Name: Prostaglandina estrazione e lanalisi in Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Impara a estrarre e analizzare prostaglandine ed eicosanoidi da Caenorhabditis elegans mediante LC-MS/MS. Questo metodo ottimizzato offre elevata sensibilità e specificità per studi metabolici.

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Ringraziamo i Metabolomica UAB mirati e Proteomica laboratorio, che è stato sostenuto in parte dal UAB pelle Disease Research Center (P30 AR050948 a C. Elmets), la UAB-UCSD O&#39;Brien Acute Kidney Injury Center (P30 DK079337 di A. Agarwal ) e la UAB Lung Health Center (R01 HL114439, R01 HL110950 di JE Blalock). Il supporto per lo spettrometro di massa è stato da un NCRR condivisa Instrumentation concessione (S10 RR19261 a S. Barnes). Ringraziamo anche Ray Moore per il supporto tecnico. C. elegans ceppi sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center, che è finanziato dal NIH. Questo lavoro è stato supportato dal NIH (R01GM085105 a MAM, compreso un supplemento amministrativo ARRA).

Il protocollo, come descritto di seguito è suddiviso in tre sezioni: cultura verme, l&#39;estrazione delle prostaglandine, e l&#39;analisi delle prostaglandine. Come già detto, ci sono più punti in cui i campioni possono essere conservati temporaneamente a -80 ° C o -20 ° C. 1. Worm Cultura Si consiglia di circa 6 g di vermi stadio misti per LC-MS/MS completi. Ciò dovrebbe fornire sufficiente materiale per il rilevamento di almeno sei iniezioni separate. Per la quantificazione di PG conosciuti da MRM in una singola iniezione o due, 1-2 g sono sufficienti. Analisi di estratti di colture sincronizzate costituiti da una determinata fase è anche possibile. Fino a 4 diversi ceppi possono essere coltivate simultaneamente. Ad esempio, un controllo di tipo selvatico e tre diversi ceppi mutanti. <ol><li> Preparare 65 X-grandi dimensioni (16 cm) piastre NGM e batteri concentrati per l&#39;alimentazione supplementare. Utilizzare NA22 batteri per la semina. Per rendere i batteri concentrati per l&#39;alimentazione supplementare, grow almeno quattro litri di NA22 in terreno LB per 16-24 ore. Spin down, rimuovere il surnatante e risospendere i batteri in 100 ml di tampone M9. 200 a 400 ml di questa soluzione batterica concentrata può essere richiesto per ogni ceppo verme. Conservare a 4 ° C. </li><li> Avviare culture verme su 5 X-grandi tavole. Crescere vermi per circa 3 o 4 generazioni fino a quando le piastre sono pieni di adulti gravide. Batteri concentrati devono essere aggiunti alle piastre per evitare la fame, se necessario (~ 1 ml / piastra e lasciare asciugare completamente il coperchio). </li><li> Lavare ermafroditi gravide in piatti con tampone M9 e raccogliere i vermi in un tubo di polipropilene 50 ml conica. </li><li> Consentire ermafroditi gravide di depositarsi sul fondo (di solito circa 3-5 minuti). Rimuovere il surnatante, compresi batteri, uova, e vermi stadio larvale. Risospendere in 15 ml di tampone M9 e mescolare delicatamente. </li><li> Trasferire 200 microlitri di sospensione verme a ciascuna delle 60 teste di serie piastre NGM. Disperdere i vermi attraverso le piastre. Tenere soluzione verme mescolatobene fino a quando tutti i piatti sono stati seminati per garantire che essi ricevano un numero all&#39;incirca uguale di vermi. </li><li> Supplemento con batteri concentrati, se necessario (~ 1 ml/plate/12 a 24 periodo hr) per evitare la fame. Lasciare le piastre ad asciugare all&#39;aria prima di sostituire i coperchi. Crescere vermi per 2-4 generazioni, a seconda del numero originale di teste di serie vermi, o fino a quando le piastre sono pieni di adulti gravide. </li><li> Harvest piastre verme un ceppo alla volta. Lavare i vermi fuori le piastre con tampone M9 e raccogliere in provette da 50 ml in polipropilene (per esempio 6 tubi). Utilizzare tampone M9 per lavare un piatto, poi trasferire il buffer verme pieno al piatto successivo. Dopo aver lavato un numero (ad es. 10 °) di piastre, trasferire il buffer verme pieno al tubo da 50 ml. Riempire il tubo verso l&#39;alto con il tampone M9. Ripetere il lavaggio per il resto delle tavole. </li><li> Come gli adulti gravide si depositano sul fondo in 5-6 minuti, rimuovere il surnatante (~ 35 ml) e consolidare in uno o due tubi. Riempire i tubi a 50 ml con fresh M9 tampone, lasciare riposare per 3-5 minuti e rimuovere il surnatante lasciando adulti gravide. Ripetere 3 volte o fino a quando il surnatante è trasparente. </li><li> Utilizzo di un grande foro pipetta Pasteur, trasferire il maggior numero possibile di vermi due ml provette coniche 15 polipropilene. Centrifugare a 1000 rcf (~ 3.500 giri in CentraSL2) per 5 minuti in una centrifuga clinica. Rimuovere il surnatante e ripetere fino a quando tutti i vermi vengono trasferiti e pellet nello stesso tubo. Rimuovere il più possibile e surnatante vermi conservare a -80 ° C. Ripetere l&#39;operazione per tutti i ceppi. </li></ol> 2. Prostaglandina Estrazione I reagenti necessari per l&#39;estrazione sono riportati di seguito. Il metodo viene modificato da quello del Golovko e Murphy 17 e comprende l&#39;estrazione di acetone mediante purificazione liquido-liquido, che migliora la sensibilità LC-MS/MS. Un proiettile Blender 5 omogeneizzatore viene utilizzato nella procedura, anche se risultati simili possono essere ottenuti con un omogeneizzatore Dounce. Hydroxytolue Butylatedne (BHT) ed evaporazione sotto azoto (N 2) gas sono utilizzati per prevenire l&#39;ossidazione. Tutta la vetreria deve essere siliconato (Sigmacote) per ridurre il legame lipidi. Estrazione con solventi organici deve essere eseguita in una cappa chimica. <ol><li> Pesare una provetta da 50 ml in polipropilene. Trasferire circa 6,0 g di vermi congelati dal tubo da 15 ml conservato a -80 ° C, tagliando attraverso il tubo con una lama di rasoio caldo vicino al marchio da 6,5 ​​ml. Una spatola metanolo-pulita può essere usato per rimuovere il verme pellet congelato dal fondo della provetta. Tagliando il pellet per recuperare la porzione inferiore, meno dense vermi larve e batteri residui dalla parte superiore del pellet vengono abbandonati. </li><li> Trasferire i vermi congelati per la pre-pesato 50 ml tubo conico. Se più campioni vengono elaborati, utilizzare la stessa quantità (6,0 g) di tessuto per gli studi comparativi. Come il worm disgelo in una pasta, aggiungere o rimuovere i vermi con la spatola per ottenere la massa desiderata. Optional: annunciod 1,00 ng di standard di PGF 2α-d4 come controllo interno per l&#39;efficienza di estrazione. </li><li> Aggiungere 12 ml di ghiacciata 02:01 acetone / salina con 0,005% BHT per la sospensione di vite senza fine e mescolare bene nel vortex. Dispensare 1.5 ml di liquame worm per ciascuno dei dodici 5 ml tubi di plastica autoportanti per impiego in Blender proiettile. </li><li> Aggiungere 0,7-0,8 ml di 0,5 mm di diametro Ceria stabilizzata perle di ossido di zirconio per ciascuna provetta da 5 ml. Chiudere ermeticamente tappi e caricare i 12 tubi in the Bullet Blender 5 omogeneizzatore. Esegui il frullatore per 3 minuti a velocità 8-9 e posizionare i tubi in ghiaccio. Assicurarsi di chiudere i tappi molto stretto o il contenuto potrebbe fuoriuscire. Controllare 10 ml di omogeneizzato da un tubo su un vetrino utilizzando uno stereoscopio. Non ci dovrebbero essere molto pochi vermi intatti rimanenti. Ripetere alla stessa velocità per un altro minuto, se necessario. </li><li> Uniformemente trasferire i omogenati di quattro tubi di vetro da 10 ml coniche con una &quot;pipetta Pasteur 9. Evitare di trasferire perline. Lavare le perline da tre tubi sequentially con 1 ml di 1:2 acetone / salina contenente BHT. Ripetere l&#39;operazione per altri tubi fino a tutte le perline vengono lavati. Trasferire la soluzione rimanente (~ 4 ml) per i tubi di vetro da 10 ml e disporli sul ghiaccio. </li><li> Centrifugare le provette di vetro da 10 ml a 4 ° C in una centrifuga clinica a ~ 1.000 xg per 10 min. Trasferire il surnatante da ogni provetta da 10 ml tubo conico di vetro pulito. </li><li> In una cappa chimica, aggiungere un uguale volume di esano a ciascun tubo di vetro 10 ml. Ad esempio, aggiungere 3,5 ml di esano a 3,5 ml di acetone / soluzione salina. Vortex alla massima velocità per 30 sec. </li><li> Centrifugare le provette di vetro da 10 ml a 4 ° C in una centrifuga clinica a ~ 1.000 xg per 10 min. Eliminare la fase superiore contenente esano e lipidi neutrale cariche. </li><li> Acidificare la fase inferiore a pH 3,5 con acido formico 2 M (circa 100 - 150 ml). PH test con le strisce di pH. </li><li> Aggiungere un uguale volume di cloroformio in ogni provetta. Vortex alla massima velocità per 30 sec e centrifugare le provette a 4 ° C ina centrifuga clinica a ~ 1.000 xg per 10 min. </li><li> Rimuovere ed eliminare la fase acquosa superiore. Inserire la punta della pipetta attraverso qualsiasi interphase lattiginoso residua alla fase di cloroformio, evitando l&#39;interfase. Raccogliere la fase inferiore di ciascuno dei 4 tubi ad una pulita 15 ml tubo di vetro conico. Incubare a -20 ° C per almeno 24 ore. A questo punto, l&#39;estratto può essere conservato a -20 ° C per due settimane. </li><li> Prendere l&#39;estratto dal freezer e scartare il restante latte strato superiore acquoso, se presente. Trasferire la fase cloroformio in una fiala di vetro ½-Dram etichettato rivestita di teflon con una nuova pipetta Pasteur. In una cappa chimica, si evapora il cloroformio frazione solubile a secco sotto leggero flusso di N 2 gas. L&#39;estratto secco può essere conservato a -20 ° C fino a 2 settimane. Uno schema generale utilizzato per l&#39;estrazione e l&#39;analisi PG è mostrato in Figura 1. </li></ol> 3. Analisi delle prostaglandine <ol><li> Preparare il brodosoluzioni di singoli prostaglandine riferimento, come PGF 2α o PGF 2 α-d4 (1 pg / ml) in metanolo e diluire con metanolo: acqua (08:02 v / v) per ottenere una soluzione di lavoro. Preparare una serie di diluizioni (100, 10, 1, 0,1, 0,01 ng / ml) per generare una curva standard. </li><li> Aggiungere 200 microlitri metanolo: acqua (08:02 v / v) alla C. essiccato estratto lipidico elegans (s) e mescolare accuratamente. Se meno di 6 g di tessuto verme è stato estratto, estratto secco deve essere risospeso in meno volume di metanolo: soluzione acquosa. </li><li> Preparare la fase mobile costituita da 0,1% di acido formico in acqua [A] e acetonitrile contenente 0,1% di acido formico [B]. </li><li> Impostare il campionatore automatico a 4 ° C e posizionare le fiale di esempio in un 70-count 1,5 ml cremagliera fiala. </li><li> Equilibrare l&#39;idro colonna RP-C18 Synergy con 0,1% di acido formico ad un flusso di 0,2 ml / min per circa 5 min. </li><li> Iniettare il campione (20-50 ml) nel pozzetto della colonna. Eseguire la pendenza inizia l&#39;eluizionezione con il 10% B e salendo al 80% B 0-11 min, 80-100% B 11-14 min, e tornando indietro al 10% B a 16 min. Il tempo totale di esecuzione è di 20 min. I tempi di ritenzione dei 13 standard autentici sono mostrate in Tabella 1 per riferimento 3. </li><li> Introdurre la colonna effluente nello spettrometro di massa utilizzando una interfaccia ESI operante in modalità ioni negativi. L&#39;azoto viene utilizzato come un nebulizzatore e gas tenda (CUR = 10). Il gas di collisione, l&#39;energia di collisione, e la temperatura sono fissati a 10, -35 eV e 600 ° C rispettivamente. Potenziale Declustering (DP), l&#39;energia di collisione (CE), e il potenziale di uscita cella (CXP) sono fissati a -90, -35 e -10, rispettivamente. </li><li> Per le scansioni di indagine (scansioni Q1), utilizzare la modalità di ioni negativi nel range di massa m / z 315-360 per la maggior parte dei PG (Figura 2). L&#39;intervallo può essere modificato, in funzione della massa del composto (s) di interesse. Estrarre gli ioni dalla corrente ionica totale (TIC) di LC-MS ioni cromatogrammi e determinare se l&#39;estrazioneioni ted corrispondono a ioni deprotonate o addotto, oppure per ioni frammento. </li><li> Per gli esperimenti MRM, transizione massa m / z 355/311 è usato per rilevare la classe F1, m / z 353/193 è utilizzato per la classe F2, e m / z 351/193 o 351/191 è utilizzato per la classe F3 (Figura 3). MRM è anche usato per rilevare lo standard interno (ad esempio, m / z 357/197 per PGF 2α-d4) e per generare la curva standard. Per ulteriori informazioni sui PG transizioni di massa 18 Vedi Murphy et al.. </li><li> Per gli esperimenti di MS / MS, usa m / z 355 per la classe F1, m / z 353for classe F2, e m / z 351for F3 classe PG. C. elegans dati MS / MS per PG F-Series è disponibile in Figura 4 e Tabella 2 3,16. Dati MS / MS per eicosanoidi mammiferi è disponibile a <a href="http://www.lipidmaps.org" target="_blank">www.lipidmaps.org</a> . </li><li> Elaborare i dati analitici che utilizzano Analyst software (versione 1.4.2, Applied Biosystems). </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Descriviamo una procedura per l&#39;estrazione degli eicosanoidi e analisi, concentrandosi su PG F-series. Ci sono diverse parti della procedura che può essere problematico. In primo luogo, è fondamentale che le colture a vite senza fine non morire di fame, come la fame può alterare il metabolismo PG. Per l&#39;alimentazione supplementare, NA22 batteri sono raccomandati al posto dei più comunemente usati OP50 batteri perché NA22 raggiunge una maggiore densità. Tuttavia, il ceppo NA22 manca di resistenza agli antibiotici ed è più suscettibile alla contaminazione. In secondo luogo, i vermi sintetizzano i singoli isomeri PG in basso relativa abbondanza di tessuti dei mammiferi. Ciò può essere dovuto in parte alla ridondanza tra i numerosi isomeri. Si consiglia di circa 6 g di tessuto per l&#39;analisi completa e segnali più forti. Meno tessuto (1-2 g) può essere utilizzata se l&#39;estratto secco è risospeso in meno metanolo: soluzione acquosa per aumentare la concentrazione PG. Tuttavia, solo uno o due iniezioni possono essere eseguite. Il limite di rivelazione del nostro sistema LC-MS/MS è circa 10 pgPGF 2α / ml. Un ml di densamente vermi stadio miste (circa 1 g) produce circa 25-50 pg di CePGF2. Sistemi di spettrometria di massa più sensibili possono ridurre la quantità di tessuto senza fine per l&#39;analisi. In terzo luogo, le differenze in termini di efficienza di estrazione PG tra i campioni possono causare risultati variabili. Abbiamo trovato che l&#39;efficienza di estrazione è molto simile quando i tessuti vengono estratti in parallelo. Per determinare l&#39;efficienza, aggiungere 1,0 ng di PGF 2α-d 4 alla fase di omogeneizzazione come controllo interno. MRM utilizzando transizione massa m / z 357/197 viene usato per misurare PGF 2α concentrazione-d4 rispetto ad un 1 ng / ml di soluzione standard. La quantità di PGF 2α-d 4 persi durante l&#39;estrazione viene quindi calcolata. I parametri cromatografici e transizioni di massa che abbiamo inserito può essere modificato per rilevare altri PG ed eicosanoidi. Nonostante i notevoli sforzi, non siamo stati in grado di identificare serie D o E-serIES PGS negli estratti 17. Inoltre, non abbiamo rilevato 8-iso PGF 2α e 8-iso PGE2 che sono caratteristici del libero perossidazione radicale-iniziato, che genera una miscela non selettivo di PG stereoisomeri 19. Sia i worm sintetizzano altri tipi PG non è noto. Gli endocannabinoidi e vari metaboliti epossidiche e idrossi di arachidonico e acido eicosapentaenoico sono stati trovati in C. elegans estrae 5,7,20,21. Si consiglia l&#39;uso di entrambi MRM e MS / MS rispetto agli standard autentici per la quantificazione e l&#39;identificazione, rispettivamente. Per nuove eicosanoidi, queste analisi dovrebbero essere combinati con uno studio comparativo di mutanti grassi, che sono carenti in PUFA sintetizzare enzimi 22, così come un saggio funzionale, se possibile. Un avvertimento per analizzare i mutanti di grasso è che piccole quantità di acidi grassi polinsaturi presenti nel vermi sono sufficienti per la sintesi di PG. Per esempio, i grassi-2 (wa17) mutantiavere una piccola quantità di D12 dell&#39;attività desaturasi (~ 5% di tipo selvaggio 22) e questi mutanti producono ancora PG 6. grasso-3 (WA22) e grasso-4 (WA14) mutanti non riescono a sintetizzare derivati ​​da PG arachidonico e acidi eicosapentaenoico 16 . Abbiamo anche trovato che i mutanti grasso compensare la perdita di classi PUFA fino regolando-sintesi di PG dalle classi rimanenti. Per esempio, grasso-3 (WA22) mutanti non riescono a sintetizzare maggior PG derivati ​​da PUFA 20-carbonio. Al contrario, essi sembrano up-regolare romanzo PG derivati ​​dal 18-carbonio PUFA 16. Ad oggi, non abbiamo individuato una C. elegans ceppo che è completamente carenti di sintesi di PG. E &#39;possibile che i PG sono essenziali per la crescita o di sviluppo.

Le prostaglandine (PG) sono una classe importante di ormoni lipidici che sono stati ampiamente studiati e implicati nella regolazione riproduzione, immunità, e lo sviluppo in una vasta gamma di organismi 12-14. PG sono ideali per i sistemi globali di analisi di biologia in quanto comprendono una serie di lipidi derivati ​​da un precursore comune (s). Il nematode C. elegans è uno degli organismi modello più utilizzati per affrontare le questioni fondamentali della genetica e della biologia dei sistemi. Abbiamo dimostrato che C. elegans sintetizza PG della serie F che guida spermatozoi mobili di ovociti 3,6,16. PG serie F derivati ​​da PUFA 20-carbonio a tre, quattro, cinque e doppi legami, comprendente la F1, F2, F3 e classi, rispettivamente, sono stati identificati 3,16. Questi PG sono sintetizzati indipendente di enzimi cicloossigenasi, eppure stereoisomeri PGF 2α 1α e PGF sono ancora generated. Per le analisi qualitative e quantitative di C. elegans PG, LC-MS/MS è un potente e sensibile tecnica analitica. Prima di eseguire questa analisi, è importante sviluppare un metodo di estrazione ottimizzato per le prestazioni del processo analitico dipende fortemente dalla qualità dell&#39;estratto. Cromatografia liquida e spettrometria di massa possono fornire solo la massa anticipato rapporto carica (m / z), così come la forma del picco desiderabile e tempo di ritenzione dello ione genitore PG. Profilo metabolico di PG in C. elegans è un compito impegnativo che richiede diverse strategie di acquisizione di MS. Scansione o indagine scansione completa LC-MS (Q1 scansione) ha il vantaggio di garantire che la maggior PG ionizzabili genereranno una risposta di spettrometria di massa. Mentre la scansione indagine fornisce utili informazioni sul profilo complessivo di PG rispetto al wild-type e mutante C. elegans, rilevamento di PG minori è compromessa a causa della bassa sensibilità. Neverthemeno, la scansione LC-MS indagine può dare una visione globale di PG ed è particolarmente utile per analizzare i mutanti previsti per influenzare il metabolismo di una vasta popolazione PG. Nella identificazione metabolita, l&#39;analisi LC-MS/MS di standard PG sintesi chimica viene eseguita prima di ottenere i loro spettri di ioni prodotto come composti di riferimento. Questi spettri può essere paragonato allo spettro di un metabolita sconosciuto. Multimodo reazione di monitoraggio (MRM) è utilizzato per una maggiore sensibilità e specificità. Un esperimento MRM avviene specificando il genitore ioni / ioni prodotto massa transizione di un composto. Conoscendo la massa e la struttura degli analiti bersaglio, è possibile prevedere teorici transizioni MRM per molti metaboliti sconosciuti. Un metodo LC-MS/MS ottimizzato per la profilatura PG isomeri in C. elegans non è stata riportata. Qui si descrive un approccio integrato di estrazione e di spettrometria di massa consistente di LC-MS e LC-Metodi di MS / MS per la rilevazione, quantificazione, e indagando C. elegans PG metaboliti. Questo approccio può essere applicato ad altri eicosanoidi.

<table><tr><tbody><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>X-large (16 cm) piastre</td><td>Fisher Scientific 0875714</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli ceppo NA22</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>NA22</td><td><a href="http://www.cgc.cbs.umn.edu" target="_blank">http://www.cgc.cbs.umn.edu</a></td></tr><tr><td>Acetone, 399.5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>A928-4</td><td></td></tr><tr><td>Idrossitoluene butilato</td><td>MP Biomedicals</td><td>101162</td><td></td></tr><tr><td>esano, grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-1</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico, 399%</td><td>Acros</td><td>AC27048-0010</td><td>Disponibile tramite Fisher</td></tr><tr><td>Scientific Cloroformio, grado HPLC</td><td>Acros</td><td>AC26832-0010</td><td>Disponibile tramite Fisher PGF2</td></tr><tr><td>&alpha; scientifico -d4</td><td>Cayman Chemicals</td><td>316010</td><td>Cayman ha una vasta gamma di standard disponibili per l'acquisto</td></tr><tr><td>Tappo a vite sterile autoportante tubo da 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-651</td><td>Per l'uso con Bullet Blender</td></tr><tr><td>Perline di ossido di zirconio da 0,5 mm</td><td>Prossimo > > > Advance</td><td>ZrOB05</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga graduate per impieghi gravosi coniche in vetro da 10 ml</td><td>Kimble Kimax</td><td>45200-10</td><td>Disponibile tramite Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Provette coniche in vetro da 15 ml</td><td>Corning Pyrex</td><td>8082-15</td><td>Disponibile tramite Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sigmacote (reagente siliconante)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fiala in vetro 1/2 Dram con tappo rivestito in teflon</td><td>Fisher Scientific</td><td>V1235C-TFE</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>CentraSL2 Centrifuga clinica</td><td>Thomas Scientific</td><td>2517N92-TS</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender 5 omogeneizzatore blu</td><td>Successivo > > > Advance</td><td>BBY5MB</td><td>Un omogeneizzatore Dounce da 40 ml può essere utilizzato in alternativa</td></tr><tr><td>Synergi 4 &mu; m Idro-RP 80 &#197; Colonna LC 250 x 2,0 mm</td><td>Phenomenenex</td><td>00G-4375-B0</td><td>Cartuccia HPLC SecurityGuard</td></tr><tr><td>AQ C18 4 x 2,0 mm</td><td>Phenomenenex</td><td>AJ0-7510</td><td></td></tr><tr><td>Kit cartucce SecurityGuard</td><td>Phenomenenex</td><td>KJ0-4282</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu Prominence HPLC con campionatore automatico refrigerato</td><td>Shimadzu Scientific Instruments, Inc.</td><td></td><td>Qualsiasi sistema HPLC standard accoppiato a uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo dovrebbe essere sufficiente</td></tr><tr><td>Spettrometro di massa a triplo quadrupolo API 4000</td><td>Applied Biosystems/MDS SCIEX</td><td></td><td></td></tr><<tr>td colspan="4"> <table border="1"> <tbody> <tr> <td colspan="2">M9 ricetta tampone (4 litri)</td> </tr> <tr> <td>12 g</td> <td> KH2PO4</td> </tr> <tr> <td>24 g</td> <td>Na2HPO4</td> </tr> <tr> <td>20 g</td> <td>NaCl</td> </tr> <tr> <td>Fino a 4 litri</td> <td>Acqua deionizzata</td> </tr> <tr> <td colspan="2">Aliquot in otto bottiglie da 1 litro. Autoclave e cool.</td> </tr> <tr> <td>0,5 ml/bottle</td> <td>1 M MgSO4</td> </tr> </tbody> </table> </td></tr></tbody></table>

prostaglandina estrazione e l&#39;analisi in<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans sta emergendo come un modello animale potente per studiare la biologia dei lipidi 1-9. Prostaglandine sono una classe importante di eicosanoidi, che sono segnali lipidici derivati ​​da acidi grassi poliinsaturi (PUFA) 10-14. Queste molecole di segnalazione sono difficili da studiare a causa della loro bassa abbondanza e natura reattiva. La caratteristica di prostaglandine è una struttura ad anello ciclopentano situato all&#39;interno della spina dorsale acido grasso. Nei mammiferi, le prostaglandine possono essere formati attraverso enzima cicloossigenasi-dipendente percorsi e indipendenti 10,15. C. elegans sintetizza una vasta gamma di prostaglandine indipendenti della ciclossigenasi 6,16,17. Una vasta classe di prostaglandine della serie F è stato identificato, ma lo studio di eicosanoidi è in una fase iniziale con ampio spazio per nuove scoperte. Qui si descrive una procedura per estrarre e analizzare prostaglandine e altri eicosanoidi. Lipidico Chargeds sono estratti da colture verme massa utilizzando una tecnica di estrazione liquido-liquido e analizzati mediante cromatografia liquida accoppiata a ionizzazione elettrospray spettrometria di massa tandem (LC-ESI-MS/MS). L&#39;inclusione degli analoghi deuterati di prostaglandine, come PGF 2 α-d 4 come è raccomandato uno standard interno per l&#39;analisi quantitativa. Monitoraggio reazione multipla o MRM può essere utilizzato per quantificare e confrontare i tipi di prostaglandine specifiche tra gli animali wild-type e mutanti. Decomposizione indotta da collisione o MS / MS possono essere utilizzati per ottenere informazioni su importanti caratteristiche strutturali. Cromatografia liquida e spettrometria di massa (LC-MS) scansioni di indagine di una gamma selezionata di massa, come la m / z 315-360 può essere utilizzato per valutare i cambiamenti globali nei livelli di prostaglandine. Forniamo alcuni esempi di tutte e tre le analisi. Questi metodi fornirà ai ricercatori un set di strumenti per la scoperta di nuovi eicosanoidi e delineando le loro vie metaboliche.

Preparazione del campione è stata effettuata mediante estrazione liquido-liquido adattato da Golovko e Murphy 17. Ha fornito eccellenti recupero dello standard interno (PGF 2α-d4). Lo schema generale per l&#39;estrazione di PG da C. elegans è mostrato in Figura 1. Condizioni cromatografiche sono stati ottimizzati per fornire la separazione al basale&gt; 30 norme eicosanoidi (tabella 1 mostra 13 standard). Una colonna Hydro-Rp (250 x 2,0 mm di) con acqua e acetonitrile contenente 0,1% di acido formico fornito la migliore separazione e sensibilità. Scansioni sondaggio di estratti mutanti wild-type e grasso-3 mostrato in figura 2 del documento livelli globali di ioni all&#39;interno della gamma di massa di 315-360 unità di massa atomica. Grasso-3 (WA22) mutanti mancano PUFA 20-carbonio più. Una classe F3 PG è evidenziato. Nella Figura 3, le analisi MRM di un estratto di tipo selvatico mostrano multipli isomeri PG della F1 (figura 3A </stro<html> ng&gt;), F2 (Figura 3B) e F3 (figure 3C e 3D) classi. La classe F3 può essere rilevato con uno di due transizioni di massa, m / z 351/193 o di m / z 351/191. CePGF2 è prevalentemente costituito dal PGF 2α enantiomero. CePGF1 è probabile che sia PGF 1α o suo enantiomero. Figura 4 mostra la decomposizione indotta da collisione di CePGF2 (RT = 11,8) rispetto allo standard PGF2 α (RT = 11,8). Piccole differenze di ioni prodotto sono probabilmente dovuti alla scarsa abbondanza CePGF2 e composti co-eluizione nell&#39;estratto. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di C. elegans PG estrazione e analisi LC-MS. Notare che l&#39;acetone / cloroformio e soluzione salina entrambi hanno 0,005% BHT per minimizzare l&#39;ossidazione dei lipidi. Fare riferimento al testo per ulteriori dettagli.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2.jpg" /> Figura 2. Scansioni sondaggio di m / z 315-360 di estratti mutanti wild-type e grasso-3 (WA22). Tempo di ritenzione mediante cromatografia liquida (RT) è mostrato in pannello [A]. Ioni estratti a RT = 11.3 sono mostrati per wild-type [B] e grasso-3 (WA22) [C] estratti. Una classe F3 PG di massa m / z 351 è evidenziato. Cps, conteggi / sec; amu, unità di massa atomica. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3.jpg" /> Figure 3. Analisi MRM di estratti wild-type. PG classe F1 vengono rilevati con transizione di massa m / z 355/311 [A]. Si noti che diversi composti idrofobici (RT&gt; 14 min), che sono difficilmente essere PG, vengono rilevate anche con questa transizione. F2 PG classe vengono rilevati con transizione di massa m / z 353/193 [B]. F3 PG classe vengono rilevati sia con transizione di massa m / z 351/193 [C] o m / z 351/191 [D]. Si noti che gli estratti contengono più isomeri pg di ogni classe. Numeri corrispondono a PG mostrate in Tabella 2. La concentrazione di CePGF2 è 1,8 ng / ml. RT, tempo di ritenzione; cps, conteggi / sec. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4.jpg" /> Figura 4. Collisione indotta decomposizione di synth chimicamenteesized PGF 2α e CePGF2. Frecce in pannello [A] indica ioni prodotto o frammentazione condivisi tra PGF 2α e CePGF2 (RT = 11,8). Gli ioni prodotti a m / z 309 e m / z 193 sono generati da siti di rottura indicati (evidenziata a e b), corrispondono alle strutture, e sono caratteristici di PG della serie F [B]. Cps, conteggi / sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Standard </td><td> RT (min) </td><td> [MH] - m / z </td><td> Ioni prodotti principali di MS / MS </td></tr><tr><td> 20-idrossi PGE 2 </td><td> 9.43 </td><td> 367 </td><td> 349, 331, 287, 234, 189, 129, 109 </td></tr&gt; <tr><td> PGF 3 - </td><td> 11.26 </td><td> 351 </td><td> 333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> Trombossano B 2 </td><td> 11.66 </td><td> 369 </td><td> 289, 191, 177, 169, 151 </td></tr><tr><td> PGF 2 - </td><td> 11.80 </td><td> 353 </td><td> 335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> PGF 1 - </td><td> 11.79 </td><td> 355 </td><td> 337, 319.311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195 </td></tr><tr><td> Lipoxin B 4 </td><td> 12.38 </td><td> 351 </td><td> 201, 191.189, 165, 155, 115, 107, 71, 59 </td></tr><tr><td> PGD ​​2 </td><td> 12.56 </td><td> 351 </td><td> 315, 271.203, 189 </td></tr><tr><td> 5 (S), 6 (R) - Lipoxin A 4 </td><td> 12.83 </td><td> 351 </td><td> 235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59 </td></tr><tr><td> PGA 2 </td><td> 14.02 </td><td> 333 </td><td> 315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109 </td></tr><tr><td> Δ12-PGJ 2 </td><td> 14.20 </td><td> 333 </td><td> 271, 189, 123 </td></tr><tr><td> Leucotriene B 4 </td><td> 14.73 </td><td> 335 </td><td> 181, 109, 93, 71, 69, 59, 57 </td></tr><tr><td> 15d-Δ 12,14-PGJ 2 </td><td> 16.80 </td><td> 315 </td><td> 297, 271, 217, 203, 158 </td></tr><tr><td> 5 (S)-HPETE </td><td> 17.88 </td><td> 335 </td><td> 97, 83, 81, 57 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. I tempi di ritenzione e ioni prodotto chiave del 13 norme eicosanoidi dal metodo LC-MS/MS 3. Oltre 30 gli standard sono stati usati per sviluppare il programma LC-MS/MS. I tempi di ritenzione cromatografici (RTS) sono diversi, anche tra PG molto simili. Un&#39;eccezione è PGF 2α 1α e PGF. Tuttavia, questi PG sono distinguished dalle loro masse di ioni controllanti ([MH] - m / z) e collisione indotta spettri decomposizione (MS / MS). <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Classe delle prostaglandine </td><td> N ° in figura 3 </td><td> [MH] - m / z </td><td> Ioni prodotti principali di MS / MS </td></tr><tr><td> F1 (CePGF1) </td><td> 1 </td><td> 355 </td><td> 319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157 </td></tr><tr><td> F1 </td><td> 2 </td><td> 355 </td><td> 311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157 </td></tr><tr><td> F2 (CePGF2) </td><td> 3 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127 </td></tr><tr><td> F2 </td><td> 4 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 5 </td><td> 351 </td><td> 315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 6 </td><td> 351 </td><td> 333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Collisione indotte decomposizione ioni prodotti per diversi importanti C. elegans F1, F2, F3 e PG mostrati nella Figura 3. MS / MS di altri isomeri meno abbondanti non sono mostrate. Questi dati provengono da molteplici analisi e non tutti gli ioni prodotto possono essere visibili in un dato periodo. Data la complessità degli estratti, alcuni ioni prodotto meno abbondanti possono derivare da un altro ione genitore con tempo di ritenzione simile o risultare da interferenze. Peak 2 è probabilmente uno stereoisomero di CePGF1 e di picco 4 è probabilmente uno stereoisomero di CePGF2. Vedi Edmonds, et al. (2010) per i dati di altri 3.

In questo lavoro, si descrive una procedura ottimizzata per l&#39;estrazione e l&#39;analisi di prostaglandine e altri eicosanoidi da<em&gt; C. elegans</em&gt; Usando LC-MS/MS.

Prostaglandina estrazione e l&#39;analisi in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Questa procedura ha lo scopo di identificare e quantificare prostaglandine e altri eicosanoidi in estratti di *Pseudoplexaura porosa*. Innanzitutto, coltivare i vermi in colture su larga scala. Successivamente, mediante una tecnica di estrazione liquido-liquido, estrarre i lipidi idrofili dal tessuto dei vermi ed iniettare gli estratti lipidici in una colonna di HPLC accoppiata a uno spettrometro di massa.Quindi analizzare i dati ottenuti dalla cromatografia liquida con spettrometria di massa in tandem. In definitiva, questo approccio LC-MS/MS su estratti caldi purificati può identificare nuovi metaboliti e misurare anche metaboliti noti, come le prostaglandine della serie S. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi immunoenzimatici, consiste nella sua elevata sensibilità e specificità, oltre che nella completezza e flessibilità. Hugh Hong, uno studente laureando del mio laboratorio, illustrerà questa tecnica. Per l'alimentazione supplementare dei vermi, utilizzare pellet e NA 22.Coltura batterica mediante centrifugazione, scartare il soprannatante e risospendere il pellet batterico in 100 millilitri di buffer M nove. Conservare la soluzione batterica concentrata a quattro gradi Celsius. Iniziare le colture di vermi su cinque piastre NGM extra large.Continuare a coltivare i vermi per tre o quattro generazioni fino a quando le piastre non saranno piene di gravità. Aggiungere adulti per prevenire la fame, aggiungendo circa un millilitro di batteri concentrati alle piastre dei vermi secondo necessità. Far asciugare completamente all'aria prima di posizionare il coperchio.Successivamente, lavare i vermi ermafroditi dalle piastre utilizzando tampone M nine. Raccogliere i vermi in un tubo conico in polipropilene da 50 millilitri. Lasciare quindi sedimentare i vermi sul fondo.Eliminare il soprannatante contenente uova di batteri e vermi allo stadio larvale. A questo punto, risospendere i vermi rimanenti in 15 millilitri di buffer M nine e mescolare delicatamente. Distribuire 200 microlitri della sospensione di vermi su ciascuna delle 60 piastre N GM seminate.Mantenere bene mescolata la soluzione di worm fino a quando tutti i piatti sono stati seminati, per garantire che ricevano un numero approssimativamente uguale di worm. Distribuire i worm uniformemente sui piatti. Far crescere i worm per due o quattro generazioni, aggiungendo un millilitro di batteri concentrati per piatto ogni 12-24 ore.Quando le piastre sono piene di adulti GR, raccogliere i vermi una ceppa alla volta. Lavare i vermi dalle piastre utilizzando tampone M nine e trasferirli in sei tubi polipropilenici da 50 millilitri. Riempire i tubi con tampone M nine per lavare i vermi.Quando gli adulti raccolti si depositano sul fondo, rimuovere circa 35 millilitri del soprannatante. Quindi trasferire i vermi in uno o due tubi. Ripetere il lavaggio con M9 per tre volte o fino a quando il soprannatante diventa trasparente, utilizzando una pipetta Pasteur con estremità larga.Trasferire il maggior numero possibile di vermi in un tubo conico in polipropilene da 15 millilitri. Centrifugare a 1000 RCF per cinque minuti e scartare il soprannatante. Ripetere le fasi di raccolta, lavaggio e concentrazione per le altre ceppi.Conservare le scorte delle ceppi di vermi raccolti a meno 80 gradi Celsius. Registrare il peso di un tubo conico in polipropilene utilizzando una lametta rovente rossa. Tagliare un tubo in polipropilene congelato contenente vermi raccolti in prossimità del segno di sei millilitri.In condizioni sterili, trasferire circa sei grammi di pellet di vermi congelati nel campione in esame. Aggiungere un nanogrammo dello standard interno e 12 millilitri di soluzione fredda di acetone e soluzione salina.Con la miscela di BHT, distribuire accuratamente 1,5 millilitri di sospensione di vermi in 12 tubi di plastica autosostenuti da cinque millilitri ciascuno. Aggiungere 0,7 millilitri di perle di ossido di zirconio stabilizzate. Omogeneizzare la sospensione di vermi se necessario.Ripetere il processo per un altro minuto fino a ottenere meno del 10% di vermi integri utilizzando una pipetta pastoriana da nove pollici. Trasferire con attenzione l'omogenato, ma non le perle, in quattro tubi conici in vetro da 10 millilitri. Riunire le perle provenienti da tre tubi e lavarle con un millilitro di soluzione salina di acetone contenente BHT.Ripetere questo lavaggio per i restanti tubi contenenti le perle. Trasferire la soluzione di lavaggio nei tubi di vetro posti sul ghiaccio. Successivamente, centrifugare l'omogenato a 1000 G per 10 minuti.A quattro gradi Celsius, trasferire il soprannatante da ogni tubo in un nuovo tubo conico in vetro da 10 millilitri. Successivamente, in una cappa chimica, aggiungere a ogni tubo un volume uguale di esano e vortexare alla velocità massima per 30 secondi. Dopo la centrifugazione a quattro gradi Celsius a 1000 G per 10 minuti.Scartare la fase superiore contenente l'esano e i lipidi neutri a due millimoli di acido formico per acidificare la fase acquosa inferiore. Verificare con strisce indicatrici di pH fino a raggiungere un valore di pH pari a 3,5. A questo punto, aggiungere volumi uguali di cloroformio in ogni provetta e vortexare alla velocità massima per 30 secondi.Centrifugare i campioni a quattro gradi Celsius a circa 1000 GS per 10 minuti. Inserire la punta di una pipetta di vetro nella fase inferiore di cloroformio e cercare di evitare l'interfaccia solida inclinando il tubo. Raccogliere gli estratti da quattro tubi in un singolo tubo conico di vetro da 15 millilitri.Spurgare l'aria nel tubo di vetro con gas azoto e incubare a meno 20 gradi Celsius per 24 ore fino a due settimane. Dopo lo scongelamento dell'estratto, scartare l'eventuale strato acquoso superiore di aspetto lattiginoso. Utilizzando una nuova pipetta Pasteur.Trasferire il cloroformio in un vial di vetro DRM semilavorato con rivestimento in teflon, etichettato, all'interno di una cappa chimica. Evaporare il solvente organico sotto un flusso delicato di gas azoto e conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius per un massimo di due settimane. Preparare innanzitutto soluzioni stock dei singoli prostaglandini di riferimento in metanolo.Ora genera una curva standard mediante diluizioni seriali in metanolo al 80%. Successivamente, sciogli gli estratti lipidici liofilizzati di sea elegance in 200 microlitri di metanolo al 80% per l'analisi. Inietta da 20 a 50 microlitri del campione nella colonna a fase inversa ed esegui l'analisi in gradiente come specificato nel protocollo testuale, utilizzando l'interfaccia ESI in modalità ioni negativi.Introdurre l'eluito della colonna nello spettrometro di massa. Impostare il gas di collisione a 10 elettronvolt. L'energia di collisione a meno 35 elettronvolt.La temperatura a 600 gradi Celsius. Il potenziale di decluttering a meno 90 e il potenziale di uscita della cellula a meno 11 generano una curva standard per analizzare le diverse classi di prostaglandine presenti nei campioni estratti utilizzando il software Analyst. Elaborare i dati per identificare le prostaglandine presenti negli estratti del verme.Le scansioni di rilevamento degli estratti di vermi di tipo selvaggio e del mutante fat three mostrano i livelli globali di ioni nell'intervallo di massa compreso tra 315 e 360 unità di massa atomica. Rispetto ai vermi di tipo selvaggio, i mutanti fat three presentano la mancanza della maggior parte dei PFAS a 20 atomi di carbonio, come illustrato da una prostaglandina della classe F three. Con il rapporto di carica master 3 51 evidenziato in grigio, le analisi MRM possono identificare le diverse classi di prostaglandine.Ad esempio, le prostaglandine della classe F1 sono presenti negli estratti di tipo selvatico, così come diverse altre sostanze idrofobe con tempi di ritenzione maggiori; variando la transizione di massa, è possibile effettuare un'ulteriore analisi delle prostaglandine delle classi F2 e F3, indicando che gli estratti di verme contengono diversi isomeri di prostaglandine per ciascuna classe. Il confronto della decomposizione indotta da collisione della prostaglandina di *C. elegans* con quella della prostaglandina standard può essere utilizzato per mappare gli ioni prodotto derivanti dai siti di scissione attesi. Al fine di prevenire l'ossidazione lipidica.Ricordarsi di adottare le opportune precauzioni. Ad esempio, aggiungere l'antiossidante VHT alla soluzione indicata e purgare l'estratto con gas azoto.

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