolto verso l'alto quattro microlitri di cellule con la pipetta e distribuirli sulla superficie dell'agar utilizzando la punta della pipetta. Lasciare in posa per circa un minuto. Successivamente, utilizzare pinzette per posizionare il frammento di agar con la faccia verso il basso sulla stessa piastra con fondo in vetro.Premere leggermente verso il basso per visualizzare le cellule al microscopio a fluorescenza utilizzando un obiettivo ad immersione in olio da 100x. Utilizzare il contrasto di fase DIC per visualizzare le cellule e il filtro fit e per osservare la fluorescenza di GFP; impostare le coordinate per due-quattro piani focali per ciascun ceppo, in base alla densità della coltura. Impostare la fotocamera in modo da acquisire una serie di immagini in Z con l'intervallo appropriato ogni cinque minuti per un periodo di 90 minuti.Per studiare il ruolo della proteina HSP 1 0 4 del lievito nel ripiegamento delle proteine denaturate dal calore, è stato utilizzato un saggio di lampo luminoso per monitorare l'attività di F-F-L-G-F-P in cellule di tipo selvaggio e in cellule HSP 1 0 4 delta prima dello shock termico e immediatamente dopo lo shock termico per ciascun punto temporale indicato; i risultati hanno rivelato un aumento progressivo dell'attività nel corso di 90 minuti, che ha portato infine a un recupero superiore all'80% nelle cellule di tipo selvaggio. La variante HSP 1 0 4 delta ha recuperato il 19% dell'attività originale nello stesso intervallo di tempo. Inoltre, l'entità dell'inattivazione iniziale è risultata molto maggiore nella variante HSP 1 0 4 delta, come indicato dal 26% di attività nel tipo selvaggio contro l'11% nell'HSP 1 0 4 delta.Ciò suggerisce che HS P 1 0 4 potrebbe svolgere un ruolo protettivo prima dello stress oppure si associ rapidamente all'F-F-L-G-F-P in fase di denaturazione durante il passaggio di inattivazione termica, riducendo la perdita di attività enzimatica. La microscopia di popolazione ha confermato. Le cellule per il saggio dell'attività enzimatica sono state raccolte a 0, 30, 60 e 90 minuti dopo lo shock termico e visualizzate mediante microscopia a fluorescenza; qui sono mostrate immagini rappresentative di ciascun punto temporale.Le puntiformi di colore verde brillante all'interno delle cellule rappresentano gli aggregati F-F-L-G-F-P. La quantificazione è stata effettuata contando circa 100 cellule in quattro o cinque campi e calcolando la percentuale di cellule contenenti aggregati. È stato osservato che quasi tutte le cellule nel ceppo mutante HSP 1 0 4 delta presentavano almeno un aggregato F-F-L-G-F-P, rispetto al numero di aggregati nel ceppo di tipo selvatico, che si riduceva del 62% entro 90 minuti dallo shock termico a livello di singola cellula.La microscopia automatizzata ha rivelato che nelle cellule di tipo selvaggio rispetto alle cellule HSP104Δ, il peptide F-F-L-G-F-P è stato risolubilizzato a un tasso maggiore. Questa figura mostra immagini fisse rappresentative proiettate da uno stack Z ottenuto durante un periodo di 90 minuti. Inoltre, la dinamica degli aggregati proteici era molto diversa nelle cellule di tipo selvaggio e nelle cellule HSP104Δ: nelle cellule di tipo selvaggio, gli aggregati tendevano a fondersi prima di essere risolubilizzati, come illustrato in questo filmato.In cellule HSP 1 0 4 delta, gli aggregati non si fondono prima di essere solubilizzati e la velocità di solubilizzazione è inferiore rispetto a celle di tipo selvatico. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in circa tre ore, a partire da cellule in fase logaritmica media.

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