Preparazione del Mgm101 ricombinazione delle proteine ​​da Strategy Tagging MBP-based

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare proteine oligomeriche di grandi dimensioni che legano il DNA, come MGM101, utilizzando la strategia di marcatura con la proteina legante il maltosio o marcatura MVP. Questo viene realizzato innanzitutto clonando il frame di lettura aperto di MGM101 a valle di MVP nel vettore PMLC2E per l'espressione in *E. coli*. La proteina di fusione M-V-P-M-G-M101 viene quindi purificata da *E. coli* mediante cromatografia di affinità con AMLO.

MGM 1 0 1 viene quindi rilasciato dal MVP mediante scissione proteolitica e separato dal MVP tramite cromatografia a scambio cationico. Infine, gli anelli di MGM 1 0 1 vengono purificati fino all'omogeneità mediante cromatografia di esclusione molecolare. Alla fine si ottengono circa 0,8 milligrammi di MGM 1 0 1 solubile.

Da un litro di coltura batterica si può procedere alla caratterizzazione biochimica e strutturale di questa proteina, che è importante per la riparazione del DNA nei mitocondri. Il principale vantaggio nell'utilizzo di una versione marcativa con proteina legante mortale di MGM 1 0 1 è che questa versione è meno tossica, più solubile e più stabile rispetto alla versione non marcata. Di conseguenza, possiamo ottenere un'espressione elevata della proteina nativa MGM 1 0 1 in e coli.

Ciao, mi chiamo Sarah Vicki. Sono una specialista senior del supporto alla ricerca nel laboratorio del Dottor Jji TEN presso la SUNY Upstate Medical University. Io e il mio collega, Wan Wong, illustreremo ora l'espressione e la purificazione di MGM 1 0 1. Iniziare a generare la proteina fusa amplificando, mediante PCR, la sequenza codificante matura di MGM 1 0 1.

Non includere i primi 22 residui ammino terminali di MGM 1 0 1, noti per essere scissi. Dopo l'importazione nei mitocondri, il MGM 1 0 1 amplificato viene inserito a valle della sequenza MAL E, che codifica per la proteina legante il maltosio o MVP in una versione modificata del vettore di espressione PM MAL C due E. Questo genera la fusione M-V-P-M-G-M 1 0 1 con un linker contenente un sito di scissione per la proteasi di precisione. Il plasmide viene inizialmente costruito selezionando i trasformanti di e coli senza ricorrere alla selezione bianco-blu.

Il plasmide risultante PLC due E, MGM 1 0 1, viene quindi introdotto nella ceppa di e coli BL due uno codon plus DE tre RIL e coltivato su piastre LB contenenti ampicillina e cloramfenicolo. Iniziare inoculando 10 millilitri freschi di mezzo LB supplementato con i trasformanti di e coli, incubati a 37 gradi Celsius durante la notte con agitazione a 200 giri al minuto. Il giorno successivo inoculare due litri di mezzo LB supplementato con 10 millilitri della precoltura.

Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius con agitazione. Quando l'OD 600 raggiunge 0,5, indurre l'espressione della proteina fusa M-B-P-M-G-M 1 0 1 aggiungendo IPTG a una concentrazione finale di 0,3 millimolare, quindi coltivare le cellule con agitazione a 30 gradi Celsius per cinque ore. Trascorse cinque ore, trasferire le colture in bottiglie da centrifuga da 500 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

Dopo aver eliminato il soprannatante, aggiungere 30 millilitri di buffer di lisi contenente inibitori della proteasi e risospendere il pellet cellulare aspirando e dispensando con una pipetta. Successivamente, sottoporre la sospensione cellulare a sonicazione su ghiaccio per 20 secondi. Utilizzando un processore ultrasonico con un ciclo di lavoro del 50%, lasciare raffreddare le cellule su ghiaccio per 30 secondi.

Quindi ripetere i passaggi di sonica e raffreddamento altre due volte, mantenendo la sospensione sul ghiaccio. Aggiungere un millilitro di due milligrammi per millilitro.

Incubare il lisato cellulare con un campione di DNA a quattro gradi Celsius per due ore. Trascorse due ore, regolare la concentrazione finale di sale a 500 millimolari aggiungendo quattro millilitri di cloruro di sodio cinque molare a 36 millilitri di lisato.

Quindi, per rimuovere i detriti cellulari, centrifugare a 10.000 ×g a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Trasferire il soprannatante in una provetta nuova. A questo punto, un'aliquote di 20 microlitri può essere utilizzata per monitorare l'efficienza della lisi mediante sonificazione.

In un gel SDS-PAGE. Successivamente, il lisato cellulare viene fatto passare attraverso una colonna di amilosio. Per purificare la proteina di fusione MVP-MGM101, iniziare aggiungendo 1,5 millilitri di una sospensione al 50% della resina AMLO in un tubo conico da 15 millilitri.

Quindi, per equilibrarlo, aggiungere 13 millilitri di buffer di lisi e centrifugare a 2000 ×g per cinque minuti. Ripetere questo lavaggio altre quattro volte, quindi risospendere la resina in 0,75 millilitri di buffer di lisi. Aggiungere la sospensione di AMLO equilibrata al lisato cellulare e agitare delicatamente a 4 °C durante la notte.

Il giorno successivo, caricare la miscela di lisato e resina amilosica su una colonna cromatografica econo installata in una stanza fredda. Aprire il rubinetto per permettere alle proteine non legate di passare in un tubo di raccolta mediante filtrazione per gravità. Successivamente, lavare la resina AMLO aggiungendo 300 millilitri di buffer di lavaggio uno.

Dopo il passaggio, ripetere il lavaggio con 150 millilitri di tampone di lavaggio due. Dopo aver aggiunto il tampone Ellucian e aver raccolto l'EIT come descritto nel protocollo del testo, determinare la resa e la purezza di M-V-P-M-G-M 1 0 1 caricando un'aliquote dell'EIT su un gel SDS-PAGE.

Dopo aver fatto correre il gel, eseguire la colorazione con kumasi: dovrebbe essere visibile una singola banda principale di circa 70 kilodalton. Aggiungere 50 unità di proteasi di precisione ai M-V-P-M-G-M 1 0 1 EITs e inserirli in un tubo da dialisi contenente tampone per dialisi. Lasciare procedere il taglio per tutta la notte a quattro gradi Celsius.

Eseguire una gel elettroforesi SDS-PAGE come in precedenza. Per valutare l'efficienza della scissione, una scissione completa dovrebbe produrre due bande di 42 e 28 chilodalton, corrispondenti rispettivamente a MVP e MGM 1 0 1. Caricare il MVP MGM 1 0 1 scisso mediante iniezioni multiple su una cartuccia Bio Scale Mini Macro Prep High S collegata a un sistema FPLC BioRad Biologic DUO Flow.

Avviare la cromatografia a scambio cationico applicando un gradiente a gradini di sale di cinque millimolari 300, millimolari 500, millimolari 750 e 1000 millimolari di cloruro di sodio, ottenuto mescolando il tampone A e il tampone B. Impostare la velocità di flusso a 0,5 millilitri al minuto. Raccogliere frazioni da due millilitri in un frazionatore automatico; tipicamente, MGM 1 0 1 eluisce a 500 millimolari di sale.

Combinare le frazioni relative al picco MGM 1 0 1 e verificare la purezza della proteina mediante elettroforesi SDS-PAGE. Dopo aver combinato le frazioni proteiche ottenute dalla cromatografia a scambio cationico, dializzate la proteina nel buffer di equilibrazione per la GF a quattro gradi Celsius durante la notte, il picco MGM 1 0 1 dovrebbe mostrare una singola banda di circa 28 chilodalton. Successivamente, trasferire la proteina in una colonna di filtrazione a membrana ultrafiltrante Aveva spin 15 R e centrifugare a 3000 ×g a quattro gradi Celsius per concentrare la proteina.

Una volta ridotto il volume a circa un millilitro, caricare MGM 1 0 1 su una colonna preparativa calibrata Supra Six in equilibrio con il tampone cromatografico ed avviare la cromatografia di esclusione dimensionale utilizzando il tampone cromatografico ad una velocità di flusso di 0,5 millilitri al minuto. Le proteine oligomeriche di grandi dimensioni eluiscono nelle prime frazioni, mentre le proteine più piccole eluiscono nelle frazioni successive. Gli anelli di MGM 1 0 1 eluiscono a circa 400 chilodalton.

Raccogliere le frazioni dei picchi di MGM 1 0 1 purificato utilizzando un raccoglitore di frazioni; caricare aliquote delle frazioni su un gel SDS-PAGE al 12% per verificare la qualità finale della proteina. Successivamente, concentrare la proteina con Aveva. Centrifugare a 3000 × g per sei volte a quattro gradi Celsius.

Poi congelare rapidamente gli aliquote proteici in provette da microcentrifuga immergendole in azoto liquido per due minuti. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius per un periodo compreso tra sei e dodici mesi. Utilizzare i campioni MGM 1 0 1 per il saggio di legame al DNA a filamento singolo e per la visualizzazione strutturale mediante microscopia elettronica a trasmissione.

I risultati del saggio di spostamento della mobilità elettroforetica dimostrano che la proteina MGM101 purificata possiede una marcata attività di legame al DNA a singolo filamento. La sonda di DNA a singolo filamento viene trattenuta in misura crescente nei pozzetti di un gel nativo di poliacrilamide dall'oligomero di MGM101.

Quando M GM 1 0 1 viene aggiunto a una concentrazione superiore a 400 nanomolar. Questi micrografici elettronici mostrano l'organizzazione strutturale di ordine superiore di MGM 1 0 1. L'M GM 1 0 1 appena preparato esiste come anelli distinti con un diametro di 20 nanometri, che possono essere rivelati mediante microscopia elettronica a trasmissione con colorazione negativa.

Dopo diverse settimane di conservazione a quattro gradi Celsius, MGM 1 0 1 forma filamenti elicoidali supramolecolari. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata entro una settimana.

Grazie per aver guardato.