ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<p class="jove_content"&gt; Мы благодарим доктора Лю Шуан за критическое прочтение рукописи. PCL12 конструкция была подарком форме Д-р Кристофер Д. Линку. Эта работа была поддержана двумя Национальный научный фонд грантов (0842708 и 1026958) и AHA гранта (09GRNT2250529) в FS.</p

1. Строительство трансгенные черви <ol><li> Трансформации. <ol><li> Приготовления инъекции колодки. Поместите каплю горячей, 2% агарозном растворяется в воде, на покровное стекло. Быстро разместить второй покровное на каплю и слегка коснитесь его. После того, как агароза затвердеет, покровные слайд друг от друга, и выпекать покровное площадкой в ​​вакуумной печи при 80 ° CO / N. </li><li> Потяните пипеток. Мы используем Саттер Р-97 Съемник тянуть 1/0.5 мм OD / ID боросиликатного капилляров с нитью. Пипетки кованые с закрытыми наконечник, который взломан на более позднем этапе. </li><li> Приготовления инъекции смеси. Сделать инъекции смеси, содержащей интерес ДНК (20 нг / мкл в конструкции) плюс пустой плазмидой ДНК в конечной концентрации 150 нг / мкл. Центрифуга инъекции смеси для удаления любых загрязнений. Этот шаг имеет решающее значение, потому что загрязнители уменьшить эффективность трансформации. Передача Топ 5 мкл (мусора и других загрязнений собираются в нижней части) в чистую пробирку биспользуется в электронной инъекции. </li><li> Загрузите инъекции смеси капиллярным. В нижней части пипетки погружен в инъекции смеси. Обычно 0,5 мкл достаточно, чтобы придать 100 червей. </li><li> Загрузите инъекционной пипетки. Вставьте пипетки на держателе микроманипулятора и разорвать его открытым, потерев его кончик к краю покровного стекла установлены на стекло или же от космического мусора на площадку агарозы. Это очень важный шаг, поскольку слишком велики повреждения Советы червя и слишком маленькие чаевые легко засориться. Качество сломанный наконечник можно судить по форме и самое главное по расходу. Скорость потока может быть оценена по размеру пузырьки, вытекающих из открытый конец погружен в капли масла хладон 700 в ответ на давление нагнетания. </li><li> Передача червей инъекции площадку. Поместить каплю 700 Галокарбоновое масло на инъекции площадку и передать несколько (1 или 2 для начинающих) червей к маслу. Используйте червя выбрать не подтолкнуть червей вниз на площадку, покау придерживаться агарозы. Черви должны быть ориентированы в ряд с вентральной сторон смотрят в одном направлении. Старайтесь не прикасаться голова червя. Если после нескольких попыток черви не соблюдают колодки, замените ее свежей площадку или увеличить толщину агарозы и / или концентрации. </li><li> Вставьте пипетки в червя. При движении ступени, позиционировать червя под пипеткой. Поместите пипетку в центральном ядре гонад, потому что его цитоплазма разделяется многими ядер половых клеток. Это увеличивает вероятность того, чтобы доставить вводили ДНК многим потомства. Пипетки должны лежать почти параллельно червя (~ 15 ° -25 °). Нажмите вертикально кончик пипетки вниз тело червя, пока кожа не нажата. Затем осторожно нажмите на манипуляторе, чтобы вызвать вставку наконечника. Для достижения наилучших результатов как инъекционные половых желез. </li><li> Введите раствора ДНК. Надавите на пипетку до гонаду набухает. Остановить поток и вытащить червя от пипетки. Проверьте иглу для потока, а затем перейтик следующему червя и повторите шаги инъекции. </li><li> Восстановление черви: Добавить каплю (~ 10 мкл) буфера восстановления на червей и инкубировать, пока черви не начнут плавать. Добавить равный объем M9, подождите, пока черви не возобновить плавание и повторить несколько раз, пока раствор не в основном M9. Индивидуально передать червей семенами пластин. </li></ol></li><li> Интеграции. <ol><li> Налейте 40 здоровых, сытых, L4 червей в свежем пластины </li><li> Облучают γ-лучей с 4000 рад в течение 40 мин. Передача облученных червей (P0) в свежем, OP50 пластин семенами (4 червей / пластина). Черви альтернативно может быть облучен дозой 300 Дж / ​​м 2 координат. </li><li> Трансфер F1 10-20 трансформантах из каждой чашки на отдельные пластины, маркировать пластин с соответствующей P0 происхождения. </li><li> Выделить 2-4 F2 трансформантах для каждого F1 для отдельных пластин. Проверьте F3 потомства на 100% передачи преобразование маркера. Как правило, 1-3% потомства от облученных Виль червяУ меня интеграции события. </li><li> Сделать запасы из трех или более независимых линий трансформантом. </li></ol></li></ol> 2. Поведенческие Анализы <ol><li> Возраст-синхронизации. <ol><li> Расти червей в стандартных 10 см NGM пластин OP50 + E. палочки до большой популяции беременных взрослых достигается (3-5 дней). </li><li> Соберите червей в 50 мл труб Сокол, приостановив их в 1 мл буфера M9. </li><li> Добавить 5 мл M9 буфера и центрифуге при 450 мкг в течение 3 мин. Удалите супернатант. Повторите 3-4х. </li><li> В конце последнего центрифугирования, удаления супернатанта и добавляют 10 объемов основной раствор гипохлорита (0,5 М NaOH, 1% гипохлорита свежеприготовленный) к гранулированным червей. Инкубируют при комнатной температуре в течение ~ 10 мин. Лизис Реакцию можно контролировать путем размещения капли реакции лизиса на покровное и изучение червей под микроскопом. Когда около 80% червей разбиты реакция должна быть остановлена. </li><li> Остановить реакцию лизиса надстройкаг того же объема стерильного буфера яйца. </li><li> Собирают яйца (и туши) центрифугированием при 450 х г в течение 5 мин. </li><li> Мойте яйца с стерильном буфере яйцо 2-3х. </li><li> Выдержите яйца O / N в M9 буфера и семя их на стандартные пластины NGM. </li></ol></li><li> Хемотаксиса. <ol><li> Подготовьте несколько частей агар 0.5x0.5x0.5 см примерно. Мы кладем на депозит агар, в 10-см пластины и режем кусками агар оттуда. </li><li> Замачивание кусок агара в раствор, содержащий желаемую аттрактант (при насыщающих, почти насыщающей концентрации) в течение 2 часов. Типичные аттрактанты лизин (0,5 М), биотин (0,2 М). </li><li> Депозит агар кусок в 10 см испытательной пластины, в которых расположение тест месте и контроль местная были отмечены (рис. 1А). Разрешить уравновешивания и формирование градиента O / N (фиг.1В). Подготовить 5 тарелок для одного эксперимента. </li><li> До эксперимента добавить 10 мкл 20 мМ NaN 3 (Anesthetic) в каждом месте. </li><li> Поместите 20 возрастных синхронизированы червей в центре пластины. Место пластины в инкубатор при 20 ° С. </li><li> Через 1 ч рассчитывать животных на тест / контроль пятна и расчета индекса хемотаксиса, (CI) следующим образом: <img alt="Уравнение 1" fo:content-width=".863in" fo:src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1.jpg" /> где N, N испытаний и N Центр., указывают на общее количество животных, количество животных в тесте месте и количество животных в контрольной точке. </li></ol></li></ol> 3. Первичных эмбриональных клеточных культур <ol><li> Lyse червей, как описано в возрастной синхронизации. </li><li> Стоп лизис реакцию добавлением такого же объема стерильного буфера яйцо и центрифугируют при 450 х г в течение 5 мин. Аккуратно отбросить супернатант соблюдая осторожность, чтобы не потерять гранулированные яиц. Повторите 2-3х или пока супернатант не ясно. </li><li> Ресуспендируйте гранулированные яйца (и туши) В 2 мл стерильного буфера яйцо и добавить 2 мл стерильного 60% сахарозы в яйце буфера. Смешайте это решение, пока яйца не будут полностью ресуспендировали (поскольку они имеют тенденцию к образованию комков при центрифугировании) вручную или при помощи вортекса. </li><li> Центрифуга при 450 мкг в течение 15 мин. </li><li> Тщательно передачи надосадочной жидкости (содержащей яиц) в стерильную пробирку. Отменить гранул, которая содержит туши и другие побочные продукты лизиса. </li><li> Удалить остаточной сахарозы путем ресуспендирования яйца в яйцо буфере и центрифугируют при 450 х г в течение 5 мин. Аккуратно собираем и отбросить супернатант. Повторить 3 раза. </li><li> Под капотом ламинарного ресуспендируйте гранулированные яйца в яйца стерильном буфере, содержащем 1 Ед / мл хитиназе при комнатной температуре, чтобы переварить яичную скорлупу. Через 30 мин начинают осуществлять мониторинг реакции (под инвертированным микроскопом культуры клеток). Каждая партия хитиназе имеет несколько иную деятельность. Обычно пищеварения завершен в 1 час. </li><li> Когда примерно 70-80% яичной скорлупы усваиваются хитиназе Добавить CM-15 (L-15 клеточной культуре Medбария, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 50 ед / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина). Диссоциируют клетки, используя шприц с калибра 27. Фильтр клеточной суспензии с 5,0 мкм фильтр для удаления нетронутыми эмбрионов, группы клеток и личинок. </li><li> Гранул диссоциированной клеточной суспензии центрифугированием при 450 х г в течение 15 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в CM-15 клеточной культуральной среды. </li><li> Пластина диссоциированных клеток на стеклянные покровные стекла, предварительно покрытые арахисовое лектинов (0,1 мг / мл), растворенных в воде. Примечание: клетки должны придерживаться подложки, чтобы отличать. </li><li> Клетки могут быть выдерживают при комнатной температуре (16-20 ° C) на воздухе в течение более 2 недель. </li></ol>

<ol><li>Hardy, J., Allsop, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+deposition+as+the+central+event+in+the+aetiology+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).</li>
<li>Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body+pathology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lewy body pathology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).</li>
<li>Greenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+myositis%3A+review+of+recent+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neurology+and+Neuroscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Inclusion body myositis: review of recent literature.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).</li>
<li>Revesz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+and+familial+cerebral+amyloid+angiopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies.</a> Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).</li>
<li>Hartmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sites+of+intracellular+production+for+Alzheimer%27s+disease+A+beta40%2F42+amyloid+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides.</a> Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).</li>
<li>Ohnishi, S., Takano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+fibrils+from+the+viewpoint+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding.</a> Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).</li>
<li>C. elegans II. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harbor+Monograph%22">Cold Spring Harbor Monograph</a>. DL, R. iddle, et al. 1, M. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1222(1997).</li>
<li>Cotella, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+role+of+k%2B+channel+oxidation+in+Mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain.</a> The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).</li>
<li>Cai, S. Q., Sesti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+a+potassium+channel+causes+progressive+sensory+function+loss+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).</li>
<li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons%3A+a+new+family+of+chemosensory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).</li>
<li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li>
<li>Caserta, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q-VD-OPh%2C+a+broad+spectrum+caspase+inhibitor+with+potent+antiapoptotic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis+%3A+an+international+journal+on+programmed+cell+death%22%5BJournal%5D)">Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties.</a> Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).</li>
<li>Christensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).</li>
</ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Здесь мы опишем комбинированный подход, изучать клеточные и молекулярные аспекты amylopathies использованием C. Элеганс. Преимущества этого подхода включают: 1.) Низкая стоимость C.elegans поддерживается в нормальном чашку Петри засевают бактерии, при комнатной температуре. 2) Мощный генетики. Трансгенные животные могут быть получены в несколько месяцев, и широкий спектр последовательности промотора доступно для управления экспрессией нужного гена в определенных нейронах. 3) простые, хорошо характеризу...

Амилоида бета (Ар) представляет собой пептид из 36-43 аминокислот, которая образуется после последовательного расщепления белка-предшественника амилоида (APP) по β и γ секретазы 1. Γ секретазы обрабатывает C-конца пептида и отвечает за его переменной длины 5. Наиболее распространенными формами являются Ар Ар Ар 40 и 42, причем последний чаще ассоциируется к патологическим состояниям, таким как рекламы 5. При высоких концентрациях Ар форме β-листов для агрегации с образованием амилоидных фибрилл 6. Фибриллы депозиты являются основным компонентом старческих бляшек окружающих нейронов. Оба бляшек и диффузии, не доска олигомеров Ар, как полагают, являются основными формами патогенных Ар. Лаборатория исследования нейронной amylopathies осложняется тем фактом, что эти условия прогресса с течением времени. Поэтому важнымиT развиваться генетически послушный животных моделях, комплементарные к мышам-с коротким сроком службы. Эти модели могут быть использованы для выяснения конкретных аспектов обычно amylopathies-клеточном и молекулярном и в силу своей простоты, помогают уловить суть проблемы. Червь Caenorhabditis Элеганс водопада эту категорию. Он имеет короткий срок службы, ~ 20 дней, а в дополнение основных клеточных процессах, включая регуляцию экспрессии генов, белков торговли, нейронные связи, синаптогенезе, клеточной сигнализации и смерти подобны млекопитающих 7. Уникальные особенности червя включают в себя мощные генетика и отсутствие сосудистой системы, которая дает возможность изучить повреждения нейронов независимо от сосудистых повреждений. С другой стороны, отсутствие мозга ограничивает применение С. Элеганс к изучению многих аспектов нейродегенерацию. Кроме того, воспроизведение и идентификации анатомических распределения повреждений не может быть выполнена в этом организме. Другой пределобъема отнести сложность для оценки как различия в профили экспрессии генов и обесценения сложное поведение и функции памяти. Здесь мы опишем методы генерирования C. Элеганс моделей amylopathies.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. NGM</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>3 г</td></tr><tr><td>Бактериологический агар</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td>17 г</td></tr><tr><td>Бакто-пептон</td><td>AMRESCO</td><td>J636</td><td>2,5 г</td></tr><tr><td>Дистиллированная вода</td><td></td><td></td><td>Доведите до 975 мл</td></tr><tr><td colspan="4">Стерилизуется автоклавированием, затем добавьте следующие элементы и хорошо перемешайте</td></tr><tr><td>Сульфат</td> <td>магнияSigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>1 мл 1 М стока</td></tr><tr><td>Кальция хлорид</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>1 мл 1 М стока</td></tr><tr><td>Холестерин</td><td>Сигма-Олдрич</td><td>C3045</td><td>1 мл 5 мг/мл стока ( в этаноле)</td></tr><tr><td>Калий-фосфатный буфер</td><td></td><td></td><td>25 мл 1М стока</td></tr><tr><td colspan="4">2. Калийфосфатный буфер</сильный></td></tr><tr><td>Калийфосфат одноосновной</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>108,3 г</td></tr><tr><td>Калийфосфат двухосновной</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>35,6 г</td></tr><tr><td>Дистиллированная вода</td><td></td><td></td><td>Довести до 1 л</td></tr><tr><td colspan="4">Стерилизовано автоклавированием</td></tr><tr><td colspan="4">3. M9 буфер</сильный></td></tr><tr><td>фосфат калия одноосновной</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>3 г</td></tr><tr><td>Фосфат натрия двухосновной</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td>6 г</td></tr><tr><td>Хлорид натрия</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>5 г</td></tr><tr><td>Сульфат магния</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>1 мл 1 м бульона</td></tr><tr><td>Дистиллированная вода</td><td></td><td></td><td>Доведите до 1 л</td></tr><tr><td colspan="4">Стерилизовано автоклавированием</td></tr><tr><td colspan="4">4. Яйцевой буфер (рН 7,3, 340 мОсм)</сильный></td></tr><tr><td>Хлорид натрия</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>118 мМ</td></tr><tr><td>Хлорид калия</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>48 мМ</td></tr><tr><td>Хлорид кальция</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>2 мМ</td></tr><tr><td>Хлорид магния</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td>2 мМ</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td>25 мМ</td></tr><tr><td>Дистиллированная вода</td><td></td><td></td><td>Довести до 1 л</td></tr><tr><td colspan="4">Стерилизована автоклавированием</td></tr><tr><td colspan="4">5. CM-15</td></tr><tr><td>L-15 питательная среда</td><td>Gibco</td><td>11415</td><td>450 мл</td></tr><tr><td>Фетальная бычья сыворотка</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td>50 мл</td></tr><tr><td>Пенициллин</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>50 единиц/мл</td></tr><tr><td>стрептомицин</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>50 г/мл</td></tr><tr><td colspan="4">Отрегулируйте до 340 мОсм с сахарозой, затем стерильно отфильтруйте в автоклавные флаконы и храните при температуре 4&deg; C</td></tr><tr><td colspan="4">6. Другие реагенты</сильно></td></tr><tr><td>галокарбон 700 масло</td><td>галоуглерод продукты</td><td>9002-83-9</td><td></td></tr><tr><td>5 &mu; m Acrodisc Шприцевой фильтр</td><td>PALL Co.</td><td>4199</td><td></td></tr><tr><td>Хитиназа</td><td>Сигма-Олдрич</td><td>C6137-5УН</td><td></td></tr><tr><td>Лектин (арахис)</td><td>Сигма-Олдрич</td><td>L0881-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Гидроксид натрия</td><td>Fisher Scientific</td><td>S320</td><td></td></tr><tr><td>Лизин</td><td>Сигма-Олдрич</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>Биотин</td><td>Сигма-Олдрич</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Раствор</td> <td>гипохлорита натрияСигма-Олдрич</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>Азид</td><td>натрия Сигма-Олдрич</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>Сахароза</td><td>Сигма-Олдрич</td><td>S0389</td><td></td></tr></tbody></table>

<em&gt; caenorhabditis Элеганс</em&gt; Модельной системы для исследования amylopathy

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy это термин, который характеризует ненормальное синтез и накопление бета-амилоида (Ар) в тканях со временем. Ар является отличительной чертой болезни Альцгеймера (БА) и находится в деменцию с тельцами Леви, миозит включения тела и церебральной амилоидной ангиопатии 1-4. Amylopathies постепенно развиваются с течением времени. По этой причине простые организмы с короткой продолжительностью жизни может помочь выяснить молекулярные аспекты этих условий. Здесь мы описываем экспериментальных протоколов для изучения Ар-опосредованной нейродегенерацию помощью червя Caenorhabditis Элеганс. Таким образом, мы построим трансгенных червей путем инъекции ДНК, кодирующей человеческий Ар 42 в синцитиальный гонад взрослых гермафродитов. Трансформированных линий стабилизируются индуцированного мутагенеза интеграции. Нематоды возраста синхронизированы путем сбора и посева их яйца. Функции нейронов выражения Ар 42 испытывается в подходящее поведенческого анализа (хемотаксисас). Первичных нейронов культур, полученных из эмбрионов, которые используются для дополнения и поведенческие данные для проверки нейропротекторное действие антиапоптотических соединений.

С нашим протоколам, которые мы изучаем последствия человеческой Ар 42 олигомеров на функцию нейронов 8. Фрагмент, кодирующий человеческий Ар 42 и искусственные кодирующую последовательность сигнального пептида из своих вектор pPD50.52 амплифицировали из конструкции PCL12 9 с использованием праймеров, которые введены Sma один сайт эндонуклеазы рестрикции на концах. Затем фрагмент вставляется в конструкцию, содержащую 2481 п.н. FLP-6 последовательность промотора в pPD95...

Мы опишем методы для изучения аспектов amylopathies в червя<em&gt; C. Элеганс</em&gt;. Мы покажем, как построить червей, экспрессирующих человеческий Ар<sub&gt; 42</sub&gt; В нейронах и как проверить их функции в поведенческих тестах. Далее показано, как получить первичных нейронов культур, которые могут быть использованы для фармакологических испытаний.

<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Модельной системы для исследования Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Общая цель данной процедуры заключается в оценке влияния токсичности амилоида бета на функцию и выживаемость нейронов. Для этого сначала создают трансгенных червей C elegance, экспрессирующих пептид амилоида бета с GFP-репортером в сенсорных нейронах SE. Затем с помощью анализа хемотаксиса оценивают поведенческие последствия экспрессии амилоида бета в нейронах SE.Третьим этапом является получение первичных культур нейронов SE с последующей обработкой культивируемых нейронов фармакологическими агентами, такими как Q-V-D-O-P-H, для подавления токсического действия амилоид-бета. В конечном итоге результаты позволяют оценить влияние токсичности амилоид-бета на функцию и выживаемость нейронов SE с помощью поведенческих и фармакологических тестов. Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов нейродегенерации, например, в выяснении конкретных клеточных и молекулярных механизмов.Нейротоксические эффекты олигомеров бета-амилоида. Процедуры продемонстрирует доктор Зинг Дуан, постдок из моей лаборатории. Для трансформации требуются инъекционные подушечки из 2% агарозы. Поместите каплю горячей агарозы, растворенной в воде, на стеклянное покровное стекло, быстро накройте каплю вторым покровным стеклом и слегка постучите по нему.При приготовлении инъекционной смеси обязательно центрифугируйте ее и перенесите верхние 5 µL, очищенные от остатков тканей и других загрязнений, в чистую пробирку для загрузки. Наберите инъекционную смесь и пустой плазмид в инъекционную пипетку за счет капиллярного эффекта. Обычно 0,5 µL достаточно для инъекции 100 червей. Чтобы расширить отверстие в инъекционной пипетке, потрите ее кончик о край покровного стекла, закрепленного на предметном стекле в масле Halocarbon 700. Качество отверстия имеет критическое значение.Оценка производится по форме кончика и, что более важно, по скорости потока, которая определяется по самому потоку и по размеру пузырьков, образующихся на кончике пипетки под воздействием давления при инъекции. Теперь поместите каплю 700 hallow carbon oil на инъекционную подушечку и перенесите на нее несколько червей. С помощью инструмента для захвата червей (worm pick) прижмите их к подушечке, пока они не закрепятся на поверхности.Червяков следует расположить рядами так, чтобы их брюшные стороны были ориентированы в одну сторону. Избегайте прикосновений к их головам. Если после нескольких попыток червяки не прикрепляются к подушечке, используйте новую подушечку или увеличьте толщину или концентрацию агарозы в подушечке.Теперь введите пипетку в тело червя. Сначала переместите предметный столик, чтобы расположить червя под пипеткой. Затем установите пипетку рядом с центральным ядром гонады.Поскольку цитоплазма является общей для многих ядер половых клеток, это повышает вероятность передачи инъецированной ДНК потомству. Пипетка должна располагаться почти параллельно телу червя. В-третьих, перемещайте кончик вертикально к телу до тех пор, пока кожный покров не прогнется.Наконец, осторожно постучите по манипулятору, чтобы обеспечить введение кончиков. Теперь введите раствор ДНК. Нажимайте на пипетку до тех пор, пока гонада не увеличится в объеме.Затем прекратите подачу раствора и снимите червя с пипетки. Проверьте проходимость иглы, после чего проведите инъекции в остальные гонады, прежде чем переходить к следующему червю. После завершения инъекций добавьте червям около 10 µL восстанавливающего буфера и дождитесь, пока они начнут плавать.После того как черви начнут плавать, добавьте равный объем буфера M9. Когда черви снова начнут активно передвигаться, продолжайте добавлять M9, пока раствор не будет состоять преимущественно из M9. Затем перенесите каждого червя на чашку с агаром.Соберите червей GR в 1 мл буфера M9 в пробирке Falcon объемом 50 мл. Затем, используя буфер M9, промойте червей путем многократного центрифугирования и замены раствора до тех пор, пока буфер M9 не станет прозрачным после промывки. После этого добавьте к образцам 10 объемов базового раствора гипохлорита.Осажденных червей инкубируют при комнатной температуре до тех пор, пока примерно четыре пятых из них не разрушатся, что обычно занимает 10 минут. Контролируйте протекание реакции, отбирая аликвоты для осмотра под микроскопом. Остановите реакцию, добавив равный объем стерильного яйцевого буфера.Затем осадите яйца и трупы путем центрифугирования при 450 G в течение пяти минут. Осторожно удалите супернатант. Добавьте равный объем буфера для яиц и снова центрифугируйте пробирку при 450 G в течение пяти минут.Повторяйте процедуру до тех пор, пока буфер не станет прозрачным. Затем инкубируйте яйца в буфере M9 в течение ночи, а на следующий день высейте их на стандартные чашки с NGM-средой. Подготовьте несколько кубиков агара размером примерно полсантиметра с каждой стороны.Замочите кусочки агара в растворе с необходимым аттрактантом на два часа. Поместите кусочек агара в чашку Петри диаметром 10 см, в которой отмечены места для тестовой и контрольной точек. Подготовьте по пять таких чашек для каждого эксперимента.Оставьте планшеты на ночь при температуре 20 °C, чтобы сформировался химический градиент. Перед началом эксперимента добавьте по 10 µL 20 мМ азида натрия в каждую точку на планшетах. Это вещество будет служить в качестве анестетика.Начните эксперимент, поместив 20 червей синхронизированного возраста в центр чашки, затем поместите чашку в инкубатор при температуре 20 °C на один час. Через час подсчитайте количество животных на тестовых и контрольных участках и рассчитайте индекс CI. После лизиса червей gr и очистки яиц и трупов, как описано ранее, ресуспендируйте их в 2 мл стерильного буфера для яиц и добавьте 2 мл стерильного 60% раствора сахарозы в буфере для яиц.Затем перемешайте содержимое пробирки вручную или с помощью вортекса до полного ресуспендирования яиц. Центрифугируйте ресуспендированные яйца при 450 ×g в течение 15 минут. Затем осторожно соберите супернатант с яйцами, удалив осадок для избавления от остатков сахарозы, ресуспендируйте яйца в буфере для яиц и центрифугируйте их при 450 ×g в течение пяти минут.Осторожно соберите и удалите супернатант, затем повторите процесс очистки трижды в вытяжном шкафу. Для ресуспендирования осадка яиц используйте стерильный буфер для яиц, содержащий 1 unit/mL хитиназы. Оставьте яйца для переваривания при комнатной температуре на 30 минут, после чего начните наблюдать за реакцией с помощью инвертированного микроскопа для культур клеток.Когда от 70 до 80% яичной скорлупы будет переварено, добавьте пять миллилитров полной питательной среды L 15 или CM 15. Чтобы изолировать клетки, диссоциируйте их, пропустив несколько раз через иглу 27 калибра, чтобы предотвратить образование комков. Затем пропустите раствор через шприц с фильтром пять микрон.Осадите суспензию диссоциированных клеток путем центрифугирования при 450 G в течение 15 минут. Затем удалите супернатант и ресуспендируйте осажденные клетки в CM 15. Чтобы убедиться в том, что клетки диссоциированы, проверьте суспензию под микроскопом.Наконец, высейте диссоциированные клетки на предварительно покрытые стеклянные покровные стекла. При использовании арахисового лектина клетки могут поддерживаться при комнатной температуре на обычном воздухе более двух недель. С помощью описанных методов трансформации был создан трансгенный червь, экспрессирующий человеческий Beta 42 в нейронах a SE — нейронах, которые обнаруживают водорастворимые аттрактанты, такие как биотин, с помощью анализа хемотаксиса.Были протестированы семидневные трансгенные черви. Контрольные особи без труда находили биотин. Напротив, лишь немногие черви, экспрессирующие beta 42, смогли найти пятно с аттрактантом.Индекс хемотаксиса для биотина составил 0,68 по сравнению с 0,12 для контрольных и экспериментальных червей соответственно на третий-четвертый день. Также наблюдалось небольшое, но заметное снижение индекса. Культивируемый нейрон A SER на четвертый день, который все еще экспрессирует GFP спустя девять дней жизни.Однако флуоресценция GFP исчезла, в связи с чем для проверки данной гипотезы было высказано предположение об апоптозе. Первичные нейроны A SER были подготовлены согласно описанному методу и дополнены ингибитором каспаз широкого спектра действия. Как и ожидалось, обработка остановила потерю флуоресценции, подтвердив, что экспрессия человеческого A beta 42 вызывает апоптоз в нейронах A SER.После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать трансгенных червей, изучать их в поведенческих тестах и получать первичную культуру из Ambrose.

a-caenorhabditis-elegans-model-system-for-amylopathy-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Нейронауки

Интенсивно изучал нематод...

Опробование β-амилоида Токсичность использованием трансгенных С. Элеганс Модель

Чтобы изучить взаимосвязь между белковым гомеостазом, стрессом и старением, мы отслеживали изменения в сворачивании белка, отслеживая белковую дисфункцию, локализацию белка в клетке и стабильность белка на организменном, клеточном и белковом уровнях, используя генетически податливого многоклеточного Caenorhabditis elegans в качестве модельной системы.

Использование Caenorhabditis elegans в качестве модельной системы для изучения белкового гомеостаза в многоклеточном организме

Здесь мы представляем нематоды Caenorhabditis elegans как универсальный хост модель для изучения взаимодействия микроорганизмов.

Нематоды Caenorhabditis Elegans - универсальный в Vivo модель для изучения хост микробных взаимодействий

Этот протокол описывает метод для крупномасштабного культивирования Caenorhabditis elegans на твердых носителях. Как альтернатива культур в жидкой среде этот протокол позволяет получать параметры различных масштабах культивирования на основе плиты. Это увеличивает сопоставимости результатов, опустив морфологических и метаболические различия между жидких и твердых носителей культуры.

На основе плиты крупномасштабного культивирования Caenorhabditis elegans: Пробоподготовка для изучения метаболические изменения при сахарном диабете

Повторные не-ATG-зависимые трансляционные продукты являются патогенными особенностями нескольких повторных заболеваний, основанных на расширении. Цель описанного протокола заключается в оценке токсичности, вызванной этими пептидами с помощью поведенческих и клеточных анализов в модельной системе C. elegans.

Измерение токсичности пептида РАН в C. elegans

Здесь мы вводим и описываем широко доступные методологии с использованием некоторых универсальных моделей нематод, включая гиперактивированный ионный канал индуцированного некрозания и белоковой нейротоксичности, для мониторинга и вскрытия клеточных и молекулярных основ возрастных нейродегенеративных заболеваний.

Моделирование Возраст-ассоциированных нейродегенеративных заболеваний в Caenorhabditis elegans

Этот протокол описывает два чувствительных анализа для различения легких, умеренных и тяжелых двигательных нарушений у моделей бокового амиотрофического склероза C. elegans с общей полезностью для штаммов C. elegans с измененной подвижностью.

Оценка двигательных нарушений в моделях C. elegans бокового амиотрофического склероза

В этой статье мы показано, как использовать семиточечную систему подсчета баллов для последовательной количественной оценки изменений морфологии дендритов дофаминергических нейронов у C. elegans. Эта система предназначена для анализа дофаминергических нейродегенеративных анализов с использованием генетических, химических и возрастных моделей нейродегенеративных расстройств.

Количественная оценка уровней морфологического изменения и дегенерации дофаминергических нейронов у Caenorhabditis elegans

Здесь мы представляем протокол для оценки нейропротекторной активности тестовых соединений в Caenorhabditis elegans, включая агрегацию полиглутамина, гибель нейронов и поведение химиообнаружения, а также образцовую интеграцию нескольких фенотипов.

Caenorhabditis elegans как модельная система для обнаружения биологически активных соединений против полиглутамино-опосредованной нейротоксичности

Подходы к тестирования эффектов антипсихотических препаратов (APDS) в Caenorhabditis Элеганс демонстрируются. Анализы описаны для тестирования лекарственные эффекты на развитие и жизнеспособность и на скорости накачки глотки. Эти методы также применимы для экспериментов с фармакогенетических классов лекарственных средств, отличных от ЛФД.

Методы изучения механизмов действия антипсихотических препаратов в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Изучите методы оценки токсичности амилоид-бета на функции и выживаемость нейронов с использованием трансгенных Caenorhabditis elegans. Этот подход помогает исследовать механизмы нейродегенерации и тестировать нейропротективные препараты.

Больше видео