A Caenorhabditis elegans Sistema modello per Amylopathy Studio

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare gli effetti della tossicità dell'amiloide-beta sulla funzione neuronale e sulla sopravvivenza. Ciò si ottiene costruendo prima vermi transgenici C elegance che esprimono un peptide beta amiloide con un reporter GFP in un neurone sensoriale SE. Successivamente, la conseguenza comportamentale dell'espressione di amiloide-beta in un neurone SE viene valutata mediante un test di chemiotassi.

Il terzo passo consiste nell'ottenere colture primarie di neuroni SE e quindi trattare i neuroni in coltura con agenti farmacologici come Q-V-D-O-P-H per sopprimere l'effetto tossico dell'amiloide-beta. In definitiva, i risultati possono mostrare gli effetti della tossicità dell'amiloide-beta sulla funzione e sulla sopravvivenza dei neuroni SE attraverso saggi comportamentali e farmacologici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla neurodegenerazione, come chiarire specifici meccanismi cellulari e molecolari.

Effetti neurotossici sottostanti degli oligomeri di amiloide-beta. A dimostrare le procedure sarà il Dr.Zing Dwan, un postdoc del mio laboratorio Per la trasformazione, sono necessari tamponi per iniezione al 2% di agros. Metti una goccia di aros caldo sciolto in acqua su un vetrino coprioggetti e posiziona rapidamente un secondo vetrino coprioggetti sulla goccia e picchiettalo leggermente.

Quando si prepara la miscela per iniezione, assicurarsi di centrare e trasferire i primi cinque microlitri, privi di detriti e altri contaminanti, in una provetta nuova per il carico di iniezione, la miscela per iniezione e il plasmide vuoto in una pipetta per iniezione ad azione capillare. Mezzo microlitro è di solito sufficiente per iniettare 100 vermi per allargare l'apertura sulla pipetta per iniezione, strofinare la punta contro il bordo di un vetrino coprioggetti montato su un vetrino in Olio Halo carbon 700. La qualità dell'apertura è fondamentale.

Viene giudicato dalla forma del puntale e, soprattutto, dalla portata, valutata dal flusso e dalle dimensioni delle bolle che si formano sul puntale della pipetta in risposta alla pressione di iniezione. Ora metti una goccia di olio di carbonio 700 su un tampone di iniezione e trasferisci diversi vermi sul tampone. Usa un plettro per vermi per spingere i vermi verso il basso sul pad finché non aderiscono all'aros.

I vermi dovrebbero essere orientati in file con i lati ventrali allineati. Evita di toccargli la testa. Se dopo diversi tentativi i vermi non riescono ad aderire al tampone, provare un tampone nuovo o aumentare lo spessore o la concentrazione dell'agro.

Ora inserisci la pipetta nel verme. Innanzitutto, spostare il tavolino per posizionare il verme sotto la pipetta. Posizionare la pipetta vicino al nucleo centrale della gonade.

Poiché il suo citoplasma è condiviso da molti nuclei di cellule germinali, questo migliora la probabilità che il DNA iniettato venga passato alla progenie. La pipetta deve essere quasi parallela al verme. Terzo, muovi la punta verticalmente verso il corpo fino a quando la pelle non è premuta.

Infine, picchiettare delicatamente il manipolatore per indurre l'inserimento delle punte. Ora inietta la soluzione di DNA. Applicare pressione sulla pipetta fino a quando la gonade non si gonfia.

Quindi arrestare il flusso ed estrarre il verme dalla pipetta. Testare il flusso degli aghi, quindi iniettare le altre gonadi prima di passare al verme successivo. Dopo le iniezioni, aggiungere circa 10 microlitri di tampone di recupero ai vermi e attendere che inizino a nuotare.

Una volta nuotato, aggiungere un volume uguale di tampone M nove. Quando i vermi riprendono a nuotare, continua ad aggiungere M nove fino a quando la soluzione non è per lo più M nove. Ora trasferisci ogni verme su un piatto seduto.

Raccogli i vermi GR in un millilitro di tampone M nine in una provetta di falco da 50 millilitri. Quindi, utilizzando il tampone M nine, lavare i vermi mediante centrifugazione ripetuta e sostituzione della soluzione fino a quando l'M nove non è limpido dopo il lavaggio. Quindi, aggiungi 10 volumi di soluzione basica di ipoclorito ai pidocchi.

I vermi pellettati incubano i vermi a temperatura ambiente fino a quando circa quattro quinti di essi non si rompono, il che richiede in genere 10 minuti. Monitorare la reazione prelevando aliquote da visualizzare con un microscopio. Arrestare la reazione aggiungendo un volume uguale di tampone sterile per uova.

Raccogliere quindi le uova e le carcasse mediante centrifugazione a 450 g per cinque minuti. Rimuovere delicatamente il surnatante. Aggiungere nuovamente un volume uguale di tampone d'uovo e centrifugare nuovamente la provetta a 450 g per cinque minuti.

Ripetere la procedura fino a quando il buffer non è libero. Ora incubare le uova per una notte in un tampone M nove e il giorno successivo seminarle su piastre NGM standard. Preparate diversi cubetti di agar, circa mezzo centimetro di lato.

Immergere i pezzi di agar in una soluzione contenente l'attrattivo desiderato per due ore. Depositare un pezzo di agar in una piastra di prova di 10 centimetri in cui sono stati contrassegnati la posizione del punto di prova e un punto di controllo. Prepara cinque di queste piastre per esperimento.

Lascia che le piastre formino un gradiente chimico lasciandole per una notte a 20 gradi Celsius il giorno successivo. Prima dell'esperimento, aggiungere 10 microlitri di azoturo di sodio da 20 millimolari in ogni punto delle piastre. Questo agisce come un anestetico.

Inizia l'esperimento posizionando 20 vermi sincronizzati con l'età al centro della piastra, quindi posizionando la piastra in un'incubatrice a 20 gradi Celsius per un'ora. Dopo un'ora, contare gli animali sul test sui punti di controllo e calcolare l'indice CI. Dopo aver lisato i vermi e pulito le uova e le carcasse come descritto in precedenza, rimetterli in sospensione in due millilitri di tampone sterile per uova e aggiungere due millilitri di saccarosio sterile al 60% in tampone per uova.

Quindi mescolare il tubo a mano o a vortice fino a quando le uova non sono completamente risospese. Centrifugare le uova risospese a 450 volte G per 15 minuti. Quindi raccogliere con cura il surnatante riempito di uova e scartare il palato per eliminare il saccarosio residuo, risospendere le uova nel tampone d'uovo e centrifugarle a 450 g per cinque minuti.

Raccogliere ed eliminare delicatamente il surnatante, quindi ripetere il processo di pulizia tre volte sulla cappa. Utilizzare un tampone sterile per uova contenente un'unità per millilitro di chitinasi per risospendere gli ovuli pellettati. Lasciare digerire le uova a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi iniziare a monitorare la reazione con un microscopio per colture cellulari invertito.

Quando il 70-80% dei gusci d'uovo è stato digerito, aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura completo L 15 o CM 15. Per isolare le cellule, dissociare le cellule in modo che non formino grumi facendole passare attraverso un ago calibro 27 alcune volte. Ora passa la soluzione attraverso una siringa con un filtro da cinque micron.

Pellettare la sospensione cellulare dissociata mediante centrifugazione a 450 G per 15 minuti. Quindi rimuovere il surnatante e risospendere le celle pellettate in CM 15. Per essere sicuri che le cellule siano dissociate, controllare la sospensione al microscopio.

Infine, placcare le celle dissociate su vetrini di copertura precedentemente rivestiti. Con la lectina di arachidi, le cellule possono essere mantenute a temperatura ambiente con aria normale per più di due settimane. Utilizzando le tecniche di trasformazione descritte, è stato costruito un verme transgenico per esprimere un Beta 42 umano nei neuroni a SE, neuroni che rilevano attrattivi idrosolubili come la biotina utilizzando il test di chemiotassi.

Sono stati testati vermi transgenici di sette giorni. I controlli non hanno avuto problemi a trovare la biotina. Al contrario, solo pochi vermi che esprimono un beta 42 potrebbero trovare il punto attrattivo.

L'indice di chemiotassi per la biotina era 0,68 contro 0,12 per i vermi di controllo e sperimentali rispettivamente a tre o quattro giorni. C'è stato anche un piccolo ma rilevabile calo dell'indice. Un neurone SER A coltivato a quattro giorni esprime ancora GFP dopo nove giorni di vita.

Tuttavia, la fluorescenza GFP è scomparsa e si sospetta che l'apoptosi metta alla prova di questa teoria. I neuroni SER A primari sono stati preparati come descritto e integrati con un inibitore della caspasi ad ampio spettro. Come previsto, il trattamento ha fermato la perdita di fluorescenza confermando che l'espressione di A beta 42 umano innesca l'apoptosi nei neuroni A SER.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire gli eleganti vermi transgenici, studiarli in saggi comportamentali e come ottenere la coltura primaria da Ambrose.