Name: Preparazione del Mgm101 ricombinazione delle proteine da Strategy Tagging MBP-based (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Scopri il metodo di purificazione della proteina Mgm101 di lievito mediante strategia di tag MBP, cromatografia a scambio cationico ed esclusione dimensionale. Questo protocollo produce anelli oligomerici omogenei per studi biochimici.

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Ringraziamo Stephan Wilkens aiuto in microscopia elettronica a trasmissione. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di Grant R01AG023731.

Precedenti studi hanno dimostrato che i primi amino-terminali 22 residui di Mgm101 sono spaccati dopo l&#39;importazione in mitocondri 19. Per l&#39;espressione in Escherichia coli, la cornice di lettura aperta MGM101 mancano i primi 22 codoni viene amplificato mediante PCR e collocato a valle della sequenza codificante la proteina MASCHIO legante il maltosio (MBP) in una versione modificata del vettore di espressione pMAL-c2e. Questo genera la fusione MBP-Mgm101 con un linker che contiene un sito di taglio per la proteasi prescissione (Figura 3). Il plasmide viene costruito selezionando E. trasformanti coli senza l&#39;IPTG e selezione blu / bianco Xgal. Il plasmide risultante pMAL-C2E-MGM101 viene poi introdotto nella E. coli ceppo BL21-CodonPlus (DE3)-RIL selezionando ampicillina e colonie resistenti cloramfenicolo. 1. Espressione, induzione, Cell Lysis e DNasi Trattamento io <ol><li> InocUlate trasformanti freschi in 10 ml di terreno LB (1% Bacto triptone, 0,5% estratto di lievito, 1% di NaCl) addizionato con glucosio (0,2%), ampicillina (100 pg / ml) e cloramfenicolo (50 mg / ml). Incubare a 37 ° CO / N con agitazione a 200 rpm. </li><li> Inoculare il ml precoltura 10 in 2 litri di terreno LB integrato come sopra. Crescere le cellule a 37 ° C con agitazione fino a OD 600 raggiunge 0,5. </li><li> Indurre l&#39;espressione della proteina di fusione MBP-Mgm101 aggiungendo isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 0,3 mM. Crescere le cellule in agitazione a 30 ° C per 5 ore. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione utilizzando una Beckman JA-10 rotore (5.500 xg, a 4 ° C, 10 min). Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 30 ml di tampone di lisi (20 mM Tris-HCl, pH 7,4 e 1 mM EDTA, pH 7,4) contenente inibitori delle proteasi (25 pM leupeptina, 1 pM pepstatina A e 1 mM PMSF). </li><li> Sonicare sospensione cellulare in ghiaccio per 20sec utilizzando un processore ad ultrasuoni (Sistemi di calore; modello W-385) al duty cycle del 50%, lasciare raffreddare in ghiaccio per 30 secondi, e ripetere 2x. </li><li> Aggiungere 1 ml di DNAse 1 magazzino a 2 mg / ml. Rock il lisato cellulare a 4 ° C per 2 h. </li><li> Regolare NaCl ad una concentrazione finale di 500 mm. </li><li> Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 10.000 xg a 4 ° C per 30 min. </li></ol> 2. Purificazione con amilosio Affinity Chromatography <ol><li> Equilibrare 1,5 ml di resina amilosio (50% slurry) nel tampone di lisi. Aggiungere la resina amilosio equilibrata al lisato cellulare. Agitare delicatamente a 4 ° CO / N. </li><li> Caricare il mix lisato-resina su una colonna cromatografica Econo-colonna installata in una stanza fredda. Lasciare le proteine ​​non legate al passaggio della colonna per gravità. </li><li> Lavare la resina con amilosio 300 ml di tampone di lavaggio I (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, e 0,2 mM PMSF). </li><li> Ripetere il lavaggio con 150 ml di tampone di lavaggio II (20 mm tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, e 0,2 mM PMSF). </li><li> Aggiungere 5 ml di tampone di eluizione (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, e 0,2 mM PMSF, 10 mM maltosio) alla colonna, incubare a 4 ° C per 10 min, raccogliere l&#39;eluato e ripetere per più volte. </li><li> Combinare gli eluati, determinare la resa e la purezza di MBP-Mgm101 caricando una aliquota dell&#39;eluato su un gel SDS-PAGE seguita da colorazione con Coomassie (Figura 4). </li></ol> 3. Prescissione proteasi Decolleté e cromatografia a scambio cationico <ol><li> Aggiungere 50 unità di prescissione proteasi per l&#39;eluato MBP-Mgm101. Eseguire la scissione a 4 ° CO / N e lasciarlo continuare durante la dialisi contro il tampone di dialisi (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7,4, e 0,2 mM PMSF) </li><li> Controllare l&#39;efficienza della fenditura su un gel SDS-PAGE (Figura 5A). </li><li> Caricare il spaccati MBP-Mgm101 da iniettare multiplaioni su una cartuccia Mini Macro-Prep Alta S Bio-Scale collegati ad un sistema biologico FPLC doppio passaggio Bio-Rad. </li><li> Avviare la cromatografia a scambio cationico mediante l&#39;applicazione di un gradiente passo sale di 5 mm, 300 mm, 500 mm, 750 mm e 1000 mm di NaCl che viene creato da tampone di miscelazione A (5 mM NaCl, 10 mM Na-fosfato, pH 7,2; 1 mM PMSF) e tampone B (1 M NaCl, 10 mM Na-fosfato, pH 7,2, 1 mM PMSF). Impostare la velocità di flusso a 0,5 ml / min. Raccogliere la frazione Mgm101 e controllare la purezza della proteina su un gel SDS-PAGE (Figura 5B). </li></ol> 4. Size Exclusion Chromatography <ol><li> Unire le frazioni proteiche da cromatografia a scambio cationico. Dializzare la proteina in tampone di equilibrazione GF (20 mM MOPS, pH 7,0; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, 5 mM di 2-mercaptoetanolo, 0,2 mM PMSF). </li><li> Concentrare la proteina con Vivaspin 15R colonnine ultrafiltrazione a ridurre il volume a ~ 1 ml mediante filatura a 3000 xga 4 ° C. </li><li> Caricare Mgm101 ona calibrato Superose 6 prep grade colonna equilibrata con il tampone di cromatografia (20 mM MOPS, pH 7,0; 150 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoetanolo, 1 mM EDTA, pH 7,4; 0,2 mM PMSF). </li><li> Avviare la dimensione del buffer con esclusione cromatografia funzionare ad una velocità di flusso di 0,5 ml / min. </li><li> Raccogliere le frazioni di purificate Mgm101 picchi. Caricare aliquote delle frazioni su un 12% SDS-PAGE per il controllo della qualità finale della proteina. </li><li> Concentrato della proteina con Vivaspin 6, poi congelare rapidamente i campioni in N2 liquido e conservare a -80 ° C. </li><li> Utilizzare i campioni Mgm101 entro 6-12 mesi per i test ssDNA-binding (Figura 8) e per la visualizzazione strutturale di microscopia elettronica a trasmissione (Figura 9). </li></ol>

<ol><li>San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+eukaryotic+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of eukaryotic homologous recombination.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).</li>
<li>Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMC1%3A+a+meiosis-specific+yeast+homolog+of+E.+coli+recA+required+for+recombination%2C+synaptonemal+complex+formation%2C+and+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression.</a> Cell. 69, 439-456 (1992).</li>
<li>Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad51+protein+involved+in+repair+and+recombination+in+S.+cerevisiae+is+a+RecA-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein.</a> Cell. 69, 457-470 (1992).</li>
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<li>Bai, Y., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rad52+homolog+is+required+for+RAD51-independent+mitotic+recombination+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).</li>
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<li>Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MGM101%2C+a+nuclear+gene+involved+in+maintenance+of+the+mitochondrial+genome+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).</li>
<li>Meeusen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mgm101p+is+a+novel+component+of+the+mitochondrial+nucleoid+that+binds+DNA+and+is+required+for+the+repair+of+oxidatively+damaged+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA.</a> J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).</li>
<li>Mbantenkhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mgm101+is+a+Rad52-related+protein+required+for+mitochondrial+DNA+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination.</a> J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).</li>
<li>Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+properly+configured+ring+structure+is+critical+for+the+function+of+the+mitochondrial+DNA+recombination+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mgm101.+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein.</a> Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).</li>
<li>Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+core+of+the+mitochondrial+genome+maintenance+protein+Mgm101p+in+Saccharomyces+cerevisiae+determined+with+a+temperature-conditional+allele%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele.</a> FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).</li>
<li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+packaging+proteins+Glom+and+Glom2+coordinately+organize+the+mitochondrial+nucleoid+of+Physarum+polycephalum%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum.</a> Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).</li>
<li>Janicka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+RAD52-like+single-stranded+DNA+binding+protein+affects+mitochondrial+DNA+repair+by+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination.</a> Plant J. 72, 423-435 (2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

E &#39;stata una sfida per la produzione di una stalla, nativo Mgm101 proteina ricombinante da E. coli forse a causa della sua insolubilità in cellule batteriche. In questo rapporto, si dimostra che la strategia di MBP-fusione permette la proteina da esprimere ad un livello ragionevolmente elevato. Mediante microscopia elettronica a colorazione negativa e cromatografia ad esclusione dimensionale, abbiamo precedentemente dimostrato che la proteina di fusione MBP-forma oligomeri uniformi in vitro 18...

Ricombinazione omologa è importante per la riparazione delle rotture del doppio filamento (DSB) e interstrand legami crociati, e per la ripresa della replicazione del DNA da forche di replicazione crollate 1. Nel convenzionale ricombinazione omologa, la reazione è catalizzata centrale dalle ricombinasi ATP-dipendenti comprese RecA nei procarioti e Rad51 e Dmc1 negli eucarioti 1-3. Questi ricombinasi formano filamenti nucleoproteici sul ssDNA, che sono essenziali per l&#39;avvio ricerca di omologia e invasione filone all&#39;interno dei modelli di DNA duplex (Figura 1, pannello di sinistra) 4-7. Oltre alla schema convenzionale, ricombinazione omologa può avvenire anche in maniera RecA/Rad51-independent (figura 1, pannello di destra). Per esempio, il lievito e RAD52 Rad59 proteine ​​possono catalizzare direttamente la ricottura del complementari ssDNA filamenti che sono esposti per resezione di dsDNA pause. Questo processo di ricombinazione, noto come cantareLe filone ricottura, generalmente non comporta omologa l&#39;abbinamento con i modelli di DNA a doppia elica. Dopo la ricottura, code eterologhe vengono rimossi da esonuleasi e nick sono legatura a ripristinare genoma 8-10 di continuità. Riparazione da parte del singolo meccanismo di ricottura filo è spesso accompagnata da delezioni di sequenze genomiche tra regioni ripetute direttamente. RAD52 appartiene ad un gruppo eterogeneo di proteine ​​di ricombinazione che sono diffuse tra i batteriofagi 11. Queste proteine ​​sono conosciute anche come singolo filamento Proteine ​​ricottura (SSAPs), in base alla loro attività nel promuovere la ricottura di molecole di DNA a singolo filamento omologo. I migliori SSAPs batteriofagi sono caratterizzati Redβ e Erf dal batteriofagi λ e P22, rect dal profago RAC e la proteina Sak dal Lactococcal fago ul36. Le SSAPs sono strutturalmente caratterizzate da una tipica piega β-β-β-α, sebbene somiglianza è praticamente undetectgrado nelle loro sequenze primarie. Essi ogni forma di grandi anelli omo-oligomeri di 10-14 volte simmetria in vitro 12-14. Le implicazioni funzionali di questa caratteristica organizzazione strutturale ordine superiore non è ben compreso. Siamo interessati a capire il meccanismo di ricombinazione omologa nel genoma mitocondriale. Abbiamo precedentemente identificato il gene MGM101 che è essenziale per il mantenimento del mtDNA in Saccharomyces cerevisiae 15. MGM101 stato successivamente trovato per essere associato con nucleoidi mitocondriali ed è necessario per la tolleranza del mtDNA ad agenti che danneggiano il DNA 16. Tuttavia, lo studio di Mgm101 è stata frenata nell&#39;ultimo decennio dalla difficoltà di produrre Mgm101 ricombinante. Abbiamo recentemente riusciti a produrre Mgm101 solubile in grandi quantità da E. coli usando la strategia di MBP-fusion. Questo ci ha permesso di dimostrare che Mgm101 azionisimilitudini biochimiche e strutturali con il RAD52-famiglia di proteine ​​17,18. In questo rapporto, una procedura di purificazione in tre fasi è descritta, che produce Mgm101for analisi biochimiche e strutturali omogenee (Figura 2).

<table><tbody><tr><td>Vettore di espressione pMAL-c2E</td><td>New England Biolabs</td><td>#N8066S</td><td></td></tr><tr><td>Prescission Proteasi</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>#27-0843-01</td><td></td></tr><tr><td>BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells</td><td>Strategene</td><td>#230245</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Roche Applied Science</td><td>#11034626001</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Roche Applied Science</td><td>#11359053001</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro di fenilmetilsulfonile (PMSF)</td><td>Roche Applied Science</td><td>#10837091001</td><td></td></tr><tr><td>DNAsi I</td><td>Sigma</td><td>#DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Roche Applied Science</td><td>#11411446001</td><td></td></tr><tr><td>Resina di amilosio</td><td>New England Biolabs</td><td>#E8021L</td><td></td></tr><tr><td>Colonna</td> <td>per cromatografia Econo-ColumnBIO-RAD</td><td>#7372512</td><td></td></tr><tr><td>Cartuccia Bio-Scale Mini Macro-Prep High S (1 ml)</td><td>BIO-RAD</td><td>#732-4130</td><td></td></tr><tr><td>VIVASPIN 15R Colonna rotante per ultrafiltrazione (10.000 MWCO)</td><td>Sartorius Stedium</td><td>#VS15RH02</td><td></td></tr><tr><td>Colonna Superose 6 per la preparazione</td><td>Amersham Bioscirnces</td><td>#17-0489-01</td><td></td></tr><tr><td>VIVASPIN 6 Colonna rotante per ultrafiltrazione (5.000 MWCO)</td><td>Sartorius Stedium</td><td></td><td></td>#VS0611</tr></tbody></table>

preparazione del mgm101 ricombinazione delle proteine ​​da strategy tagging mbp-based

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Il gene è stato identificato MGM101 20 anni fa per il suo ruolo nel mantenimento del DNA mitocondriale. Studi condotti in diversi gruppi hanno suggerito che la proteina Mgm101 è coinvolta nella riparazione ricombinazione del DNA mitocondriale. Recenti indagini hanno indicato che Mgm101 è legato alla famiglia RAD52-tipo ricombinazione proteica. Queste proteine ​​formano grandi anelli oligomeriche e promuovere la ricottura di molecole di DNA a singolo filamento omologo. Tuttavia, la caratterizzazione di Mgm101 è stata ostacolata dalla difficoltà di produrre la proteina ricombinante. Qui, una procedura affidabile per la preparazione di Mgm101 ricombinante è descritto. Il maltosio Binding Protein (MBP)-tag Mgm101 è prima espressa in Escherichia coli. La proteina di fusione è inizialmente purificato mediante cromatografia di affinità amilosio. Dopo essere stato rilasciato da clivaggio proteolitico, Mgm101 è separato da MBP mediante cromatografia di scambio cationico. Monodisperso Mgm101 è quindi ottenutoper cromatografia ad esclusione dimensionale. Una resa di ~ 0,87 mg di Mgm101 per litro di coltura batterica può essere ottenuta routine. Il Mgm101 ricombinante ha la contaminazione minima di DNA. I campioni preparati sono utilizzati con successo per biochimici, strutturali e singola particella analisi dell&#39;immagine di Mgm101. Questo protocollo può essere utilizzato anche per la preparazione di altri grandi oligomeriche proteine ​​che legano il DNA che possono essere mal ripiegate e tossici per le cellule batteriche.

Mgm101 è una proteina di ricombinazione RAD52-correlati nei mitocondri. RAD52 è stato ampiamente studiato per il suo ruolo nella ricombinazione del DNA mitocondriale (Figura 1). Ricombinante Mgm101 può essere preparato da una procedura in tre fasi (Figura 2). Ciò è facilitato dall&#39;utilizzo della strategia MBP-tagging che permette Mgm101 essere espressi in una forma solubile e successivamente rilasciato dal tag da taglio proteolitico (Figura 3). <p class="jove_co...

Il lievito mitocondriale proteina nucleoide, Mgm101, è una proteina di ricombinazione RAD52-tipo che forma grandi anelli oligomeriche. Un protocollo è descritto da preparare Mgm101 solubile ricombinante utilizzando la proteina legante il maltosio (MBP)-tagging strategia accoppiato con scambio cationico e cromatografia ad esclusione dimensionale.

Preparazione del Mgm101 ricombinazione delle proteine ​​da Strategy Tagging MBP-based

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare proteine oligomeriche di grandi dimensioni che legano il DNA, come MGM101, utilizzando la strategia di marcatura con la proteina legante il maltosio o marcatura MVP. Questo viene realizzato innanzitutto clonando il frame di lettura aperto di MGM101 a valle di MVP nel vettore PMLC2E per l'espressione in *E. coli*. La proteina di fusione M-V-P-M-G-M101 viene quindi purificata da *E. coli* mediante cromatografia di affinità con AMLO.MGM 1 0 1 viene quindi rilasciato dal MVP mediante scissione proteolitica e separato dal MVP tramite cromatografia a scambio cationico. Infine, gli anelli di MGM 1 0 1 vengono purificati fino all'omogeneità mediante cromatografia di esclusione molecolare. Alla fine si ottengono circa 0,8 milligrammi di MGM 1 0 1 solubile.Da un litro di coltura batterica si può procedere alla caratterizzazione biochimica e strutturale di questa proteina, che è importante per la riparazione del DNA nei mitocondri. Il principale vantaggio nell'utilizzo di una versione marcativa con proteina legante mortale di MGM 1 0 1 è che questa versione è meno tossica, più solubile e più stabile rispetto alla versione non marcata. Di co

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Questo video descrive BiFC-PALM - una combinazione di microscopia di localizzazione fotoattivata e complementazione a fluorescenza bimolecolare - per valutare le interazioni proteina-proteina. La BiFC prevede la fusione di due frammenti proteici fluorescenti con due proteine di interesse interagenti. Quando le due proteine interagiscono, i frammenti vengono portati in prossimità, il che consente alle due parti di unirsi e ricostituire una proteina fluorescente funzionale. La fluorescenza di un...

Microscopia di localizzazione fotoattivata accoppiata a complementazione a fluorescenza bimolecolare

Qui riportiamo un metodo per l'utilizzo di tipo I e tipo...

La manipolazione genetica in<em&gt; Δku80</em&gt; Ceppi per analisi genomica funzionale di<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Le metodologie di targeting genico possono essere utilizzate per generare topi transgenici con alleli knockout, knock-in e marcati.  Qui, descriviamo un metodo migliorato di ricombinazione in E. coli, che chiamiamo "subclonaggio più inserimento", che può essere utilizzato per generare rapidamente vettori di targeting genico personalizzati.

Subcloning più Insertion (SPI) - A Novel Metodo recombineering per la costruzione rapida di gene targeting Vettori

Le interazioni proteina-proteina vengono visualizzate in cellule con risoluzione spaziale nanometrica combinando la complementazione a fluorescenza bimolecolare (BiFC) con la microscopia a localizzazione fotoattivata (PALM). Qui viene descritto l'uso di BiFC-PALM per l'imaging delle interazioni Ras-Raf nelle cellule U2OS per visualizzare il clustering e la diffusione su scala nanometrica di singoli complessi Ras-Raf.

Fotoattivato localizzazione Microscopia con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC-PALM)

Questa relazione descrive un metodo bioingegneria per progettare e costruire nuovi fattori artificiali splicing (ASF) che specificamente modulano la giunzione di geni bersaglio in cellule di mammifero. Questo metodo può essere ulteriormente ampliata per progettare vari fattori artificiali di manipolare altri aspetti del metabolismo dell'RNA.

Ingegneria fattori artificiali per manipolare in modo specifico l&#39;alternanza di splicing nelle cellule umane

Questo studio descrive metodi per la coespressione mediata da T7 di geni multipli da un singolo plasmide in Escherichia coli usando il sistema plasmid pMGX.

Inducibile T7 RNA Polymerase-mediato sistema di espressione multigene, pMGX

Il cluster regolarmente intervallate proteine brevi ripetizioni/CRISPR palindromi associato 9 (CRISPR/Cas9) sistema fornisce uno strumento promettente per l'ingegneria genetica e apre la possibilità di integrazione mirata dei transgeni. Descriviamo un fine omologia-mediata entrare (HMEJ)-base di strategia per DNA efficiente mirata integrazione in vivo e mirate terapie geniche utilizzando CRISPR/Cas9.

Integrazione mirata CRISPR/Cas9-mediata In Vivo usando una strategia basata su unendo fine omologia-mediata

Questo documento introduce il metodo per sviluppare, caratterizzare e tracciare in tempo reale le metastasi tumorali nel modello di neuroblastoma zebrafish, in particolare nella linea transgenica zebrafish con sovraespressione di MYCN e LMO1, che sviluppa metastasi spontaneamente.

Zebrafish Modello di Metastasi del Neuroblastoma

La Biotinilazione potenziata per illuminazione limitata a posizione specifica AviTag (ALIBi) è un nuovo metodo optogeneticamente attivato sviluppato per il marcatore e la purificazione di affinità delle popolazioni subcellulari di ribosomi per sequenziamento a valle e analisi proteomiche.

Isolamento delle sottopopolazioni subcellulari di ribosomi basato su biotinilazione potenziata da illuminazione limitata da tag peptidico ricombinante specifico per peptidi

Charles Taylor e John Marshall spiegare l'utilità dei modelli matematici per valutare l'efficacia della strategia di popolazione sostituzione. Insight è data sul modo in cui i modelli computazionali in grado di fornire informazioni sulla dinamica della popolazione di zanzare e la diffusione di elementi trasponibili per A. sottospecie gambiae. Le considerazioni etiche di rilasciare le zanzare geneticamente modificate in libertà sono discussi.

Predire l&#39;efficacia della strategia Popolazione sostituzione Utilizzando Modelli Matematici

Scopri il metodo di purificazione della proteina Mgm101 di lievito mediante strategia di tag MBP, cromatografia a scambio cationico ed esclusione dimensionale. Questo protocollo produce anelli oligomerici omogenei per studi biochimici.

Preparazione del Mgm101 ricombinazione delle proteine ​​da Strategy Tagging MBP-based

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