RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere (

Questo protocollo video illustra tecniche innovative per silenziare contemporaneamente due geni in api mellifere adulte e successivamente eseguire un saggio di risposta all'estensione del probo o PER, per misurare l'effetto del doppio silenziamento genico sulla percezione gustativa delle api. Ciò viene realizzato sintetizzando innanzitutto RNA a doppio filamento, mirati ai geni che codificano per tre proteine: vitellogeni, ultraspiracolo e proteina verde fluorescente.

Dal momento che il gene che codifica per la GFP non è presente nel genoma dell'ape mellifera, l'RNA a doppio filamento della GFP funge da controllo negativo. Il secondo passaggio consiste nell'iniettare l'RNA a doppio filamento nelle api mellifere utilizzando quattro strategie di trattamento. Le iniezioni vengono effettuate con RNA a doppio filamento della GFP, con RNA a doppio filamento da solo, con un'iniezione singola di una miscela di RNA a doppio filamento di VG e USP, con un'iniezione di RNA a doppio filamento di vg al primo giorno seguita da un'iniezione di RNA a doppio filamento di USP al secondo giorno, e con un'iniezione di RNA a doppio filamento di USP al primo giorno seguita da un'iniezione di RNA a doppio filamento di VG al secondo giorno. Dopo le iniezioni, le api vengono marcate con puntini di vernice colorata corrispondenti ai trattamenti e rimesse nell'alveare.

Sei giorni dopo, l'abbassamento dell'espressione dei geni VG e USP nelle api trattate viene confermato mediante PCR in tempo reale e l'effetto della doppia interferenza su VG e USP sulla percezione gustativa viene determinato tramite il saggio PER. In definitiva, si osserva che le api sottoposte alla doppia interferenza mostrano riduzioni significative nell'espressione dei geni VG e USP e aumenti significativi nella percezione gustativa del saccarosio. La nostra interferenza rappresenta uno strumento potente che può essere utilizzato per rivelare le funzioni geniche.

Viene tipicamente utilizzato per mirare un singolo gene. Tuttavia, i geni fanno parte di una rete regolatoria complessa. Un modo per comprendere meglio qualsiasi processo biologico consiste nell'apprendere come i geni interagiscono con la rete genica.

Per fare ciò, dobbiamo manipolare contemporaneamente più geni. Fino ad ora, siamo stati in grado di silenziare un solo gene alla volta negli insetti; qui per la prima volta, vogliamo mostrarvi come inattivare due geni nelle api mellifere anziché uno solo. Il riflesso di protrusione del carpo (PER, dall'inglese *proboscis extension reflex*) è una tecnica molto utile per misurare la percezione gustativa, che rappresenta un indicatore comportamentale del comportamento sociale delle api mellifere.

Ad esempio, le api dei nidi con elevata percezione gustativa maturano precocemente dal punto di vista comportamentale, iniziano a foraggiarsi precocemente nella vita e preferiscono raccogliere polline. Per iniziare questa procedura, progettare primer per RNA a doppio filamento mirati ai geni da silenziare utilizzando il software gratuito Primer.Three. In questo esperimento, i due geni bersaglio del silenziamento sono vitelli, genin o VG e ultras sferico o USP.

Oltre al disegno di VG e USP, vengono utilizzati primer di RNA a doppio filamento che bersaglia un gene di controllo codificante per la proteina fluorescente verde, o GFP, che non è presente nel genoma dell'ape mellifera. Successivamente, la sintesi di RNA a doppio filamento per VG, USP e GFP viene effettuata mediante trascrizione in vitro utilizzando il sistema di produzione di RNA rib max T seven della Promega.

Dopo aver purificato gli RNA a doppio filamento utilizzando procedure standard, sciogliere ogni pellet di RNA a doppio filamento in acqua priva di nucleasi per garantire l'efficacia della silenziamento genico; la concentrazione di RNA a doppio filamento dovrebbe essere di circa nove-dieci microgrammi per microlitro. Per preparare le api all'iniezione, raffreddare le api appena emerse in un refrigeratore a quattro gradi Celsius per uno-due minuti. Una volta immobilizzate le api, fissarne tre-quattro in parallelo su piastre di Petri piene di cera solida, utilizzando spilli da entomologia incrociati tra l'addome e il torace.

Raffreddare nuovamente le api in un frigorifero a quattro gradi Celsius per circa uno o due minuti. Assicurarsi che le api siano completamente immobili. Le api devono apparire rilassate, non arrotolate o contorte.

L'immobilizzazione completa è importante perché qualsiasi movimento potrebbe aumentare le dimensioni della ferita e la mortalità. Le api che sono arrotolate o contorte sono state raffreddate troppo a lungo e non devono essere utilizzate a causa dell'elevata mortalità. Montare un ago monouso da 30 gauge su una siringa micro-Hamilton.

Riempire la siringa con tre microlitri di RNA a doppio filamento e assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella siringa. Se si utilizza una strategia di iniezione singola, la siringa viene riempita con una miscela degli RNA a doppio filamento dei due geni. Se si utilizza una strategia di iniezione su due giorni, la siringa viene riempita con uno dei due RNA a doppio filamento.

Inserire l'ago su un lato dell'addome. Per evitare di danneggiare gli organi interni, premere lentamente lo stantuffo della siringa per consentire l'assorbimento dell'RNA a doppio filamento. Poiché l'RNA a doppio filamento è molto viscoso, occorrono due o tre secondi per espellerlo completamente dalla siringa.

Dopo aver completamente spinto lo stantuffo, lasciare l'ago nella ferita per quattro o cinque secondi. Osservare le api per tre o cinque secondi dopo le iniezioni. Se una goccia di emolinfa fuoriesce dalla ferita, scartare l'ape e contrassegnare il torace delle api con colori diversi corrispondenti ai diversi trattamenti.

A questo punto, se si utilizza la strategia di iniezione singola, osservare le api per un'ora in un contenitore con miele fornito, quindi rimetterle all'interno di un allevamento. Tuttavia, se si utilizza la strategia di iniezione di due giorni e se è stato iniettato solo il primo RNA a doppio filamento, collocare le api in una gabbia cilindrica con rete metallica, fornendo miele lateralmente. Mantenere le api in un incubatore a 34 gradi Celsius e umidità dell'80% per tutta la notte nel giorno successivo.

Iniettare le stesse api con il secondo RNA a doppio filamento, utilizzando la stessa procedura impiegata per il primo RNA a doppio filamento. Lasciare che le api si riprendano per un'ora a temperatura ambiente in un contenitore con disponibilità di miele, quindi introdurle in un alveare. Sei giorni dopo le iniezioni, prelevare le api trattate dall'alveare senza utilizzare l'affumicatore per aprire l'arnia.

Il fumo non viene utilizzato perché potrebbe alterare la percezione gustativa delle api, che verrà testata in questa procedura. Raccogliere le api in gabbiette cilindriche in rete metallica utilizzando pinzette morbide, con non più di tre api per gabbia, per fissare le api. Per il test PER.

Raffreddare le api a quattro gradi Celsius finché non sono completamente immobilizzate. Montare ogni ape verticalmente in un tubo di plastica, appositamente progettato per il PER. Utilizzare del nastro adesivo per mantenere l'addome all'interno del tubo e lasciare la testa fuoriuscire dal tubo.

Posizionare i tubi su un supporto con due file di piccole colonne di plastica. Una fila è numerata in modo che alle api montate possa essere assegnato un numero identificativo. Collocare i supporti con le api trattate in un incubatore a 34 gradi Celsius e 80% di umidità per due ore, mentre le api sono in incubazione.

Preparare una serie di soluzioni acquose di saccarosio. Caricare le soluzioni in siringhe con aghi da 15 a 20 gauge per il saggio PER.

Le api vengono testate in gruppi. Toccare innanzitutto l'antenna di ciascuna ape con una goccia di soluzione allo 0%, che è acqua, quindi procedere con le soluzioni allo 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% e 30% di saccarosio. Utilizzare soluzioni acquose, prevedendo un intervallo di almeno due minuti tra ciascuna soluzione.

Di solito occorrono circa due minuti per testare 20 api utilizzando una singola concentrazione di saccarosio. Pertanto, ogni gruppo dovrebbe sempre contenere più di 20 api. Se un'ape estende completamente il proprio rostro, si registra una risposta positiva in tempo reale.

L'analisi PCR ha confermato che entrambe le strategie, ovvero l'iniezione singola e quella di due giorni, hanno ridotto in modo significativo i livelli dei trascritti di Fiji e USP nelle api mellifere. Sei giorni dopo l'iniezione di RNA a doppio filamento, nei grafici riportati, il valore RQ indica il livello di quantificazione relativa dei trascritti del gene bersaglio e le diverse lettere sopra le barre indicano differenze significative tra i gruppi trattati. L'analisi post hoc ha rivelato che la soppressione del trascritto di USP ottenuta mediante l'iniezione singola con una miscela di RNA a doppio filamento e l'iniezione di due giorni con VG per primo e USP per secondo è risultata significativamente inferiore rispetto all'iniezione di due giorni con USP per primo e VG per secondo.

Ciò indica che VG potrebbe essere un regolatore primario nel circuito di regolazione di VG e dell'ormone giovanile. I punteggi di risposta GUA o GRS per le api trattate sono stati calcolati dai risultati del test di risposta all'estensione del probo scio, o saggio PER, come mostrato qui. Il GRS nelle api che sono state iniettate con una miscela di RNA a doppio filamento di VG e USP è risultato significativamente più alto rispetto al GRS nelle api controllo GFP, indicando che le api con doppio silenziamento erano più sensibili al saccarosio.

Le diverse lettere sopra le barre indicano differenze significative tra i gruppi di trattamento. Qui viene mostrata una possibile rete regolatoria tra vi genin ultras, sferica e ormone giovanile rivelata dalla soppressione simultanea dei geni VG e USP. Mentre un silenziamento singolo di USP non induce alcun cambiamento nell'ormone giovanile, un doppio silenziamento di VG e USP provoca un aumento maggiore dell'ormone giovanile rispetto al silenziamento singolo di VG.

Ciò suggerisce che vitelli non solo inibisce la produzione di ormone giovanile, ma inibisce anche una risposta di retroazione dell'ormone giovanile al silenziamento di USP. Nei doppio silenziamento, l'aumento drammatico della produzione di ormone giovanile deriva da una ridotta inibizione da parte di VI genin causata dal silenziamento di VG e da una risposta compensativa a una ridotta trasduzione dell'ormone giovanile causata dal silenziamento di USP. Una discussione più dettagliata di questa rete regolatoria si trova nel testo del protocollo allegato.

Utilizzando un approccio di doppia silenziamento genico, abbiamo evidenziato una relazione dettagliata tra geni vitali, ultras, sferici e l'ormone giovanile, che non avremmo potuto scoprire sopprimendo un solo gene. Ora, grazie a questa tecnica, i ricercatori possono esplorare le interrelazioni tra geni all'interno di reti regolatorie. Il metodo PR è una procedura standard utilizzata per misurare la percezione gustativa nelle api mellifere; tuttavia, è molto sensibile alla manipolazione, pertanto è necessario prestare grande attenzione nel mantenere costanti le condizioni ambientali e le modalità di gestione degli animali.

Inoltre, se l'esperimento verrà eseguito per diversi giorni, è consigliabile mantenere una breve cronologia e controllare periodicamente che le condizioni meteorologiche e l'ambiente circostante non cambino.