Name: Trasduzione Adenoviral di CD4 T naive Cells allo Studio Differenziazione Treg (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: Scopri la trasduzione adenovirale per l'espressione genica ectopica in cellule T CD4 naive prima della differenziazione in cellule Treg. Questo metodo consente l'overespressione transitoria senza compromettere la vitalità cellulare.

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Gli autori desiderano ringraziare Lirui Du per la costruzione del vettore pCAGAdDU e Oliver Gorka per disposizione del protocollo di fissazione.

1. La clonazione di un gene di interesse in un vettore di ingresso <ol><li> Clonare il gene di interesse in un vettore di ingresso. Amplificazione PCR del gene seguita da ligazione smussato-end in un vettore topoisomerasi-coupled (es pENTR / D-TOPO) o di restrizione enzimatica clonazione può essere utilizzato per questa procedura. </li></ol> 2. Trasferimento del gene di interesse nel pCAGAdDu destinazione Vector <ol><li> Trasferire il gene di interesse da parte del vettore di ingresso nel vettore di destinazione dalla LR ricombinazione (es. Gateway LR Clonase II Enzyme Mix). Questo creerà il vettore di espressione adenovirale (Figura 1). </li><li> Linearizzare 10 pg del vettore di espressione adenovirale in una raccolta di limitazione PacI, precipitare il DNA e risospendere in acqua ad una concentrazione di 3 mg per 100 microlitri. Linearizzazione libera le ripetizioni invertite virali (ITR), che sono necessari per la replicazione e incapsidazione del vDNA Iral in particelle virali. </li></ol> 3. Generazione del Virus lisato Primaria <ol><li> Seme 1 x 10 5 cellule HEK293A in 2 ml RPMI (DMEM, 10% FBS, 5% PenStrep) in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti e incubare le cellule per 6-14 ore a 37 ° C in un 10% CO 2 incubatore per consentire loro di aderire. Le cellule devono quindi essere di circa il 50% di confluenza. </li><li> Lipofezione: Trasferimento 6 ml di reagente jetPEI in 94 ml di 50 mM NaCl, brevemente vortice. Aggiungere la soluzione mista di 100 pl linearizzato vettore adenovirus mentre vortex e incubare questa miscela di trasfezione per 15 - 30 min a temperatura ambiente. </li></ol> Eseguire tutti i passaggi seguenti, alle opportune condizioni di biosicurezza per l&#39;infezione da adenovirus! <ol start="3"><li> Erogare la soluzione a gocce sulla cella contenente ben HEK293A e incubare le cellule a 37 ° C e 10% di CO 2. Quando si utilizza un indicatore di fluorescenza, valutare il transfeefficienza ction visivamente dopo 12-36 ore utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito. Aggiungere 0,5 ml di mezzo fresco ogni 3 giorni. </li><li> Controllare ogni 2 - 3 giorni con un microscopio ottico a fluorescenza o per effetto citopatico (CPE), che sono le zone con le cellule allargata e arrotondata che iniziano a staccarsi. Ciò è indicativo di generazione virus efficiente. Al verificarsi di zone più ampie di CPE (Figura 3), ci vorranno 24-72 ore prima di tutte le cellule sono infettate. </li><li> Quando tutte le cellule mostrano segni di CPE, ma prima di un distacco totale di cellule avviene, staccano le cellule pipettando delicatamente e trasferire le cellule con supernatante (SN, 3-5 ml) in una provetta di polistirene da 15 ml. </li><li> Congelare le cellule nella SN in ghiaccio secco per 15 - 20 min e scongelare rapidamente a 37 ° C dopo la rottura delle cellule. Ripetere questo gelo-disgelo e-ciclo (F / TC) altre due volte. Tenere il lisato virus primario sul ghiaccio per l&#39;uso all&#39;interno di un giorno o congelarlo a -80 ° C per la conservazione a lungo termine. Qualsiasi ulteriore F/ TC ridurrà il titolo del virus del 30 - 50%. </li></ol> 4. Virus Amplificazione <ol><li> Seed e far crescere le cellule HEK293A al 90% di confluenza in un piatto di coltura 14 cm tessuto. </li><li> Infettare le cellule con la metà del lisato virus primario (1,5 - 2,5 ml) e incubare le cellule per almeno 36 ore. Quasi tutte le celle devono essere infettate poi, che può essere determinata mediante microscopia a fluorescenza. Per la ri-amplificazione di un già amplificato (cioè più concentrata) stock virus, infettare HEK293A ad una molteplicità di infezione (MOI) di 50 (vedere 6.3). </li><li> Le cellule devono essere raccolte quando tutti loro mostrano CPE, ma prima di distacco. Con la produzione di virus efficiente questo stato viene raggiunto entro 48 ore dopo l&#39;infezione. (Se ci vogliono fino a una settimana, prendere in considerazione un altro giro di amplificazione, aumentando la quantità di magazzino adenovirus usati per l&#39;infezione descritto al punto 4.2.) </li><li> Staccare le cellule pipettando dolce e cellule di trasferimento e SN in una provetta di polistirene da 50 ml. Spin celle in basso a 300 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il SN e risospendere il pellet in un opportuno volume di media o SN (ca. 1 ml). </li><li> Eseguire 3 F / TC per disturbare le cellule e centrifugare a 800 xg per 15 min a 4 ° C. Togliere il SN che contiene le particelle del virus (cioè il lisato virus concentrato), e un&#39;aliquota del lisato virus per conservarlo a -80 ° C. </li></ol> 5. Virus Titer Determinazione <ol><li> Seed 10 A549 5 cellule per pozzetto in 5 pozzetti di una 12-pozzetti in 1 ml di mezzo e lasciare che le cellule aderiscono per 6 ore. </li><li> Usare 1 ml di adenovirus concentrato (scongelati in ghiaccio) per eseguire una diluizione del siero in media (1:5.000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) e aggiungere 10 microlitri per pozzetto. Lascia un bene non infetto per regolare il gating in citometria a flusso. </li><li> Dopo 36 ore, togliere il SN, lavare con PBS e staccare le cellule (per esempio mediante tripsinizzazione). Per le precauzioni di sicurezza, si consiglia di fissare cells in 100 microlitri 4% paraformaldeide in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente e lavata con PBS contemporaneamente. </li><li> Effettuare una analisi FACS di espressione marcatore dell&#39;infezione. Plot &#39;lisato virale microlitri applicato&#39; contro il numero assoluto di cellule infette (Figura 4). Determinare il campo lineare di infezione e calcolare il titolo per ml di virus diluito dalla curva standard sopra la gamma lineare con x = 1,000 microlitri. </li></ol> 6. L&#39;infezione delle cellule T <ol><li> Isolate le cellule T CD4 naive / riposo da DO11.10 tg; topi Tg CARΔ1 utilizzando MACS (CD4 + T Naive cellulare Isolamento Kit II) o FACS ordinamento (CD4 + CD25-CD62L + CD44-). </li><li> Per gli esperimenti su piccola scala, pipettare un volume appropriato di lisato virale per ottenere una MOI di 50 in un pozzetto di una piastra 96 ​​pozzetti a fondo tondo. </li><li> Aggiungere fino a 4 x 10 5 cellule T in un volume finale di infezione di 50 microlitri in terreno cellule T (RPMI1640, 10% FBS, 5% PenStrep, 5% NaPyruvate, NEAA 1x, 1x MEM Essentialvitamina, 1x L-glutammina, 1:250.000 Mercaptoetanolo, 10 HEPES mm). Esempio: Un MOI di 50 deve essere utilizzato per infettare 3 x 10 5 cellule T; il titolo virale è 3 x 10 9 ml -1 Volume di Virus = MOI x T numero di cellule / titolo virale = 50 x (3 x 10 5) / (3 x 10 9 ml -1) = 0.005 ml </li></ol> Nota: per l&#39;infezione del numero di cellule più grandi, Scale Up utilizzando un MOI di 50 in un volume infezione di 165 microlitri per 10 6 cellule T naive in una provetta di polistirene con tazza sciolto (fino tp 3 ml per provetta). <ol start="4"><li> Incubare le cellule per 90 min a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. </li><li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente, togliere SN, risospendere in 200 l di PBS. Centrifugare nuovamente e togliere SN. </li></ol> (Opzionale: le cellule possono essere nuovamente lavati per rimuovere il virus in modo più efficiente) <ol start="6"><li> Risospendere le cellulein 200 microlitri di medie cellule T senza anticorpi stimolanti e senza IL-2 o di altre citochine e riposarsi per 40 ore a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore per consentire l&#39;espressione del gene di interesse prima dell&#39;attivazione. </li></ol> 7. T cellule attivazione e polarizzazione <ol><li> Pipetta un volume di anti-CD3 e anti-CD28 perline accoppiati che è uguale al numero delle cellule (ad esempio 4 x 10 5) in una piccola tazza reagente, aggiungere il volume di 10 volte di PBS e metterle su una calamita per 2 min . Rimuovere il surnatante e risospendere le sfere in 200 microlitri di polarizzazione media (per Treg: T medie delle cellule + 1 ng / ml TGFβ, 100 U / ml di IL-2). </li></ol> Nota: Le cellule possono anche essere attivati ​​utilizzando piatti di coltura tissutale sensibilizzate con anticorpi anti-CD28 e anti-CD3, o in una forma specifica del recettore DO11.10 cellule T usando irradiati BALB / c splenociti pulsate con ovalbumina 323-339 antigene peptidico. <ol start="2"><li> Centrifuge il riposato celle di prima, togliere il SN e risospendere le cellule in 200 microlitri polarizzante terreno contenente anti-CD3 e anti-CD28-anticorpi accoppiati perline. Incubare per 72 ore a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore senza cambiare mezzo. </li></ol> 8. T cellulare fissazione e la colorazione per Citometria a Flusso <ol><li> Lavare le cellule: Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente, togliere SN, risospendere in 200 l di PBS. Centrifugare nuovamente e togliere SN. Eseguire tutte le seguenti fasi di lavaggio di conseguenza. </li><li> Risospendere le cellule in 100 microlitri soluzione colorante cellulare morto risolvibile e incubare per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule, risospendere in 100 l di PBS, aggiungere 100 microlitri paraformaldeide al 4% in PBS, incubare 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule, li risospendere in 200 ml ghiacciata 70% di metanolo in PBS e incubare per 30 minuti in ghiaccio. </li></ol> Nota: Le celle possono essere trattati da ora in poi, senza precauzione rischio biologico!<ol start="5"><li> Preparare 60 ml master-mix di 60 microlitri di PBS + 10 mcg / ml Fc-block (anti-FCR3 per bloccare legame non specifico). Lavare le cellule, li risospendere in 40 ml di PBS + anti-FCR3 e incubare 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 20 ml di PBS + anti-FCR3 contenente 1 mg PE-accoppiato anticorpo anti-Foxp3, mescolare bene e incubare a 4 ° C durante la notte. </li><li> Lavare le cellule due volte in PBS e analizzare le cellule su un citofluorimetro. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi.

Generazione Virus e titolazione Per risultati ottimali trasfezione, la qualità e la quantità di vettore linearizzato appaiono più importante. Non abbiamo osservato effetti negativi sulla produzione di lisato primaria da una crescita eccessiva iniziale della cultura in quanto l&#39;infezione procede rapidamente una volta che la produzione di virus efficiente verifica. Tuttavia, la produzione di virus dalle cellule HEK293A può essere influenzata da lunghi inserti che diminuiscono l&#39;efficienza...

Tregs sono cruciali per mantenere la tolleranza immunitaria e per smorzare le risposte immunitarie superamenti. Treg sopprimere l&#39;attivazione delle cellule T astanti. Di conseguenza, l&#39;ablazione del Tregs porta ad autoimmunità fatale e autodistruzione guidato da cellule T attivate 1. Treg sviluppano nel timo durante la selezione negativa dei CD4 precursori single-positive, ma possono anche differenziarsi in periferia da CD4 naive cellule T dopo stimolazione antigene a basso dosaggio con subottimale di co-stimolazione 1,2. Timica Treg sembra sopprimere l&#39;autoimmunità tessuto contro auto-antigeni, mentre periferica Treg sono stati implicati nel fornire tolleranza nell&#39;intestino o polmonari. Questi indotta Treg potentemente prevenire l&#39;attivazione delle cellule T dopo il riconoscimento di antigeni estranei nella mucosa, tra antigeni ambientali da cibo e aria, batteri commensali, e allergeni 3,4. Inoltre, Tregs sono cruciali per stabilire la tolleranza materna al peptidi fetali 5 e quello di prevent malattia del trapianto contro l&#39;ospite 6. Allo stesso tempo, Tregs anche mediare effetti indesiderati attenuando sorveglianza immunitaria delle cellule tumorali 7,8. L&#39;elemento caratterizzante Tregs è l&#39;espressione del sottoinsieme specificando-fattore di trascrizione Foxp3, un fattore di trascrizione dominio contenente forcella-testa che è necessario e sufficiente per conferire funzione 9,10 Treg. Alcune vie di segnalazione che possono indurre l&#39;espressione Foxp3 sono noti. Tuttavia, i processi molecolari che controllano, regolano o modulano Treg differenziazione in risposta al recettore delle cellule T innescando sono meno conosciuti. Tregs molto efficace può essere indotta in vitro mediante la stimolazione delle cellule T CD4 naive con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 in presenza di TGFβ e IL-2 11. Come l&#39;emergente Treg sono funzionali in vivo, la manipolazione di molecole che promuovono la differenziazione Treg porta un enorme potenziale per il futuro therapies, per esempio, il trattamento di asma, malattia di Crohn, e trapianto 11,12. Viceversa, la modulazione terapeutica di molecole per bloccare differenziazione Treg può fornire beneficio in futuro approcci di trattamento combinato dei pazienti con tumori. Saggi in vitro hanno differenziazione state fondamentali per la descrizione delle modifiche molecolari che sono associati con T sottoinsieme differenziazione cellulare. Al momento, i tentativi sperimentali per cercare o schermo per prodotti genici che la differenziazione delle cellule T sono controllo ostacolata dal fatto che i metodi più comuni di espressione genica ectopica falliscono nelle cellule T naive. Per esempio, elettroporazione e trasduzione retrovirale sono efficaci solo in cellule T attivate. Contrariamente alle aspettative iniziali, trasduzione lentivirali, che è in genere efficace in cellule quiescenti, necessita di pre-attivazione delle cellule T naive dalle citochine 13. Inoltre, il trasferimento di cDNA o mRNA durante elettroporazionecomporta depolarizzazione della membrana plasmatica, che si conferisce caratteristiche di attivazione delle cellule T e può anche mobilizzare Ca2 + segnalazione e attivare le proteine ​​NFAT (osservazione inedito e rif. 14). Analogamente, per la trasduzione retrovirale, le cellule T naive devono essere attivati ​​per 18 - 40 hr. Durante questo tempo, la rottura della membrana nucleare nel corso della divisione cellulare si verifica e consente la successiva integrazione genomica del vettore retrovirale 15. Questi metodi non sono quindi in grado di affrontare la regolazione molecolare precoce di cellule T incontro iniziale con l&#39;antigene, che è la fase determinante di differenziazione delle cellule T helper. Trasduzione adenovirale è noto per conferire espressione genica transiente ectopica in un certo numero di tipi di cellule umane che esprimono il recettore umano Coxsackie adenovirus (CAR). Procede senza necessità di attivazione delle cellule o la progressione del ciclo cellulare. L&#39;espressione superficiale di CAR è essenziale per l&#39;attacco del virus efficiente e interiorizzazione, e l&#39;espressione transgenica della versione troncata CARΔ1 sotto una T promotore specifico delle cellule è stato trovato per rendere timociti topo e cellule T suscettibili alle infezioni adenovirale 16. È importante sottolineare che il transgene non altera sviluppo timociti o differenziazione in vitro di cellule CD4 T naive in diversi sottoinsiemi (dati non mostrati; rif 17.). Adenovirus-mediata trasduzione di cellule T è stato precedentemente utilizzato per la sovraespressione 17,18 e knock-down approcci 19,20. Le cellule T transgeniche possono essere purificati da disponibile in commercio DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. e ref 17.). Importante, trasduzione adenovirale permette un&#39;elevata espressione di un gene di interesse in cellule T naive senza indurre segni evidenti di attivazione. Le cellule T rimangono ingenui (basso CD44, CD62L alto) e di riposo (CD25 -, CD69 -) dopo infection e può essere attivato e differenziate in Treg simili alle cellule non infette. Produzione di adenovirus ricombinanti può essere raggiunto dopo la trasfezione di cellule con plasmidi HEK293A adenovirali (Figura 1). Questi plasmidi contengono in genere il tipo di adenovirus 5 genoma umano con i geni E1 ed E3 eliminati per rendere adenovirus ricombinanti replicazione-incompetenti 21. Cellule HEK293A completano carenza di replica in quanto sono stati immortalati attraverso l&#39;integrazione stabile di adenovirus tosato 22. Dal momento che i vettori adenovirus sono di grandi dimensioni (~ 40 kb) e di conseguenza non è adatto per la tradizionale restrizione enzimatica clonazione, abbiamo impiegato il sistema Gateway. Il gene di interesse viene inizialmente clonato in un vettore voce più piccola, dal quale può essere facilmente trasferito nel vettore adenovirale destinazione tramite reazione di ricombinazione lambda (LR) 23. Abbiamo costruito la pCAGAdDu vettorecombinando il promotore CAG (pollo promotore actina e CMV enhancer), con una cassetta di espressione contenente siti di LR che fiancheggiano il procariotica CCDB selezione marcatore 24. Questa cassetta di espressione è fuso ad un sito interno ingresso ribosoma (IRES) elemento che permette coexpression dell&#39;infezione marcatore proteina fluorescente verde rafforzata eucariotica (eGFP), che è fuso ad una sequenza contenente l&#39;ormone della crescita bovina poly (A)-segnale. Abbiamo scelto le sequenze cis-regolatori CAG, poiché il prototipo promotore CMV è risultato essere altamente attivazione-dipendente e pertanto sfavorevole per l&#39;espressione genica in cellule T naive. Qui, forniamo un protocollo per efficiente in vitro Treg differenziazione e un metodo per trasdurre CD4 naive cellule T senza attivazione (Figura 2). Il metodo consente di espressione genica ectopica o abbattere CD4 precedenti differenziazione delle cellule T allo stato ingenuo. Esso consente di testare l&#39;effetto di un overexpressed gene di interesse durante le prime manifestazioni di segnalazione alla stimolazione TCR iniziale fino T impegno sottoinsieme delle cellule. Nostri esperimenti di validazione forniscono anche la base per stabilire simile all&#39;applicazione adenovirus nella differenziazione di altri sottoinsiemi T cellule quali Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, o cellule tfh.

<table><tbody><tr><td>Kit di clonazione pENTR/D-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td>K240020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonasi II Miscela enzimatica</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R057S</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus-transfection</td><td>101-10N</td><td></td></tr><tr><td>HEK293A Linea cellulare</td><td>Invitrogen</td><td>R705-07</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>Piastre a 6 pozzetti CCL-185</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>piastra per coltura tissutale da 14 cm</td><td>Nunc</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta; 1)1Jdgr</td><td>Taconic Farms</td><td>Modello n. 4285</td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento delle cellule T CD4+ Naive II</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN Biotech</td><td>1502-P110704</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>NaPiruvato</td><td>Lonza</td><td>BE13-115E</td><td></td></tr><tr><td>NEAA 100x</td><td>Lonza</td><td>BE13-114E</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Soluzione tampone (1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>MEM Miscela vitaminica essenziale (100x)</td><td>Lonza</td><td>13-607C</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 per l'espansione e l'attivazione cellulare</td><td>Invitrogen</td><td>114-56D</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta umano ricombinante 1</td><td>R& D Systems</td><td>240B</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin S (18 x 106IE)</td><td>Novartis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit di colorazione di cellule morte blu riparabile</td><td>Invitrogen</td><td>L-23105</td><td></td></tr><tr><td>Mouse BD Fc BlockT</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td></td><td></td>4427975</tr><tr><td>LightCycler 480 Sonde Master</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td>04902343001</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa TaqMan MicroRNA</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td></td></tr></tbody></table>

trasduzione adenoviral di cd4 t naive cells allo studio differenziazione treg

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Cellule T regolatorie (Treg) sono essenziali per fornire la tolleranza immune da auto così come a certi antigeni estranei. Tregs può essere generato da CD4 naive cellule T in vitro con TCR-e co-stimolazione in presenza di TGFβ e IL-2. Questo porta il potenziale enorme per terapie future, tuttavia, le molecole e vie di segnalazione che la differenziazione di controllo sono in gran parte sconosciuti. Cellule T primarie possono essere manipolati attraverso l&#39;espressione genica ectopica, ma non riescono metodi comuni di indirizzare il più importante stato naif della cellula T prima del riconoscimento dell&#39;antigene primaria. Qui, forniamo un protocollo di esprimere geni ectopiche nelle cellule T CD4 naive in vitro prima di indurre la differenziazione Treg. Si applica la trasduzione con l&#39;adenovirus replica-carente e spiega la sua generazione e la produzione. L&#39;adenovirus può occupare una grande inserti (fino a 7 kb) e può essere dotato di promotori per realizzare alta e transitori Sovraespression nelle cellule T. E trasduce efficacemente le cellule T naive topo se esprimono un recettore adenovirus Coxsackie transgenico (CAR). Importante, dopo l&#39;infezione le cellule T naive rimangono (CD44 bassa, alta CD62L) e di riposo (CD25 -, CD69 -) e possono essere attivate e differenziate in Tregs simili alle cellule non infette. Così, questo metodo consente la manipolazione di cellule CD4 T differenziamento cellulare dal suo inizio. Essa assicura che l&#39;espressione genica ectopica è già in atto quando i primi eventi di segnalazione della stimolazione iniziale TCR induce cambiamenti cellulari che alla fine portano a Treg differenziazione.

Virus Produzione Per la generazione di viremia elevata, i tempi di raccolta delle cellule HEK293A nella produzione di virus primaria o amplificazione del virus è di fondamentale importanza. Rappresentativi immagini a contrasto di fase e fluorescenza con segni visivi di produzione di virus sono mostrati in Figura 3. Il CPE è stata osservata 10 giorni dopo la transfezione di cellule HEK293A con pCAGAdDu controllo vettoriale senza inserto. CPE sono caratterizzate dalla comparsa di...

Adenovirale trasferimento genico nelle cellule T CD4 naive con transgenici espressione del recettore adenovirus Coxsackie permette l&#39;analisi molecolare della differenziazione delle cellule T regolatorie<em&gt; In vitro</em&gt;.

Trasduzione Adenoviral di CD4 T naive Cells allo Studio Differenziazione Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro per la produzione di particelle adenovirali infettive utilizzate per trasdurre un gene di interesse in cellule T naive, che successivamente esprimono in modo atopico il transgene o si differenziano in cellule T regolatorie, o treg. Inizialmente, il gene di interesse viene clonato nel vettore adenovirale di destinazione. Il vettore viene quindi trasferito nella linea cellulare produttrice di adenovirus, HC 2 93 A, e vengono generate particelle adenovirali infettive.I virusi ottenuti vengono utilizzati per infettare linfociti T naïve di topi che esprimono un transgene per il recettore dell'adenovirus dopo l'infezione. Le cellule vengono quindi lasciate in riposo per garantire l'espressione del gene di interesse. Nei linfociti T naïve, le cellule T vengono attivate in condizioni polarizzanti per indurre la differenziazione in treg.Quindi le cellule vengono fissate e colorate per l'analisi citofluorimetrica. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano l'espressione del marcatore di differenziazione delle cellule Treg, Fox P tre, e del marcatore di infezione GFP, che potrebbe essere influenzata dal gene di interesse sovraespresso. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la trasduzione genica retrovirale, è che consente la sovraespressione di un gene di interesse in linfociti T naïve.Questo determina un elevato livello di sovraespressione presente al momento dell'attivazione delle cellule T. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle cellule T regolatorie. Ad esempio, riguardo alla regolazione genica post-trascrizionale che sottende l'instaurazione dell'identità delle cellule T-Rex.Iniziare questo protocollo clonando il gene di interesse in un vettore di entrata. Il gene di interesse amplificato mediante PCR è privo di estremità coesive e viene ligato nel vettore accoppiato alla topoisomerasi P enter D topo. Il gene di interesse viene quindi trasferito mediante ricombinazione LR nel vettore di destinazione P kakadu.Contiene i geni adenovirali e un sito di entrata ribosomica interno o IRES, seguito dal frame di lettura aperto di GFP, per creare un vettore di espressione adenovirale con un marcatore di infezione. Successivamente, 10 microgrammi del vettore di espressione adenovirale vengono linearizzati. In un PAC, dopo una digestione con enzimi di restrizione, il DNA viene quindi precipitato e risospeso in acqua a una concentrazione di tre microgrammi per 100 microlitri.La linearizzazione libera le ripetizioni invertite virali, o ITR, che sono necessarie per la replicazione e l'incapsulamento del DNA virale nelle particelle virali. Tutti i passaggi seguenti devono essere eseguiti nelle appropriate condizioni di sicurezza biologica per l'infezione da adenovirus. Per preparare il vettore linearizzato da utilizzare nella codiffusione, trasferire sei microlitri del reagente jet PEI in 94 microlitri di cloruro di sodio 50 micromolare e vortexare.In breve, aggiungere la soluzione mista a 100 microlitri di vettore adenovirale lineare mentre si effettua la vortexazione. Incubare la miscela di trasfezione per 15-30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere le cellule HEC 2 9 3 A cresciute fino al 50% di confluenza su piastre a sei pozzetti dall'incubatore.Aggiungere la soluzione in modo gocciolare nei pozzetti contenenti cellule HEC 2 9 3 A e incubare a 37 gradi Celsius e 10% di anidride carbonica. Aggiungere 0,5 millilitri di mezzo fresco ogni tre giorni, utilizzando l'espressione di GFP come marcatore di infezione. Valutare visivamente l'efficienza di trasfezione mediante microscopio a fluorescenza invertito ogni due o tre giorni, verificando la presenza di effetti citopatici evidenziati da aree con cellule ingrandite e arrotondate che iniziano a staccarsi.Questo indica una generazione efficiente del virus. Una volta comparse zone più ampie di effetti citopatici, tutte le cellule saranno infette entro 24-72 ore. Quando tutte le cellule mostrano segni di effetti citopatici, ma prima che avvenga un distacco generale delle cellule, raccogliere le cellule mediante pipettaggio delicato e trasferirle, insieme al sopranatante, in un tubo in polistirene da 15 millilitri.Per rompere le cellule, congelare le sospensioni su anidride carbonica solida per 15-20 minuti, quindi scongelarle rapidamente a 37 gradi Celsius. Ripetere questo ciclo di congelamento e scongelamento altre due volte. La sospensione di cellule lisate è ora indicata come lisato virale primario.Mantenere tutti i lisati virali sul ghiaccio. Se devono essere utilizzati entro un giorno per la conservazione a lungo termine, congelarli a meno 80 gradi Celsius. Tenere presente che ogni ulteriore ciclo di congelamento-scongelamento ridurrà il titolo virale del 30-50%. Per amplificare il lisato virale primario, infettare cellule HC 293A cresciute fino al 90% di confluenza su 15 piatti per coltura tissutale con metà del lisato virale primario e incubare per almeno 36 ore.Dopo 36 ore, verificare l'infezione mediante microscopia a fluorescenza: quasi tutte le cellule dovrebbero essere infette. Una volta che tutte le cellule mostrano effetti citopatici ma non distacco, raccogliere le cellule mediante pipettaggio delicato con produzione efficiente del virus. Questo stato viene raggiunto entro 48 ore dall'infezione; trasferire le cellule e il sopranatante in un tubo in polistirene da 50 millilitri.Centrifugare le cellule a 300 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in un volume adeguato di mezzo. Un millilitro dovrebbe produrre un titolo nell'intervallo da 10 alla 10a per millilitro.Eseguire tre cicli di congelamento e scongelamento come in precedenza per rompere le cellule. Quindi centrifugare a 900 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, trasferire con attenzione il soprannatante, ora indicato come lisato virale concentrato, in una provetta criogenica.Preparare aliquote per infezioni multiple e conservarle a meno 80 gradi Celsius. Infine, determinare il titolo virale mediante analisi del fax dell'espressione del marcatore di infezione in cellule 5 4 9. Secondo le istruzioni riportate nel documento allegato, questa parte del protocollo viene eseguita utilizzando cellule T CD4 naive isolate da topi transgenici D 1110 car delta 1 transgenici per esperimenti su piccola scala.Aggiungere un volume appropriato di lisato virale per ottenere un MOI di 50 in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo. Aggiungere fino a quattro volte 10 alla quinta cellule T in un volume finale di infezione di 50 microlitri in cellule T.Mezzo medio. Questa configurazione consente approcci sperimentali in parallelo. Incubare le cellule per 90 minuti a 37 gradi Celsius in un'incubatrice con anidride carbonica al 5%.Al termine dell'incubazione, centrifugare le cellule a 300 G per cinque minuti a temperatura ambiente; dopo la centrifugazione, risospendere in 200 microlitri di PBS, centrifugare nuovamente e rimuovere il sopranatante. Risospendere le cellule in 200 microlitri di mezzo per linfociti T privo di anticorpi stimolanti e privo di IL-2 o altre citochine. Successivamente, lasciare riposare le cellule per 40 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore con anidride carbonica al 5% per consentire l'espressione del gene di interesse prima dell'attivazione. Per attivare e polarizzare i linfociti T, pipettare in una piccola coppetta per reagenti delle microsferette coniugate con anti-CD3 e anti-CD28. Il numero di microsferette deve essere pari al numero di cellule, quindi aggiungere un volume di PBS dieci volte superiore e posizionare il campione su un magnete per due minuti.Successivamente, rimuovere il soprannatante e risospendere. Sospendere le perle in 200 microlitri di mezzo polarizzante, centrifugare le cellule a riposo a 300 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente; dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule in 200 microlitri di mezzo polarizzante contenente perle legate ad anticorpi. Incubare per 72 ore a 37 °C in un incubatore con 5% di anidride carbonica, senza cambiare il mezzo. Il protocollo per la colorazione e la fissazione è descritto brevemente qui.Prima di tutto, le cellule vengono lavate in PBS e incubate con una soluzione di colorazione per le cellule morte fissabile. Dopo un ulteriore passaggio di lavaggio, le cellule vengono fissate in paraformaldeide; a questo punto, dopo la fissazione, le cellule possono essere trattate senza precauzioni di biosicurezza per adenovirus. Successivamente, le cellule vengono lavate nuovamente e rese permeabili con metanolo. Dopo un altro passaggio di lavaggio, le cellule vengono incubate con anti-FCR tre per bloccare il legame non specifico.Infine, le cellule vengono incubate con gli anticorpi anti FCR tre e anti fox P tre marcati con PE. Esiste il rischio di perdere un numero elevato di cellule durante le fasi di fissazione e colorazione a causa dei numerosi lavaggi; per evitare perdite, assicurarsi di rimuovere il soprannatante immediatamente dopo la centrifugazione, senza disturbare il pellet con la punta della pipetta. Dopo aver effettuato la colorazione, lavare le cellule due volte in PBS ed analizzarle mediante citometria a flusso.Un lettore a 96 pozzetti sul citometro a flusso permette di eseguire l'infezione, la differenziazione, la fissazione e la colorazione dei linfociti T nello stesso piatto a 96 pozzetti, fornendo un flusso di lavoro efficiente per l'analisi parallela di molteplici condizioni; tuttavia, l'analisi può essere effettuata anche in provette standard per citofluorimetria al fine di valutare l'effetto dell'infezione da adenovirus sulla vitalità dei linfociti T e sulla loro differenziazione in cellule T regolatorie. Linfociti T naïve purificati da topi transgenici DO11.10 e car delta uno transgenici sono stati infettati con adenovirus di controllo a diversi MOI e attivati in condizioni di polarizzazione verso cellule T regolatorie. Le cellule fissate e colorate sono state analizzate mediante citofluorimetria per l'espressione del marcatore di infezione.Incorporazione di GFP di cellule morte e del marcatore di differenziazione. FOX P tre come mostrato qui. Aumentando il MOI da uno a 50 si ottiene una percentuale maggiore di cellule infette.Sebbene né la vitalità né la differenziazione in treg siano influenzate, per determinare se l'infezione da adenovirus incide sullo stato di attivazione dei linfociti T, cellule infette e non infette sono state analizzate per l'espressione di marcatori di attivazione e di quiescenza mediante facts come mostrato qui. L'espressione di questi marcatori risultava indistinguibile nelle cellule infette e non infette quando le cellule venivano successivamente attivate in condizioni di polarizzazione verso treg.L'upregolazione dei marcatori di attivazione e la downregolazione dei marcatori delle cellule T naive è risultata molto simile nelle cellule infette e non infette prese complessivamente. Questi dati indicano che un'infezione delle cellule T in stato naive non interferisce con l'attivazione successiva delle cellule T. Per verificare il livello di sovraespressione ottenuto con il protocollo di trasduzione adenovirale descritto, le cellule T naive sono state infettate con adenovirus codificante per il microRNA 155 o adenovirus di controllo a un MOI di 50. Le cellule sono state lasciate in riposo per 40 ore, attivate per 40 ore oppure lasciate in riposo per 40 ore seguito da un'attivazione di 40 ore. È stato generato il cDNA ed è stata determinata l'espressione del microRNA 155 rispetto al snoRNA 202.Mediante PCR quantitativa, i livelli di sovraespressione della microRNA 155 nelle cellule T naive mantenute a riposo per 40 ore corrispondono ai livelli endogeni di microRNA 155. Dopo 40 ore di attivazione delle cellule T, l'attivazione di tali cellule induce comunque un aumento della microRNA 155 dipendente dall'attivazione.Questo dimostra l'elevato livello di sovraespressione nei linfociti T naïve indotto dall'adenovirus, in aggiunta all'espressione di microRNA indotta dall'attivazione endogena. Una volta acquisita padronanza della procedura, la clonazione, la generazione del virus e l'infezione dei linfociti T possono essere completate entro quattro settimane. Il virus, una volta generato, può essere conservato a lungo termine oppure re-amplificato entro tre giorni.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di controllare attentamente tutti gli esperimenti con un vettore vuoto e di stabilire innanzitutto l'effetto dell'infezione adenovirale stessa sul processo in esame. Si tenga presente che l'infezione adenovirale e la sovraespressione sono transitorie e durano solo circa cinque-sette giorni.

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Vi presentiamo un protocollo per la produzione antigene-specifica topo le cellule T mediante trasduzione...

Trasduzione retrovirale di recettori delle cellule T nel topo le cellule T

Noi descriviamo un metodo per generare le cellule T normativo, di memoria e naif da un singolo donatore di sangue umano. Polarizzato Tregs può essere quindi confrontato con altri sottoinsiemi in una varietà di applicazioni genetiche e funzionali con omogeneità genetica, comprendente un saggio di soppressione anche dettagliati qui.

Generazione di cellule T regolatrici indotte da cellule primarie umane T naive e memoria

Con le funzioni effettrici distinto da altri sottoinsiemi di cellule T, le cellule Th17 sono stati implicati nel centro di autoimmunità infiammatoria. Questo protocollo vitro la differenziazione in Th17 fornisce un mezzo per determinare se naïve linfociti T CD4 + in grado di differenziarsi in cellule Th17, e di esaminare ulteriormente il loro ruolo nella autoimmunità e risposta dell'ospite.

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

Le cellule T CD4+ ingenue si polarizzano in vari sottoinsiemi a seconda dell'ambiente al momento dell'attivazione.  La differenziazione delle cellule T CD4+ naive in vari sottogruppi di effettori può essere ottenuta in vitro attraverso l'aggiunta di stimoli recettoriali delle cellule T e segnali specifici delle citochine.

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Qui, descriviamo un protocollo per analizzare il fenotipo delle cellule T regolatorie (Treg) isolate da topi naïve e cronici infetti dal virus della coriomeningite linfatica. Inoltre, forniamo un processo per valutare l'attività soppressiva delle cellule Treg.

Fenotipica e analisi funzionale di cellule T regolatorie attivati ​​Isolato dal linfocitica cronica coriomeningite topi infettati da virus

Molti sistemi sperimentali sono stati utilizzati per comprendere i meccanismi che regolano lo sviluppo delle cellule T e la funzione in una risposta immunitaria. Qui un approccio genetico mediante trasduzione retrovirale è descritto, che è economica, tempo efficiente e, soprattutto, altamente informativo nell'identificare vie di regolazione.

Trasduzione retrovirale di cellule T helper come un approccio genetico per studiare meccanismi che controllano la loro differenziazione e funzione

Questo protocollo descrive la generazione riproducibile e fenotipizzazione delle cellule T regolatorie indotte umane (iTregs) dalle cellule naïve T CD4 + in vitro. Diversi protocolli per l'induzione FOXP3 permettono lo studio di specifici fenotipi iTreg ottenuti con rispettivi protocolli.

La differenziazione in vitro di cellule CD4 + umana FOXP3 + indotta da T regolatorie (iTregs) da cellule T CD4 Naïve utilizzando un protocollo TGF-β contenenti

Questo protocollo descrive la differenziazione di cellule T CD4+ naive in cellule Th17 patogene in vitro. In particolare, se combinato con un approccio basato sulla citometria a flusso multiparametrica, è possibile ottenere una purezza del 90% delle cellule Th17 patogene da cellule T CD4+ naive utilizzando questo metodo di differenziazione.

Differenziazione in vitro di cellule T CD4+ naive in cellule Th17 patogene nel topo

L'attuale studio mostra protocolli per valutare l'impegno precoce del destino delle cellule TFH specifiche del virus e manipolare l'espressione genica in queste cellule.

Accesso alla differenziazione precoce della cellula T CD4+ helper follicolare virus-specifica nei topi acuti con infezione da LCMV

Presentiamo un protocollo per la trasduzione retrovirale dell'RNA guida in cellule T primarie da topi transgenici Cas9, fornendo un'alternativa efficiente per l'editing genetico nello studio del differenziamento Th17.

Targeting genico retrovirale mediato da CRISPR/Cas9 per lo studio della differenziazione Th17 in vitro

Scopri la trasduzione adenovirale per l'espressione genica ectopica in cellule T CD4 naive prima della differenziazione in cellule Treg. Questo metodo consente l'overespressione transitoria senza compromettere la vitalità cellulare.

Trasduzione Adenoviral di CD4 T naive Cells allo Studio Differenziazione Treg

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