Name: 4D imaging multimodale di Citrobacter rodentium Infezioni in topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Impara l'imaging multimodale 4D per studiare l'infezione da Citrobacter rodentium nei topi. Questo metodo combina tomografia ottica e micro-CT per visualizzare la colonizzazione batterica in tempo reale.

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L&#39;impianto in imaging in vivo presso l&#39;Imperial College è stata finanziata dal MRC.

<ol><li>Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Luciferase+to+Image+Bacterial+Infections+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice.</a> J. Vis. Exp. (48), e2547(2011).</li>
<li>Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infect Immun. 74, 5391-5396 (2006).</li>
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<li>Wiles, S., Dougan, G., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+a+%27hyperinfectious%27+bacterial+state+after+passage+of+Citrobacter+rodentium+through+the+host+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of a 'hyperinfectious' bacterial state after passage of Citrobacter rodentium through the host gastrointestinal tract.</a> Cell Microbiol. 7, 1163-1172 (2005).</li>
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Produzione e libero accesso a questo articolo è sponsorizzato da PerkinElmer. Gli autori Kevin P, Francesco, Jeff Meganck e Chaincy Kuo sono dipendenti di Pinza-A PerkinElmer Company. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le procedure scientifiche Animals Act 1986 e sono state approvate dal comitato etico locale.

Il film 4D di infezione batterica fornisce un utile strumento per visualizzare e interpretare grandi quantità di dati di immagini in multimodalità modo rapido e semplice. Questa tecnica facilita l&#39;analisi dettagliata di come una infezione diffonde attraverso un individuo mouse e può essere usato per studiare come ospite o delezione di geni batterici o particolare intervento strategie effetto carica batterica, distribuzione e localizzazione durante uno studio longitudinale 7. Questi video offrono anche strumenti didattici utili e strumento di diffusione delle informazioni al pubblico. Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo che potrebbero influenzare la qualità dei dati ottenuti da DLIT-μCT imaging e la possibilità di compilare un video 4D di infezione. La parte più importante di questo protocollo è l&#39;infezione di successo e omogenea di topi con C. rodentium. E &#39;essenziale che i topi utilizzati per lo studio sono tra 18-20 g, e che il bacteinoculums rial sono preparati al momento e di circa 5 x 10 9 cfu, come descritto in precedenza 2,3. Prima dell&#39;infezione dei topi, è importante controllare che l&#39;inoculo è bioluminescente usando l&#39;Spectrum TC e una volta che l&#39;inoculo è stato preparato, esso deve essere continuamente omogeneizzata prima di ogni topo è gavaged per assicurare che i topi ricevono dosi infettive simili. La formazione immagine DLIT-μCT di topi è stato ottimizzato in modo che la funzione di esposizione automatica in Living software 4.3.1 Immagine determina automaticamente i parametri di imaging ottimizzati per il segnale di essere ben al di sopra del rumore. Tuttavia, la funzione di esposizione automatica si basa su impostazioni definite dall&#39;utente ei parametri che devono essere modificati come descritto nella procedura. In caso contrario, questo si tradurrà in immagini povere, con un basso numero di fotoni raccolti che non si traduca in una progressione evidente l&#39;infezione, come sono programmate le impostazioni di fabbrica della Spectrum CT per esposizione automatica per i tumori di imaging espressionelucciola luciferasi. Ricostruzioni eseguite utilizzando 560-620 nm danno il miglior accordo tra i dati simulati e misurati e, pertanto, sono i dati più affidabili per includere nella ricostruzione. Una limitazione all&#39;uso di DLIT-μCT è che le radiazioni ionizzanti dalla scansione μCT provoca danni da radiazioni sub-letale che &#39;cumulativo in uno studio longitudinale 18. Esposizione a radiazioni sub-letale può indebolire la risposta immunitaria, causare danni al DNA e apoptosi in organi interni 19. In definitiva, i danni da radiazione sub-letali cumulativo può causare la morte se il DL 50/30 per le radiazioni ionizzanti è superato, che è tra i 5-7 Gy a seconda del ceppo del mouse e l&#39;età dei topi utilizzati 18,20,21. Anche se alcuni dei danni molecolari dalle radiazioni ionizzanti può guarire, in quanto il principio generale è quello di stimare la dose conservativamente, questo non è in genere rappresentato nella pianificazione studio. Invece, l&#39;obiettivo è quello di rimanere il più below questi limiti possibile, pur compiendo gli obiettivi di studio. Ciò è particolarmente importante in questo studio perché la normale risposta immunitaria all&#39;infezione, la frequenza delle immagini, e il fatto che transgenico, immuno-composto, o fortemente infettati animali può essere più suscettibile a radiazioni ionizzanti. Pianificare l&#39;esperimento per generare un film 4D di infezione, è importante considerare la durata dell&#39;esperimento, il numero di scansioni μCT richiesto durante questo periodo e la DL 50/30 per la radiazione ionizzante per il ceppo mouse utilizzato. Un altro limite potenziale DLIT-μCT è la forza dell&#39;espressione giornalista all&#39;interno del ceppo batterico utilizzato, come questo influirà limiti di rivelazione batteriche e tempi di imaging. E &#39;altamente raccomandato che i ricercatori utilizzano convalidati ceppi batterici che sono completamente virulento, ma ottimizzato per la massima espressione operone lux, come dimostrato in precedenza per BLI2,3. Un avvertimento per il design attuale del imaging 4D è che ogni film è composto da singole scansioni DLIT-μCT che hanno diversa scalatura fotone. Questo può rendere le immagini di difficile interpretazione se le modifiche alla localizzazione del BL focolai, o la sua intensità sono sottili, o se c&#39;è un fuoco intenso BL circondato da focolai multipli debole. Pertanto, per visualizzazioni longitudinali, è importante mantenere le barre di colore coerente di tutti i punti di tempo. Il concetto di un film 4D di infezione può essere applicato a qualsiasi agente patogeno batterico opportunamente etichettato. Il futuro sviluppo di questa tecnica avrà lo scopo di utilizzare la tomografia imaging di fluorescenza (FLIT), così come DLIT per facilitare la ricerca di risposte dell&#39;ospite alle infezioni utilizzando una combinazione di agenti patogeni batterici bioluminescenti e iniettabili fluorescenti vicino i raggi infrarossi per indagare risposta dell&#39;ospite alle infezioni. , Abbiamo solo Oltre a questo in questo protocollodescrivere l&#39;uso di batteri bioluminescenti per creare 4D film di infezione. Tuttavia, in alcuni casi, può essere necessario utilizzare fluorescenti batteri etichettati, per esempio con i tag IRFP, in modo che il reporter bioluminescenza può essere usato per studiare la genetica ospitanti durante l&#39;infezione. È importante sottolineare che l&#39;uso di immagini multi-modalità che combina DLIT / FLIT-μCT ci permetterà di studiare in modo non invasivo più parametri nel corso di una infezione batterica, che contribuirà in modo significativo alla riduzione, perfezionamento, e di sostituire l&#39;uso degli animali nella ricerca scientifica come delineato nella iniziativa del NC3R ( <a href="http://www.nc3rs.org.uk/" target="_blank">http://www.nc3rs.org.uk/</a> ).

Modelli piccoli animali, in particolare quelle che utilizzano topi, sono abitualmente utilizzati per studiare la patogenesi batterica o per testare le strategie di intervento per le infezioni, come gli antibiotici, probiotici, prebiotici e vaccini 1-7. I principali letture sperimentali da infezioni animali piccoli sono carico patogeno, la localizzazione spaziale e temporale delle infezioni, e modifica la risposta immunitaria dell&#39;organismo infetto. Nel imaging ottico in vivo è uno strumento prezioso per la ricerca della malattia infettiva e può essere utilizzato per monitorare multipla letture sperimentali attraverso l&#39;uso di geni reporter (luciferasi, proteine ​​fluorescenti, beta-lattamasi, ecc), coloranti fluorescenti, nanoparticelle o sonde chemioluminescenti mirati ad un processo biologico delle proteine, o microrganismo 6. L&#39;imaging bioluminescenza (BLI) è una modalità di imaging ottico utilizzato per monitorare la colonizzazione di piccoli animali, come topi e ratti, per batterica patogenaria 3,6,8,9. I topi sono infetti da batteri ricombinanti esprimenti una luciferasi, come l&#39;operone lux CDABE da luminescens Photorhabdus. Questi batteri possono essere rilevate mediante la loro produzione luce utilizzando un CCD sede a sistema di imaging in vivo 3,6,9. È importante sottolineare che solo metabolicamente microrganismi attivi sono bioluminescente (BL), il che significa solo le cellule batteriche vitali vengono rilevati da questa metodologia 10,11. Utilizzando 2D BLI, la posizione della sorgente BL viene dedotto dalla superficie dell&#39;animale dove il segnale viene emesso 8. L&#39;esatta localizzazione anatomica del BL focolai in vivo deve essere determinato attraverso l&#39;analisi ex vivo di organi 3,6,9 In contrasto, tomografia composito 3D diffusa luce di imaging (DLIT) può essere utilizzato per compilare una ricostruzione quantitativa 3D della BL fonte 12. DLIT viene effettuata attraverso la raccolta di immagini scattate BL utilizzando filtri ottici definiti strette passa-banda esuccessivamente averli inseriti in una tomografia ottica algoritmo di ricostruzione 3D diffusa 1,7,12,13. Attualmente, l&#39;imaging multi-modalità è l&#39;unica metodologia disponibile per ottenere vera localizzazione anatomica non invasiva di bioluminescenti focolai in vivo, senza bisogno di analisi ex vivo. Recentemente, abbiamo usato una combinazione di DLIT co-registrate con μCT imaging per valutare Citrobacter rodentium (C. rodentium) dinamiche di colonizzazione dopo il trattamento profilattico con un batterio probiotico 7. C. rodentium è un patogeno enterico specifico murino utilizzato per l&#39;infezione umana modello con enteropatogeno e enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. infezione rodentium provoca colite, tipicamente associati con lieve perdita di peso, diarrea, polarizzazione Th1 risposta immunitaria e alterazioni patologiche distinte, tra cui colon iperplasia delle cripte e di fissaggio e cancellando lesione formazionil 14. In aggiunta a questo, C. rodentium patogenesi è stato studiato a fondo utilizzando BLI e le sue dinamiche di colonizzazione nei topi C57BL/6J sono ben documentati, rendendo questo batterio un microrganismo modello ideale per l&#39;uso con l&#39;imaging multimodale 3,4,7. Questo protocollo è il primo a delineare una metodologia per l&#39;imaging integrato DLIT-μCT di una infezione batterica utilizzando una singola piattaforma multimodalità di imaging, il IVIS Spectrum CT, e la generazione di un film 4D mostra la vera dinamica di questa infezione non invasivo.

<table><tbody><tr><td>Bioluminescente C. rodentium</td><td>Frankel lab</td><td>ICC180</td><td>Wiles et al., 2004</td></tr><tr><td>Veet</td><td>Boots</td><td></td><td>Il tempo di depilazione ottimale è di 7 minuti. La depilazione funziona meglio se la crema viene strofinata bene.</td></tr><tr><td>Isofluorano (100% v/v)</td><td>Abbott</td><td>B506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bombola di ossigeno medicale</td><td>BOC Medical</td><td></td><td>Size F. <forte>Nota: </forte> è necessario un regolatore appropriato.</td></tr><tr><td>Luria Bertani brodo</td><td>Merck</td><td>1.10285.0500</td><td>25 g in 1L di acqua demineralizzata.</td></tr><tr><td>Luria Bertani agar</td><td>Merck</td><td>1.10283.0500</td><td>37 g in 1L Acqua demineralizzata.</td></tr><tr><td>Solfato di kanamicina</td><td>Sigma (Fluka)</td><td>60615</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml Polipropilene conico Falcon tubi</td><td>BD (Falcon)</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Universali</td><td>Corning (Gosselin)</td><td>E5633-063</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>BD (Plastipak)</td><td>300013</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ago dosatore orale (16G x 75 mm) curvo</td><td>Vet Tech</td><td>DE005</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microbanche (crioviali)</td><td>Diagnostica Pro-Lab</td><td>PL.170/Y</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Calibro IVIS Spectrum CT</td><td>- una società PerkinElmer 133577</td><td>Rev A / Spectrum CT</td><td></td></tr><tr><td>Pinza UPS da 6kVA</td><td>- un'azienda</td><td></td><td></td> PerkinElmer</tr><tr><td>Sistema di anestesia XGI-8</td><td>Calibro- a PerkinElmer Company</td><td>118918</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>XAF-8 Filtro per anestesia carbone</td><td>di legna - a PerkinElmer Company</td><td>118999/00</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Living Image v4.3.1 SP1</td><td>Caliper- una società</td><td></td> PerkinElmer<td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Incubatore a scuotimento da banco</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 44</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4"> </td></tr></tbody></table>

4d imaging multimodale di<em&gt; citrobacter rodentium</em&gt; infezioni in topi

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per monitorare longitudinalmente un bioluminescente infezione batterica utilizzando la tomografia composito 3D diffusa luce di imaging con μCT integrato (DLIT-μCT) e il successivo utilizzo di questi dati per generare un film a quattro dimensioni (4D) del ciclo di infezione. Per sviluppare il cinema 4D di infezione e di convalidare la rappresentazione DLIT-μCT per gli studi di infezione batterica utilizzando una IVIS Spectrum CT, abbiamo usato l&#39;infezione con bioluminescenti C. rodentium, che causa autolimitante colite nei topi. In questo protocollo, abbiamo delineare l&#39;infezione di topi con bioluminescenti C. rodentium e monitoraggio non invasivo di colonizzazione da imaging DLIT-μCT quotidiano e la conta batterica da feci per 8 giorni. L&#39;uso della Spectrum IVIS CT ​​facilita senza soluzione co-registrazione di scansioni ottiche e μCT utilizzando una singola piattaforma di imaging. La modalità μCT basso dosaggio permette l&#39;imaging di topi, in varie occasioni durante l&#39;infezione, fornendo dettagliata localizzazione anatomica delle foci dei batteri bioluminescenti in 3D senza causare artefatti dalla radiazione cumulativa. È importante sottolineare che il cinema 4D di topi infetti forniscono un potente strumento di analisi per monitorare le dinamiche di colonizzazione batterica in vivo.

Infezione di topi C57BL/6J con 5 x 10 9 cfu C. rodentium è un modello di infezione batterica ben descritto e si traduce in una infezione gastrointestinale autolimitante che picchi compresi tra 6-8 giorni dopo l&#39;infezione e dura da 3 a 4 settimane 2,14. L&#39;infezione è confinata al lume intestinale da parte del sistema immunitario murino e di conseguenza, i batteri sono continuamente escreto nelle feci. La colonizzazione di topi di C. rodentium può essere monitorato in modo non invasivo per enumerazione batterica diretta da feci o di imaging bioluminescenza 2,3. Questo manoscritto descrive un protocollo ottimizzato per l&#39;esecuzione di 3D e 4D multimodalità di imaging di C. rodentium all&#39;interno di topi per monitorare carica batterica e la localizzazione durante l&#39;infezione. I risultati presentati in Figura 1 dimostrano i controlli necessari per il successo di imaging 4D. Prima l&#39;infezione di topi è essenziale dissuaderemia che l&#39;inoculo batterico usato è bioluminescente (Figura 1A) e che in seguito alla sonda gastrica di un topo con bioluminescente C. rodentium, che il segnale può essere osservato nello stomaco dell&#39;animale e non nei polmoni (Figura 1B) 16. Oltre al monitoraggio colonizzazione batterica utilizzando l&#39;imaging bioluminescenza, è buona norma quantificare numeri batterici nelle feci; che viene utilizzato come una misura indiretta di colonizzazione batterica della mucosa gastrointestinale Figura 2 dimostra la tipica carica batterica nelle feci tratto da 8 C57BL6 / J. i topi che sono stati infettati con ~ 5 x 10 9 cfu ICC180 e monitorati per 8 giorni PI colonizzazione aumenta dal giorno 2 PI fino a 6-7 giorni in cui i picchi di infezione a ~ 5 x 10 10 ufc / g, che è in linea con le precedenti relazioni 2,3,17. Per sottolineare l&#39;importanza della valutazioneting la diffusione dell&#39;infezione in un singolo mouse, figure 1b e 3, così come il video 1 sono state generate dallo stesso topo seguendo C. infezione rodentium, come descritto sopra. Quotidiano DLIT-μCT stato utilizzato per valutare la distribuzione spaziale dei batteri bioluminescenti all&#39;interno di questo mouse, usare lo scheletro come un riferimento anatomico. Figura 3 dimostra la ricostruzione DLIT-μCT di un mouse C57BL/6J infettati con ICC180 a 3 punti chiave di volta PI A giorno 3 PI piccolo bioluminescente foci può essere osservato nel colon, che presentano un moderato aumento dell&#39;intensità bioluminescenza di giorno 5 PI con modeste variazioni distribuzione spaziale. Al giorno 7 PI abbiamo osservato un significativo aumento della bioluminescenza e il bioluminescente focolai sparsi in tutto il colon. Video 1 è una raccolta di ricostruzioni 3D DLIT-μCT da giorni 1-8 proporzionale con ICC180 e illustra C.rodentium all&#39;interno del tratto gastrointestinale prossimale tra i giorni 1-2 PI che si estende per i due punti al giorno 3 PI Da giorni 4-6 PI il numero di batteri presenti nel colon si espandono fino ad un massimo del 7 ° giorno PI dove i fuochi batterica copre l&#39;intero colon. Al giorno 8 PI soli due fuochi distinti batteriche sono presenti nel colon prossimale e distale. La possibilità di visualizzare la ricostruzione 3D completa in ogni punto in ordine cronologico, rappresenta un potente strumento per analizzare le interazioni patogeno ospitanti ed è più facile da interpretare che un 3D ancora dello stesso insieme di dati. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig1.jpg" /> Figura 1. Bioluminescenza immagini 2D di A) Bioluminescent C. rodentium ICC180 inoculo e B) un mouse a seguito di sonda gastrica, con 200 ml di inoculo. Punta di freccia (&gt;) illustra bioluminescenti C. rodentium </<html> em&gt; nello stomaco. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig2.jpg" /> Figura 2. C. dinamiche di colonizzazione rodentium. Quantificazione di C. rodentium unità formanti colonia di feci per 8 giorni PI <img alt="Figura 3" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3.jpg" /> Figura 3. Diffuse luce di imaging tomografia-μCT scansione di bioluminescenti C. infezione rodentium da un topo monitorata al giorno 3, 5 e 7 PI Arrowhead (&gt;) illustra la colonizzazione del colon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50450/50450fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . Video 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere il video. cinema 4D di infezione da C. rodentium da un topo monitorato da giorni 1-8 PI

Di imaging multi-modalità è un valido approccio per studiare la colonizzazione batterica in piccoli modelli animali. Questo protocollo descrive l&#39;infezione di topi con bioluminescenti<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; E il monitoraggio longitudinale della colonizzazione batterica mediante tomografia luce composito 3D diffusa con μCT di imaging per creare un filmato 4D di<em&gt; C. rodentium</em&gt; Infezione.

4D imaging multimodale di<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infezioni in topi

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare il ciclo di infezione da zero DUM mediante tomografia a immagini di luce diffusa composita con micro CT integrato, al fine di creare un filmato in quattro dimensioni dell'infezione. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando un inocolo batterico bioluminescente. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'infettare i topi per gavaggio orale con zero dunum.I topi infetti vengono quindi sottoposti a imaging giornaliero mediante micro-TC a luce D, e i passaggi finali consistono nella ricostruzione dei dati di micro-TC 3D DLI e nella loro compilazione in un filmato in quattro dimensioni del ciclo di infezione. In definitiva, i risultati possono mostrare il cambiamento nella distribuzione e localizzazione del carico batterico attraverso l'imaging multimodale in quattro dimensioni di topi infetti. Dr. James Collins.Un ricercatore post-dottorato del mio laboratorio dimostrerà la procedura oggi. Nel tardo pomeriggio del giorno precedente l'infezione, preparare una provetta criogenica del ceppo privo di deume IC 180 in modo che scongeli; non appena scongelato, aggiungere un'unità criogenica di batteri a 15 millilitri di LB contenente canamicina, quindi far crescere la coltura tutta la notte a 37 gradi Celsius con agitazione a 220 giri al minuto. Inoltre, coltivare 15 millilitri di LB non inoculato per controllare la contaminazione del mezzo il mattino successivo.Se il controllo inoculato con UN non è torbido, trasferire la coltura inoculata in un tubo da 50 millilitri e centrifugare a 4.000 giri al minuto per 10 minuti a quattro gradi Celsius, riportare il pellet in sospensione in un volume di PBS e ripetere la centrifugazione. Successivamente, risospendere accuratamente le cellule in 1,5 millilitri di PBS per ottenere l'inoculo batterico. Per verificare che la coltura ICC 180 sia bioluminescente e per stimare il numero di batteri, acquisire un'immagine della coltura mediante imaging bioluminescente con filtro aperto nello spettro CT del sistema ivis e utilizzare l'impostazione automatica del software Living Image, versione 4.3 0.1.Questo è descritto in dettaglio in un video precedentemente pubblicato. Per dimostrare l'infezione di topi con il roditore bioluminescente, infetteremo un topo e utilizzeremo un altro topo per un'infezione fittizia con PBS. Prima di eseguire l'infezione, anestetizzare il topo con isoflurano al 3% utilizzando un sistema di anestesia XGI eight per garantire un contenimento umano mentre l'anestesia fa pieno effetto.Mescolare l'inoculo batterico e aspirare un numero noto di batteri in 0,2 millilitri in una siringa per la gavaggio orale. Prelevare ora il primo topo da infettare con una presa salda sul collo. Si noti che i topi sono stati depilati prima dell'imaging utilizzando una crema depilatoria come descritto nell'articolo, spingere l'ago verso la volta del palato oltre la lingua e lungo l'esofago e iniettare l'inoculo batterico nello stomaco.Se si avverte resistenza, non forzare l'ago perché ciò porterebbe l'inoculo nei polmoni; reinserire delicatamente l'ago. Successivamente, se il topo presenta difficoltà respiratorie o motorie, deve essere sottoposto a eutanasia nel caso di infezione fittizia. Somministrare per via orale a un topo 0,2 millilitri di PBS per confermare che la somministrazione per gavaggio sia stata eseguita correttamente.Immagina i topi nello spettro CT con IVUS utilizzando l'immagine bioluminescente con filtro aperto e utilizza l'impostazione automatica nel software Living Image. Il wizard di imaging 4.3 0.1, come descritto in precedenza, prevede Delight micro-CT, che combina imaging ottico con una scansione micro-CT a bassa dose di radiazioni. Poiché la dose si accumula negli animali ad ogni sessione di imaging, miriamo a mantenere la dose il più bassa possibile in modo ragionevole.A causa di queste considerazioni, i topi devono essere sacrificati al primo segno di sintomi dannosi o al termine del periodo di imaging con micro-TC. Per questo studio, ottimizzare i parametri della funzione di esposizione automatica in Living Image 4.3 0.1 per l'imaging della luciferasi batterica in vivo. Selezionare innanzitutto modifica, quindi preferenze, quindi acquisizione e infine la finestra di esposizione automatica.Successivamente, selezionare i valori di intervallo seguiti dal tempo di esperimento in secondi e impostare il massimo a 300 secondi. Infine, selezionare il numero minimo di conteggi desiderato seguito dalla luminiscenza e impostare questo valore a 10.000 conteggi. Una volta che il sistema è stato inizializzato, è stata impostata l'anestesia e sono stati verificati i dispositivi di sicurezza a raggi X.Procedere con l'anestesia di un topo. Utilizzare un sistema di anestesia XGI eight con una portata di ossigeno di due litri al minuto e 3% di isoflurano. Una volta che il topo è pronto per l'imaging, aprire la procedura guidata di imaging nel software.Questo strumento ottimizza automaticamente diversi parametri per fornire il miglior rapporto segnale-rumore possibile per ciascun filtro di emissione selezionato. Quando richiesto dalla procedura guidata di acquisizione immagini, includere i filtri di emissione a cinquecentosessantacinque, ottocento, seicento e duemila venti nanometri. Quindi assicurarsi che sia selezionata la scansione micro-CT per un topo e fare clic su acquisisci per avviare l'acquisizione delle immagini.Dopo aver riposizionato il topo anestetizzato nella sua gabbia, rimuovere la piattaforma per l'imaging di un topo dal CT a spettro e disinfettare la piattaforma per l'animale utilizzando tri gene all'1%. Nota. Se la piattaforma per l'animale è fortemente contaminata, il cuscinetto in schiuma può essere sostituito. Proseguire l'imaging dei topi giornalmente fino a otto giorni dopo l'infezione per generare i dati di imaging longitudinali.Periodi di prova più lunghi aumentano la probabilità di artefatti dovuti all'esposizione cumulativa alle radiazioni. Per produrre ricostruzioni di micro-TC luminosa tridimensionali di alta qualità e riproducibili, sono necessari diversi passaggi. Per prima cosa, aprire il software Living Image, versione 4.3 0.1, e selezionare Sfoglia dalla finestra di navigazione.Aprire la cartella contenente i file micro CT di Delight facendo clic su carica. Aprire il file micro CT DLI nel browser dell'immagine vivente. Ad esempio, vedere deum giorno sette post-infezione.Nella tavolozza degli strumenti, selezionare topografia della superficie seguita da mouse nudo. Regolare la soglia e quindi fare clic su genera superficie. Se la ricostruzione della superficie ha successo, un contorno della superficie verrà visualizzato nella finestra di vista 3D.Per visualizzare la scansione micro CT nella finestra di vista 3D, nascondere il contorno superficiale oppure ridurre l'opacità della superficie. Entrambe le opzioni sono accessibili selezionando prima gli strumenti ottici 3D. Successivamente, deselezionare visualizzazione oggetto superficiale oppure regolare la barra del cursore dell'opacità per ottenere una localizzazione anatomica dettagliata della ricostruzione luminosa delle tre DD.In riferimento allo scheletro animale, modificare i dati volumetrici 3D. Per visualizzare lo scheletro con un contrasto ottimale, fare clic su strumenti multimodali 3D e spostare il cursore dell'istogramma verso destra finché solo le ossa risultano chiaramente visibili. Quindi, se non già selezionata, attivare l'opzione istogramma logaritmico, invertire il gradiente di colorazione, regolare la qualità dell'illuminazione e ridurre il rumore.Se lo si desidera, ritagliare l'immagine per rimuovere eventuali strutture indesiderate dalla ricostruzione 3D dalla tavolozza degli strumenti, selezionare la ricostruzione 3D D light. Assicurarsi che siano selezionati solo i filtri a cinquecentosessantacinque, ottanta e seicentododici nanometri. Quindi fare clic su inizia.Questo apre la finestra di anteprima dei dati con i segnali di bioluminescenza filtrati spettralmente provenienti dall'immagine 2D del topo. Questi segnali vengono automaticamente sogliati dal software, ma possono essere regolati manualmente se necessario, utilizzando le schede nella parte inferiore del menu. Il valore di soglia determina l'intensità minima del segnale che verrà inclusa come dato nella ricostruzione.Successivamente, dalla barra degli strumenti, selezionare la ricostruzione 3D micro CT a luce D e verificare le proprietà ottiche. Cliccando sulla scheda proprietà, le caratteristiche del tessuto devono essere impostate su tessuto di topo e lo spettro della sorgente su batteri. A questo punto, fare clic su ricostruisci per eseguire la ricostruzione a luce D.La posizione effettiva del segnale del D light, indicato con un cerchio rosso, si trova all'interno del cingolo pelvico. Questa localizzazione è più facile da interpretare quando l'immagine ruota durante il filmato. Per generare il filmato 3D micro CT del DLI, andare al menu strumenti e selezionare animazione 3D, preset animazioni, asse antiorario e quindi durata totale.Impostare questo valore su 10 secondi o 25 fotogrammi al secondo. Una volta che le impostazioni per l'animazione 3D sono corrette, premere il tasto di registrazione e salvare le ricostruzioni 3D micro CT DLI come file VI. È fondamentale realizzare queste ricostruzioni utilizzando impostazioni identiche in modo che siano confrontabili.È inoltre importante realizzare i video utilizzando lo stesso numero di fotogrammi al secondo e la stessa durata totale. In caso contrario, la temporizzazione del video 40 non risulterà omogenea. Sul computer, aprire Windows Live Movie Maker e creare un nuovo file.Inserire le ricostruzioni micro-TC DLI in ordine cronologico a partire dal primo giorno successivo all'infezione. Utilizzando la scheda strumenti, aggiungere didascalie all'inizio di ogni video selezionando il video, quindi selezionando home e infine aggiungi didascalia. Il testo della didascalia può essere formattato tramite la barra degli strumenti e la posizione della didascalia è anch'essa regolabile.Ora aggiungere una pagina del titolo facendo clic su home e quindi su title. Digitare il titolo nella casella utilizzando la barra degli strumenti per formattare il testo. Successivamente, salvare il progetto come file MMP.Questo è essenziale se si desidera modificare il filmato. Infine, salvare il filmato come file WMV dal menu del programma di creazione filmati, selezionare "Salva filmato" e scegliere l'opzione per i quattro controlli del computer, che sono essenziali per una buona tecnica. Prima di infettare i topi, il ceppo batterico utilizzato è stato determinato essere bioluminescente.Dopo la gavaggio orale con il roditore bioluminescente, è stato verificato se il segnale potesse essere osservato nello stomaco dell'animale, indicato da una freccia bianca, ed assente dai polmoni. Lo stesso topo verrà mostrato negli esempi successivi di un'infezione individuale. Zero denture è un patogeno extracellulare confinato alla luce intestinale durante l'infezione dimostrata.Viene quindi espulso con le feci, che sono state analizzate per dimostrare che la colonizzazione aumenta dal secondo al sesto o settimo giorno, quando l'infezione raggiunge il picco giornaliero. È stata utilizzata la micro-TC in luce D per valutare la distribuzione spaziale dei batteri bioluminescenti all'interno di questo topo, utilizzando lo scheletro come riferimento anatomico. Al terzo giorno post-infezione, sono stati osservati piccoli focolai bioluminescenti nel colon, indicati da una freccia blu.Questi focolai hanno mostrato un moderato aumento dell'intensità della bioluminescenza al quinto giorno post-infezione, con pochi cambiamenti nella distribuzione spaziale al settimo giorno post-infezione; tuttavia, si è osservato un aumento significativo della bioluminescenza e una diffusione dei focolai bioluminescenti in tutta la colon. Tre ricostruzioni micro CT in luce DD dal primo all'ottavo giorno post-infezione illustrano la diffusione dell'infezione da sero deum. L'infezione batterica inizia come focolai distinti nel tratto gastrointestinale prossimale.Al terzo giorno, l'infezione si diffonde al colon. Nei giorni successivi, le aree di infezione si espandono ulteriormente, aumentando di dimensioni e numero. L'infezione raggiunge il picco massimo al settimo giorno.Quindi, all'ottavo giorno, le colonie si erano ridotte a due focolai batterici distinti nel colon prossimale e distale. Questa tecnologia permetterà ai ricercatori di studiare in tempo reale i meccanismi di colonizzazione e infezione batterica e di valutare l'efficacia di strategie di intervento.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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4D imaging multimodale di

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