Name: La ricostituzione di un canale Kv in membrane lipidiche per gli studi strutturali e funzionali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Scopri la ricostituzione di canali Kv in membrane lipidiche per studi strutturali e funzionali. Questo metodo consente analisi biochimiche, registrazioni elettriche e studi cristallografici di proteine di membrana.

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Gli studi sulla KvAP nel Jiang laboratorio hanno ottenuto un aiuto significativo dal laboratorio del Dr. Roderick MacKinnon presso la Rockefeller University. Un ringraziamento particolare va al Dott. Kathlynn Brown e Michael McQuire per i loro consigli e aiuto sui nostri esperimenti fago schermo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal NIH (GM088745 e GM093271 a Q-XJ) e AHA (12IRG9400019 a Q-XJ).

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La ricostituzione dei canali KvAP in diverse membrane è stata utilizzata in diversi studi 8-10. Seguendo l&#39;idea di garantire la distribuzione dei lipidi tra detergenti / lipide micelle miste e le proteine ​​/ detergente / lipide micelle miste, siamo in grado di raggiungere quasi completa ricostituzione del KvAP nelle membrane in molto differenti lipidi. Ogni canale KvAP tetramerica bisogno ~ 100 molecole lipidiche per coprire pienamente il suo dominio transmembrana. Il requisito essenziale è permettere mo...

Celle scambiare materiali e informazioni con l&#39;ambiente attraverso le funzioni delle proteine ​​di membrana specifici 1. Le proteine ​​di membrana nelle membrane cellulari funzionano come pompe, canali, recettori, enzimi intramembrane, linker e sostenitori strutturali attraverso le membrane. Le mutazioni che influenzano le proteine ​​di membrana sono stati legati a molte malattie umane. Infatti, molte proteine ​​di membrana sono stati gli obiettivi farmacologici primari perché sono importanti e facilmente accessibili nelle membrane cellulari. È quindi molto importante per comprendere la struttura e funzione di varie proteine ​​di membrana nelle membrane, e consentire di escogitare nuovi metodi per alleviare gli effetti negativi delle proteine ​​mutanti in malattie umane. Lipidi circondano tutte le proteine ​​di membrana integrati in doppi strati 2, 3. In membrane eucariotiche, i vari tipi di lipidi sono noti come organizzato in microdomini 4, 5.Molte proteine ​​di membrana sono stati mostrati essere distribuite tra questi microdomini nonché la fase fluida ingombrante di membrane 3, 6. Il meccanismo alla base l&#39;organizzazione dei microdomini e la consegna di proteine ​​di membrana in loro e il significato fisiologico di tali distribuzioni sono chiaramente importanti, ma rimangono poco conosciute. Una delle principali difficoltà tecnica a studiare gli effetti dei lipidi sulle proteine ​​di membrana è la ricostituzione affidabile di biochimicamente purificata proteine ​​di membrana nelle membrane di composizione lipidica ben controllati in modo che quasi tutte le proteine ​​ricostituite sono funzionali 7. Negli ultimi anni, abbiamo sviluppato metodi per ricostituire il prototipo di canale del potassio voltaggio-dipendente da A. Pernix (KvAP) nei vari sistemi a membrana per gli studi 8-10 strutturali e funzionali. I dati da altri e noi insieme hanno mostrato che i lipidi sono probabili un determinante nei cambiamenti conformazionali del rilevamento della tensionedomini di un canale e ionici voltaggio-dipendenti possono modellare le strutture di alcuni di questi canali 11. Nel prossimo, ci fornirà una descrizione dettagliata dei nostri metodi e offrirà suggerimenti tecnici critici che probabilmente garantire il successo riproduttivo dei nostri risultati, nonché l&#39;estensione dei nostri metodi per gli studi di altre proteine ​​di membrana.

<table><tbody><tr><td>Tryptone</td><td>RPI Corp.</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>RPI Corp.</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>RPI Corp.</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&#946;-D-Maltoside</td><td>Affymetrix</td><td>D322S</td><td>Sol-grade</td></tr><tr><td>n-Octyl-&#946;-D-Glucoside </td><td>Affymetrix</td><td>O311</td><td>Ana-grade</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>RPI Corp.</td><td>A20550-0.05</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>RPI Corp.</td><td>L22035-0.025</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatina A</td><td>RPI Corp.</td><td>P30100-0.025</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>13407000</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Bead SM-2</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>RPI Corp.</td><td>H75030</td><td></td></tr><tr><td>POPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td>DOGS</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870314C</td><td></td></tr><tr><td>DMPC </td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-DOPE </td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870282C</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>890890C</td><td></td></tr><tr><td>Perle di agarosio NeutrAvidin </td><td>Piercenet</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>Tubi per dialisi</td><td>Spectrum Laboratories, Inc</td><td>132-570</td><td></td></tr><tr><td>Pentano</td><td>Fisher</td><td>R399-1</td><td></td></tr><tr><td>Decano</td><td>TCI America</td><td>D0011</td><td></td></tr><tr><td>MTS-PEG5000</td><td>Toronto Research Cemicals</td><td>M266501</td><td></td></tr></tbody></table>

la ricostituzione di un canale kv in membrane lipidiche per gli studi strutturali e funzionali

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

Studiare l&#39;interazione proteina-lipide in modo riduttivo, è necessario incorporare le proteine ​​di membrana nelle membrane di composizione lipidica ben definita. Stiamo studiando gli effetti di gating lipidi-dipendenti in un potassio voltaggio-dipendenti (Kv) canale di prototipo, e abbiamo lavorato procedure dettagliate per ricostituire i canali in diversi sistemi a membrana. Nostre procedure ricostituzione tengono conto sia della fusione detergente indotta di vescicole e la fusione di proteina / detergente micelle con i lipidi / detergente micelle miste nonché l&#39;importanza di raggiungere una distribuzione di equilibrio di lipidi tra le proteine ​​/ detergente / lipidi e il detersivo / lipidi micelle miste. I nostri dati suggeriscono che l&#39;inserimento di canali nei vescicole lipidiche è relativamente casuale in orientamenti, e l&#39;efficienza di ricostituzione è così alto che non rilevabili aggregati proteici sono stati osservati in esperimenti di frazionamento. Abbiamo utilizzato il ricostituired canali per determinare gli stati conformazionali dei canali in differenti lipidi, registrare attività elettrica di un piccolo numero di canali incorporate in bistrati lipidici planari, schermo per ligandi conformazione-specifici da una libreria peptidica fago visualizzato, e sostenere la crescita dei cristalli 2D dei canali in membrane. Le procedure descritte qui di ricostituzione possono essere adeguati per lo studio di altre proteine ​​di membrana in doppi strati lipidici, in particolare per l&#39;indagine degli effetti dei lipidi sui canali ionici voltaggio-dipendenti eucariotiche.

Il flusso generale degli esperimenti per purificare il canale KvAP in omogeneità biochimica è descritto nella Figura 1A. Esempi tipici durante l&#39;espressione e la purificazione della proteina è mostrato nel gel SDS-PAGE in Figura 1B. La proteina dopo la purificazione IMAC è relativamente pura. La resa del canale KvAP è di circa 1,0 mg / Litro cultura. Solubilizzazione delle vescicole lipidiche con detergenti deve essere elaborato per ciascuna coppia di li...

Procedure per la ricostituzione completa di un canale del potassio voltaggio-dipendenti prototipo nelle membrane lipidiche sono descritti. I canali ricostituiti sono adatti per saggi biochimici, registrazioni elettriche, screening ligando e studi cristallografici di elettroni. Questi metodi possono avere applicazioni generali agli studi strutturali e funzionali di altre proteine ​​di membrana.

La ricostituzione di un canale Kv in membrane lipidiche per gli studi strutturali e funzionali

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è fornire una descrizione dettagliata delle tecniche per lo studio funzionale e strutturale dell'effetto dei lipidi sui proteini di membrana. Questo viene ottenuto innanzitutto esprimendo e purificando un canale del potassio attivato da voltaggio. Il secondo passaggio consiste nella recostituzione del canale ionico.Successivamente, viene effettuata la registrazione elettrica dai canali ionici in bicelle lipidiche per lo studio della funzionalità del canale ionico. L'ultimo passaggio consiste nella cristallizzazione dei canali ionici nella membrana per la determinazione della struttura. In definitiva, saggi biochimici, metodo elettrofisiologico e studio di cristallografia elettronica sono utilizzati per analizzare gli effetti dei lipidi sul movimento del sensore di voltaggio dei canali ionici.Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà a causa dei numerosi dettagli tecnici nella riconstituzione delle proteine e nelle registrazioni biofisiche. Speriamo che questo filmato vi aiuti a seguire l'intera procedura e a portarla a termine con successo. La dimostrazione dell'intero procedimento sarà eseguita dal Dott. Hui

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Ricostituzione di proteine ​​di membrana funzionale in liposomi giganti di composizione definita è un approccio efficace quando combinato con elettrofisiologia patch-clamp. Tuttavia, la produzione convenzionale di liposomi gigante può essere incompatibile con la stabilità della proteina. Descriviamo i protocolli per la produzione di liposomi giganti di lipidi puri o piccoli liposomi contenenti canali ionici.

Giant Preparazione liposomi per Immagini e di patch-clamp elettrofisiologia

La ricostituzione della proteina transmembrana, KvAP, in giganti vescicole unilamellari (GUVs) è dimostrato per due metodi di disidratazione, reidratazione - electroformation, e gonfiore gel assistita. In entrambi i metodi, piccole vescicole unilamellari contenenti la proteina sono fusi insieme per formare GUVs che possono poi essere studiate mediante microscopia a fluorescenza e patch-clamp elettrofisiologia.

Ricostituzione di una proteina transmembrana, la tensione gated canali ionici, KvAP, in Giant unilamellari vescicole per la microscopia e Patch Clamp Studies

Descritto qui è una procedura rapida ed efficace per la ricostituzione funzionale di purificato wild-type e proteina CFTR mutata che preserva l'attività per questo canale del cloro, che è difettoso in fibrosi cistica. Efflusso ioduro da proteoliposomi ricostituiti mediati da CFTR permette studi di attività di canale e gli effetti di piccole molecole.

Ricostituzione funzionale e attività Canale Misure di purificata di tipo selvatico e mutante CFTR proteine

Questo articolo descrive metodi specifici per ottenere biochimico quantità di detersivo-solubilizzato TRPV1 per analisi spettroscopica. I protocolli combinati forniscono strumenti biochimici e biofisici che possono essere adattati per facilitare studi strutturali e funzionali per canali ionici dei mammiferi in un ambiente controllato di membrana.

Purificazione e la ricostituzione di TRPV1 per analisi spettroscopiche

Questo protocollo descrive le tecniche utilizzate per determinare le strutture di canale ionico di cRIO-microscopia elettronica, compreso un sistema di baculovirus usato per esprimere in modo efficiente geni in cellule di mammiferi con minimo sforzo e tossicità, estrazione della proteina, purificazione, e controllo di qualità, preparazione del campione griglia e screening, nonché raccolta dati ed elaborazione.

Espressione e purificazione di TRPC3 la scanalatura del catione del lipido sensibili umani per determinazione strutturale di singola particella cRIO-microscopia elettronica

In questo manoscritto, dimostriamo le tecniche sperimentali per incapsulare il citoscheletro F-actina in vescicole lipidiche unilamellari giganti (chiamate anche liposomi) e il metodo per formare uno strato di F-actina che imita la corteccia nel foglietto interno della membrana liposomiale.

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La ricostituzione senza cellule è stata uno strumento chiave per comprendere l'assemblaggio del citoscheletro e il lavoro nell'ultimo decennio ha stabilito approcci per studiare la dinamica della settina in sistemi minimi. Qui sono presentati tre metodi complementari per osservare l'assemblaggio della settina in diversi contesti di membrana: doppi strati planari, supporti sferici e supporti per aste.

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Qui è descritta la procedura implementata nel gruppo membrana Caffrey Biologia Strutturale e Funzionale per impostare manualmente le prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesophases lipidico.

Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

Valutazione bidimensionale (2D) prove di cristallizzazione per la formazione degli array ordered proteine ​​di membrana è un compito molto critico e difficile in cristallografia elettroni. Qui si descrive il nostro approccio nello screening per l'individuazione e cristalli 2D di proteine ​​di membrana prevalentemente piccole nel range di 15 - 90kDa.

Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron

Dimostreremo come studiare l'effetto di una singola mutazione puntiforme sulla funzione di un canale ionico.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

Scopri la ricostituzione di canali Kv in membrane lipidiche per studi strutturali e funzionali. Questo metodo consente analisi biochimiche, registrazioni elettriche e studi cristallografici di proteine di membrana.

La ricostituzione di un canale Kv in membrane lipidiche per gli studi strutturali e funzionali

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