RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere ( Apis mellifera)

Questo protocollo video dimostra nuove tecniche per abbattere simultaneamente due geni nelle api adulte e quindi condurre una risposta di estensione probos o un test PER per misurare l'effetto del doppio knockdown genico. Sulla percezione gustativa delle api. Ciò si ottiene sintetizzando prima gli RNA a doppio filamento, prendendo di mira i geni per tre proteine, vitelli, genina, ultras, sferica e a fluorescenza verde.

Poiché il gene che codifica per la GFP non si trova nel genoma dell'ape, l'RNA a doppio filamento GFP funge da controllo negativo. Il secondo passo consiste nell'iniettare l'RNA a doppio filamento nelle api mellifere utilizzando quattro strategie di trattamento. Iniezione con GFP a doppio filamento, solo RNA, una singola iniezione con un VG e USP a doppio filamento, iniezione di miscela di RNA con RNA a doppio filamento vg il primo giorno, seguita da iniezione con RNA a doppio filamento USP il secondo giorno e iniezione con RNA a doppio filamento USP il primo giorno, seguita da iniezione con RNA a doppio filamento VG il secondo giorno dopo le iniezioni ha contrassegnato le api con punti di vernice codificati a colori corrispondenti ai trattamenti e li ha reimmessi in un alveare.

Sei giorni dopo, il knockdown dei geni VG e USP nelle api trattate viene convalidato mediante PCR in tempo reale e l'effetto del doppio knockdown di VG e USP sulla percezione gustativa è determinato dal test PER. In definitiva, è stato dimostrato che le api double knockdown hanno riduzioni significative dell'espressione dei geni VG e USP e aumenti significativi della percezione gustativa del saccarosio. La nostra interferenza è uno strumento potente che possiamo usare per rivelare le funzioni dei geni.

In genere viene utilizzato per colpire un singolo gene. Tuttavia, i geni fanno parte di una complessa rete regolatoria. Un modo per comprendere meglio qualsiasi processo biologico è imparare come i geni interagiscono con la rete genica.

Per fare questo, dobbiamo manipolare più geni contemporaneamente. Fino ad ora, siamo stati in grado di sorprendere solo un gene alla volta negli insetti qui per la prima volta, vogliamo mostrarvi come abbattere due G nelle api mellifere invece di una. Il riflesso di estensione SCUs o PER è una tecnica molto utile per misurare la percezione gustativa, che è un predittore comportamentale per il comportamento sociale delle api.

Ad esempio, le api nidificano con un'elevata percezione gustativa, maturano rapidamente dal punto di vista comportamentale, si forgiano presto nella vita e preferiscono raccogliere il polline. Per iniziare questa procedura, progettare primer di RNA a doppio filamento che mirano ai geni per il knockdown utilizzando il primer del software gratuito. Tre. In questo esperimento, i due geni bersaglio per il knockdown sono vitelli, genin o VG e ultras sferico o USP.

Oltre alla progettazione VG e USP, primer di RNA a doppio filamento hanno come bersaglio un gene di controllo che codifica per la proteina della fluorescenza verde, o GFP, che non si trova nel genoma dell'ape mellifera. Successivamente a doppio filamento. La sintesi dell'RNA per VG, USP e GFP è ottenuta mediante trascrizione in vitro utilizzando il sistema di produzione di RNA rib max T seven di Promega.

Dopo aver purificato gli RNA a doppio filamento utilizzando le procedure standard, sciogliere ogni pellet di RNA a doppio filamento in acqua priva di nucleasi al fine di garantire l'efficacia della sottoregolazione genica, la concentrazione di RNA a doppio filamento dovrebbe essere compresa tra nove e 10 microgrammi per microlitro. Per preparare le api per l'iniezione raffreddare, le api appena emerse in un frigorifero a quattro gradi Celsius per uno o due minuti. Una volta che le api sono immobilizzate, monta tre o quattro api in parallelo su piastre di Petri piene di cera solida con spilli di insetti incrociati tra l'addome e il torace.

Raffredda di nuovo le api in un frigorifero a quattro gradi Celsius per circa uno o due minuti. Assicurati che le api siano completamente immobili. Le api dovrebbero apparire sciolte, non arricciate o contorte.

L'immobilizzazione completa è importante in quanto qualsiasi movimento potrebbe aumentare le dimensioni della ferita e la mortalità. Le api arricciate o contorte sono state raffreddate troppo a lungo e non dovrebbero essere utilizzate a causa dell'elevata mortalità. Metti un ago monouso calibro 30 su una micro siringa Hamilton.

Riempi la siringa con tre microlitri di RNA a doppio filamento e assicurati che non ci siano bolle d'aria nella siringa. Se viene utilizzata una singola strategia di iniezione, la siringa viene riempita con una miscela degli RNA a doppio filamento dei due geni. Se viene utilizzata una strategia di iniezione a due giorni, la siringa viene riempita con uno dei due RNA a doppio filamento.

Inserire l'ago in un lato dell'addome. Per evitare di danneggiare gli organi interni, premere lentamente lo stantuffo della siringa per consentire l'assorbimento dell'RNA a doppio filamento. Poiché l'RNA a doppio filamento è molto viscoso, ci vogliono due o tre secondi per espellerlo completamente dalla siringa.

Dopo aver spinto completamente verso il basso lo stantuffo, lasciare l'ago nella ferita per quattro o cinque secondi. Osservare le api per tre-cinque secondi dopo le iniezioni. Se una gocciolina di emolinfa fuoriesce dalla ferita, scartare l'ape, segnare il torace delle api con colori diversi corrispondenti a diversi trattamenti.

A questo punto, se si utilizza la strategia della singola iniezione, osservare le api per un'ora in un contenitore con il miele fornito, quindi rimetterle in una colonia. Tuttavia, se viene utilizzata la strategia di iniezione a due giorni ed è stato iniettato solo il primo RNA a doppio filamento, posizionare le api in una gabbia a rete cilindrica con il miele fornito sul lato. Conserva le api in un'incubatrice a 34 gradi Celsius e 80% di umidità durante la notte del giorno successivo.

Iniettare nelle stesse api il secondo RNA a doppio filamento, utilizzando la stessa procedura del primo RNA a doppio filamento. Lasciate riposare le api a temperatura ambiente per un'ora in un contenitore con il miele in dotazione, quindi introducetele in una colonia. Sei giorni le iniezioni raccolgono le api trattate dalla colonia senza l'uso di un affumicatore per aprire l'alveare.

Il fumo non viene utilizzato perché potrebbe influenzare la percezione gustativa delle api, che verrà testata in questa procedura. Raccogli le api in gabbie cilindriche in rete metallica usando una pinza morbida con non più di tre api per gabbia per montare le api. Per il test PER.

Raffredda le api a quattro gradi Celsius fino a quando non sono completamente immobilizzate. Monta ogni ape verticalmente in un tubo di plastica, appositamente progettato per la PER. Usa del nastro adesivo per mantenere l'addome all'interno del tubo e mantenere la testa che sporge dal tubo.

Mettere le provette su una griglia con due file di piccole colonne di plastica. Una riga è numerata in modo che alle api montate possa essere assegnato un numero ID. Metti le rastrelliere con le api trattate in un'incubatrice a 34 gradi Celsius e 80% di umidità per due ore mentre le api sono in incubazione.

Preparate una serie di saccarosio. Soluzioni acquose. Caricare le soluzioni in siringhe con aghi da 15 a 20 gauge per il test PER.

Le api vengono testate in gruppi. Per prima cosa tocca l'antenna di ogni ape con una goccia di soluzione allo 0%, che è acqua dopo quel test con 0,1%0,3%1%3%10% e 30% di saccarosio. Soluzioni acquose lasciando almeno due minuti per l'intervallo tra ciascuna soluzione.

Di solito ci vogliono circa due minuti per testare 20 api utilizzando una concentrazione di saccarosio. Pertanto, dovrebbero esserci sempre più di 20 api in ogni gruppo. Se un'ape estende completamente il suo probo, viene conteggiata una risposta positiva. In tempo reale.

L'analisi PCR ha confermato che entrambe le strategie di iniezione singola e di iniezione di due giorni hanno ridotto significativamente i livelli di trascrizione delle Fiji e dell'USP nelle api. Sei giorni dopo l'iniezione dell'RNA a doppio filamento in questi grafici, l'RQ indica il livello di quantificazione relativa dei trascritti del gene bersaglio e le diverse lettere sopra le barre denotano differenze significative tra i gruppi di trattamento. L'analisi post-talk ha rivelato che la soppressione del trascritto USP utilizzando l'iniezione singola con una miscela di RNA a doppio filamento e l'iniezione di due giorni con VG prima e USP poi era significativamente inferiore rispetto all'iniezione di due giorni con USP prima e VG dopo.

Ciò indica che il VG può essere un regolatore primario nel ciclo di regolazione del VG e degli ormoni giovanili. I punteggi GUA a risposta o GRS per le api trattate sono stati calcolati dai risultati della risposta di estensione probos o del test PER, come mostrato qui. Il GRS nelle api a cui è stata iniettata la miscela di RNA a doppio filamento VG e USP era significativamente più alto del GRS nelle api di controllo GFP, indicando che le api a doppio knockdown erano più sensibili al saccarosio.

Le diverse lettere sopra le barre denotano differenze significative tra i gruppi di trattamento. Qui viene mostrata una possibile rete regolatoria tra gli ultras vigenini, gli ormoni sferici e giovanili rivelata sopprimendo simultaneamente i geni VG e USP. Mentre un singolo knockdown USP non induce alcun cambiamento nell'ormone giovanile, un doppio knockdown di VG e USP provoca un aumento maggiore dell'ormone giovanile rispetto a un singolo knockdown VG.

Ciò suggerisce che il vitelli non solo inibisce la produzione di ormoni giovanili, ma inibisce una risposta di feedback dell'ormone giovanile al knockdown dell'USP. Nei doppi knockdown, il drammatico aumento della produzione di ormoni giovanili deriva da una ridotta inibizione della genina VI causata dal knockdown del VG e da una risposta compensatoria a una ridotta trasduzione dell'ormone giovanile causata dal knockdown dell'USP. Una discussione più dettagliata di questa rete di regolamentazione si trova nel testo del protocollo allegato.

Utilizzando l'approccio del knockdown a doppio gene, abbiamo rivelato una relazione dettagliata tra ormone genico vitale, ultras, sferico e giovanile, che non avremmo scoperto sopprimendo un solo gene. Ora, utilizzando questa tecnica, i ricercatori possono esplorare l'interrelazione tra i geni all'interno delle reti regolatorie. Il PR è un metodo standard utilizzato per misurare la percezione gustativa Nelle api mellifere, tuttavia, è molto sensibile alla manipolazione, quindi bisogna stare molto attenti quando si mantengono le coerenze tra l'ambiente e la manipolazione degli animali.

Inoltre, se il saggio deve essere eseguito nell'arco di diversi giorni, è una buona idea mantenere una sequenza temporale breve e tenere d'occhio per assicurarsi che il tempo e l'ambiente non cambino.