Cellula intera Patch Clamp per lo studio dei meccanismi di Infrared Stimolazione Neurale

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di produrre un sistema modello per studiare gli effetti dell'illuminazione laser a infrarossi sui neuroni uditivi in vitro. Ciò si ottiene mediante il patch clamping, neuroni uditivi in coltura nell'intera configurazione cellulare al fine di esplorare le loro caratteristiche elettriche. Successivamente, l'esposizione dei neuroni all'irradiazione laser può suscitare risposte elettriche nella cellula esposta, che possono essere misurate con una configurazione patch clamp.

I parametri di illuminazione e le variabili ambientali possono quindi essere variati per osservare i loro effetti sulle risposte elettriche indotte dal laser. I neuroni uditivi esposti alla luce laser mostreranno un'attività elettrica ripetibile in risposta a ciascun impulso laser per un'analisi successiva. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sui meccanismi alla base della stimolazione infrarossa dei neuroni gangliari spirali.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla stimolazione infrarossa delle cellule gangliari a spirale in particolare, può anche essere esteso ad altri tipi di cellule o modelli semplificati come i doppi strati lipidici per chiarire ulteriormente i processi fisici coinvolti. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante per garantire un posizionamento accurato della fibra ottica di erogazione della luce, poiché l'esposizione alla radianza risultante è un parametro critico, Hanno preparato micro pipette di registrazione con una resistenza da due a sei mega ohm. Possono essere estratti dal vetro silicato preso in prestito con un estrattore laser CO2.

Preparare il laser accoppiato in fibra. Una vasta gamma di fibre ottiche funzionerà. Il taglio a metà di una fibra in una configurazione con cavo patch con connettori FCPC produce due collegamenti di fibra con un connettore a un'estremità e una fibra esposta all'altra estremità.

Queste sono le trecce. Preparare la punta d'orso di un codino rimuovendo il rivestimento in fibra, pulendo con etanolo e fendendo con uno strumento appropriato al microscopio. Verificare che la punta sia perpendicolare all'asse della fibra e che appaia piatta.

Se necessario, collegare l'altra estremità del codino in fibra all'uscita del laser di stimolazione utilizzando un connettore passante appropriato. A questo punto, assicurati sempre di misurare la potenza del laser in uscita dalla fibra. Fallo anche dopo ulteriori manipolazioni della punta.

A questo punto inserire la fibra in un mandrino e fissare il mandrino all'apposito micro posizionatore. Quindi, determinare l'angolo che la fibra ottica forma con un vetrino coprioggetti. Scatta una fotografia della disposizione e calcola l'angolo utilizzando l'immagine J.Ora, assicurati le connessioni che sincronizzano il laser con il sistema di acquisizione dati patch clamp.

L'uscita digitale del sistema di acquisizione dati patch clamp deve essere collegata al laser tramite un generatore di funzioni esterno, consentendo di specificare i parametri dell'impulso laser indipendentemente dal sistema di acquisizione dati, il segnale utilizzato per attivare il laser deve essere ricollegato a un ingresso del sistema di acquisizione dati per garantire che la temporizzazione e la lunghezza degli impulsi laser possano essere registrate contemporaneamente al segnale elettrofisiologico, Impostare la portata del sistema di perfusione tra uno e due millilitri al minuto. Funzionerà un sistema alimentato a gravità con un riscaldatore in linea per il riscaldamento rapido della soluzione e una pompa peristaltica per rimuovere la soluzione esaurita mediante aspirazione. Bene. Posizionare un vetrino coprioggetti con cellule coltivate nella camera di registrazione di un microscopio verticale utilizzando un obiettivo ad immersione in acqua ad alto ingrandimento e contrasto di fase, individuare un neurone ganglio a spirale.

Un tipico neurone gangliare a spirale è in fase rotondo brillante e ha un diametro di circa 15 micron con un nucleo prominente. Una volta individuato un neurone adatto, passa a un obiettivo a ingrandimento inferiore e individua il neurone bersaglio. Quindi utilizzare il micro posizionatore per spostare la fibra ottica fino a quando la punta non è vicina al neurone bersaglio sia sul piano orizzontale che su quello verticale.

Torna all'obiettivo ad alto ingrandimento e posiziona la punta della fibra ottica nella posizione prevista accanto al neurone. Quando si regola la posizione verticale della fibra, è importante che il bordo inferiore della fibra poggi sul labbro di copertura. Per ridurre al minimo l'incertezza nella posizione della fibra, il punto di contatto può essere identificato da segnali visivi nell'immagine del microscopio.

Una volta che la fibra è in posizione, spostarla di una quantità nota lungo il suo asse longitudinale in modo da non influire sul posizionamento della micropipetta. La micropipetta deve essere riempita con soluzione intracellulare e inserita saldamente in posizione sullo stadio principale dell'amplificatore. Utilizzando un tubo collegato al lato del supporto del microelettrodo, applicare una piccola quantità di pressione positiva per evitare l'intasamento della micropipetta.

Utilizzando un manipolatore microm, spostare la micropipetta in posizione appena sopra il neurone bersaglio e procedere con la realizzazione di un sigillo giga ohm. Registra la resistenza in serie della capacità della membrana e la resistenza di ingresso determinate dalla curva esponenziale adattata alla corrente. Durante l'impulso di prova della tenuta.

Riduci al minimo il transitorio di capacità regolando i controlli CP fast e CP slow sull'amplificatore. Quindi commutare l'amplificatore in modalità cella intera e modificare la capacità e la compensazione della resistenza fino a quando non si osserva una corrente piatta durante il test SEAL. Successivamente, applicare la compensazione della resistenza in serie con circa il 70% di correzione, il 70% di previsione, regolando la capacità e i controlli di compensazione della resistenza per mantenere una risposta piatta della tenuta di prova.

Quindi portare l'amplificatore in modalità pinza amperometrica. Prendere nota del potenziale di membrana a riposo in assenza di iniezione di corrente. Impostare ora una corrente di mantenimento per stabilizzare il potenziale della membrana al livello desiderato.

Neutralizzare la capacità della pipetta e regolare il bilanciamento del ponte per bilanciare la caduta di tensione. Controllare le proprietà di attivazione del neurone stimolando con corrente depolarizzante. A questo punto, spostare la fibra ottica in posizione accanto al neurone utilizzando un software di imaging accoppiato a una telecamera CCD per acquisire immagini focalizzate inizialmente sul piano del neurone e poi focalizzate sul bordo superiore della fibra ottica.

Analizza le immagini per determinare il valore delta, che è la posizione del bordo superiore della fibra ottica rispetto al centro del neurone bersaglio. È molto importante conoscere con precisione la posizione della fibra ottica. Questo perché l'energia per unità, area o esposizione alla radianza fornita alla cellula bersaglio è un parametro critico per la stimolazione neurale a infrarossi e questo può essere influenzato in modo significativo dalla posizione della fibra rispetto alla cellula.

La potenza ottica di questo laser è controllata dal computer tramite un ingresso diretto al laser e può essere specificata manualmente prima di ogni registrazione. La lunghezza dell'impulso e la frequenza di ripetizione possono essere controllate tramite il generatore di funzioni come descritto in precedenza, assicurarsi che i dati vengano registrati sia dal canale di patch clamp che dal canale di trigger laser da mezzo a 15 millisecondi a impulsi laser da 0,25 a cinque. I millijoule in genere producono risposte elettriche misurabili. Inizialmente.

Può essere utile impostare la frequenza di ripetizione degli impulsi laser su un hertz o meno per ridurre al minimo gli effetti indesiderati. Una volta impostati tutti i parametri del laser. Procedere con la raccolta dei dati.

I neuroni gangliari a spirale rispondono all'illuminazione laser con forme d'onda ripetibili sia in voltage clamp che in current clamp Registrazione delle configurazioni in risposta a impulsi laser da 2,5 millisecondi e 0,8 millijoule. Una cella tipica produce una corrente netta verso l'interno a vari potenziali di mantenimento. Le registrazioni del current clamp mostrano una costante depolarizzazione della membrana nel corso di questi impulsi laser, seguita da una diminuzione approssimativamente esponenziale verso il potenziale di membrana a riposo dopo l'impulso.

In alcuni casi, c'è anche una piccola depolarizzazione aggiuntiva della membrana dopo l'impulso laser. L'illuminazione con energia eccessiva o l'esposizione a forti aumenti di temperatura possono causare danni alle celle osservati attraverso il deterioramento delle proprietà elettriche delle celle o la morte istantanea delle celle. Seguendo questa procedura, è possibile variare una serie di parametri ambientali come la temperatura della soluzione o fattori chimici per testare l'effetto di questi sull'attività elettrica indotta dal laser.

Non dimenticare che lavorare con i laser può essere pericoloso e che è necessario mettere in atto le precauzioni di sicurezza standard. Questi includono l'uso di occhiali di sicurezza laser, segnali di avvertimento e assicurarsi che il raggio non si intersechi involontariamente con superfici altamente riflettenti.