La ricostituzione di un canale Kv in membrane lipidiche per gli studi strutturali e funzionali

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire una descrizione dettagliata delle tecniche per lo studio funzionale e strutturale dell'effetto dei lipidi sulle proteine di membrana. Ciò si ottiene esprimendo e purificando prima il canale del potassio voltaggio-dipendente. Il secondo passo è la ricostituzione del canale ionico.

Successivamente, viene eseguita la registrazione elettrica dai canali ionici nei doppi strati lipidici per lo studio funzionale dei canali ionici. La fase finale è la cristallizzazione dei canali ionici nella membrana per la determinazione della struttura. In definitiva, i saggi biochimici, il metodo elettrofisiologico e lo studio cristallografico elettronico vengono utilizzati per studiare gli effetti lipidici sul movimento del sensore di tensione dei canali ionici.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa di molti dettagli tecnici nella ricostituzione delle proteine e nelle registrazioni biografiche. Speriamo che questo film, il processo ti aiuti a superare l'intera procedura e ad avere successo. La dimostrazione dell'intera procedura sarà eseguita dal Dr.Hui Jim del mio laboratorio.

Prima della preparazione dei lipidi c'era una provetta di vetro usa e getta da 14 millilitri, una provetta di vetro tenuta a vite e una siringa di vetro da 250 microlitri con cloroformio. Quindi trasferire 10 millilitri di cloroformio nella provetta. Per preparare i liposomi POPE e POPG, trasferire 3,75 milligrammi di POPE e 1,25 milligrammi di POPG in cloroformio nella provetta di vetro con tappo a vite.

Asciugare i lipidi sotto un flusso continuo di gas argon quando non è rimasto cloroformio visibile. Prova ulteriormente il lipide sotto il vuoto ambiente per un'ora. Quindi, aggiungi 440 microlitri di tampone a basso contenuto di sale o acqua nel vortice lipidico essiccato.

Il tubo per idratare i lipidi. La sospensione lipidica dovrebbe apparire biancastra e turride. Successivamente, sonicare la sospensione lipidica in un bagno ghiacciato fino a quando la soluzione della vescicola diventa traslucida.

Quindi, a 50 microlitri di cloruro di potassio a tre molari e 10 microlitri di 0,5 molari DM alla miscela in modo che la sospensione lipidica finale abbia 300 millimolari di cloruro di potassio e 10 millimolari di DM, incubare la soluzione in un rotatore per due ore a temperatura ambiente per consentire la formazione di cellule M miste di detergente lipidico. Dopo l'incubazione, la sospensione dovrebbe diventare un po' turidea a causa della fusione indotta dal detergente delle piccole vescicole ELLA. Quando la proteina è concentrata a più di due milligrammi per millilitro, aggiungere i componenti elencati, la miscela di detersivo lipidico per ottenere un millilitro di volume finale.

Quindi incubare la miscela di detersivo lipidico proteico nel tubo di vetro in un rotatore per altre due ore. La preparazione del KVAP in miscela con il detergente solubilizzato DTaP o DOGS, è simile alla preparazione lipidica per vescicola P-O-P-E-P-O-P-G. Tuttavia, la sonicazione dei lipidi idrati in piccole vescicole unsilicole richiede un tempo più lungo rispetto a quella dei lipidi P-O-P-E-P-O-P-G, le vescicole dei CANI possono fondersi lentamente tra loro e formare piccole goccioline oleose per solubilizzare completamente la dote o i CANI.

Le vescicole sonicate vengono miscelate con 10 millimolari di DM e 40 millimolari di beta og. La miscela di detergente lipidico viene incubata per una notte a temperatura ambiente e la miscela deve essere abbastanza limpida e non presentare piccole particelle o goccioline. Successivamente, mescola la proteina KVAP con il detersivo solubilizzato DTaP o DOGS in un rapporto proteine/lipidi inferiore o uguale a uno a 10.

La miscela lipidica detergente proteica viene lasciata incubare a temperatura ambiente per due o tre ore con rotazione orbitale continua. Per dimostrare la lenta rimozione dei detergenti che hanno CMC relativamente alto, come DM e Beta og. Per prima cosa preparare due litri di tampone per dialisi per ogni miscela da un millilitro.

Quindi ritagliare una lunghezza adeguata del tubo per dialisi e lavarlo con acqua deionizzata per controllare e assicurarsi che non vi siano perdite nel tubo. Quindi, caricare la miscela di detergente lipidico proteico nel tubo di dialisi. Clamp entrambe le estremità del tubo con uno spazio minimo rimasto sopra la soluzione.

Posizionare il tubo caricato su una piastra di agitazione nel tampone di dialisi in modo che ruoti lentamente in soluzione. Sostituire il tampone per dialisi una volta ogni otto ore. Ora prepara le perle di polistirolo per la rimozione dei detergenti che hanno un basso CMC con la prima ala 0,5 grammi di perline secche.

Quindi metterli in un tubo Corning da 50 millilitri e aggiungere 20 millilitri di metanolo, sonicare la soluzione in un bagno, sonicare per cinque minuti per rimuovere le bolle intrappolate e spendere sulle perle a 5, 000 RP per cinque minuti dopo, decantare completamente il metanolo e ripetere il lavaggio con etanolo e acqua milli Q. Quindi conservare le perle lavate in etanolo al 20% a quattro gradi Celsius e sostituirle con un tampone privo di detersivo prima dell'uso. Stimare la quantità di detergenti nella miscela di detersivo lipidico proteico da trattare e calcolare la quantità di perle necessarie per rimuovere i detersivi.

Pesare le perle bagnate senza eccesso di acqua e aggiungerle direttamente alla miscela proteica e attendere almeno 15-20 minuti affinché le perle siano completamente efficaci. Per rimuovere 8,7 milligrammi di DDM in un millilitro di soluzione, un totale di 87 milligrammi di perle di polistirene come le bio perline, SM due è diviso in cinque porzioni uguali. Mescolare la miscela di detersivo lipidico proteico con ciascuna frazione per 20-30 minuti con rotazione costante a temperatura ambiente.

Girare le perline, quindi trasferire il surnatante nella frazione successiva di perline e ripetere fino alla fine. In questa fase, inizia pulendo una provetta di vetro e una fiala di ambra con un tappo a vite con superficie in teflon e un set di siringhe di vetro con cloroformio. Quindi asciugare la fiala di ambra sotto un getto di gas argon.

Successivamente, trasferire 0,75 milligrammi di POPE e 0,25 milligrammi di POPG in cloroformio nella fiala di brace ed evaporare il cloroformio con gas argon. Successivamente, aggiungere 0,2 millilitri di pentano alla fiala per sciogliere i lipidi essiccati e asciugare completamente per rimuovere il cloroformio residuo. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di decano alla fiala per sciogliere il lipide essiccato.

Ora, dipingi il foro rotondo sulla superficie cilindrica della tazza a doppio strato con i lipidi senza far entrare alcuna soluzione lipidica nel foro. Attendere uno o due minuti affinché il decennio evapori completamente per eseguire registrazioni elettriche dai canali KVAP in lipidi a strati. Inserire la tazza nella camera di registrazione, inserire i ponti salini e collegare gli elettrodi ai due lati della tazza di registrazione.

Aggiungere la soluzione di cisti ai fori dell'elettrodo e la soluzione CYS e trans all'esterno e all'interno delle coppe della camera. Quindi regolare l'offset di potenziale tra due lati della tazza a meno di due millivolt, quindi dipingere il lipide attraverso il foro del tappo. Attendi che la membrana si assottigli e diventi relativamente stabile.

Non appena la membrana diventa stabile. Sparare da 0,5 a un microlitro di canale contenente vescicole posizionando l'estremità sottile di un puntale per pipetta P due proprio sopra il foro. Le vescicole cadono attraverso il foro fino al fondo della coppa.

Per testare i canali KVAP nel doppio strato. Un breve impulso di 80 millivolt viene erogato dal potenziale di mantenimento di meno 80 millivolt a causa della rapida inattivazione e del lento recupero da un'attivazione un lungo intervallo, circa 120 secondi per i canali nelle membrane PEPG viene dato tra due impulsi. Una volta che la corrente sembra di buone dimensioni, bilanciare le concentrazioni di ioni nelle soluzioni su entrambi i lati della membrana aggiungendo ulteriori sali ionici al lato a bassa concentrazione.

Ecco un'immagine di un cristallo 2D colorato negativamente, al centro dell'ottimizzazione del cristallo. I cristalli sono stati colorati con il 6% di moato di ammonio, pH 6,4 più 0,5% di triosio a causa dello zucchero che a volte si accumulavano l'uno con l'altro. La casella quadrata nera qui designa un'area che dà origine al modello di diffrazione con macchie di diffrazione.

Andando a circa 20 angstrom, ecco un'immagine cryo EM di un cristallo 2D da un campione simile a quello mostrato prima. Il campione è stato miscelato con 3% di TLO e congelato mediante immersione diretta e ripreso sotto un cryo EM a 50.000 mazzi. È chiaro che c'erano difetti locali nell'imballaggio del cristallo.

Ecco un'altra immagine cryo-EM di un cristallo ulteriormente ottimizzato. Il campione è stato incorporato in tannino allo 0,75% e al 10% di ciao d'albero, e l'immagine è stata scattata a 50.000 x. Le linee rette nell'impacchettamento stretto suggerivano che i canali fossero ben ordinati in questo tipo di cristalli, mentre le due frecce nere segnano i vettori quadrati.

Dopo aver visto questo video, spero che tu possa avere una buona idea su come gestire correttamente i lipidi e le proteine, e questo video spero ti aiuti a studiare le proteine lipidiche per agire in membrana in modo più efficiente.