Titolazione biochimica di glicogeno In vitro

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di titolare il glicogeno in vitro in campioni cellulari. Ciò si ottiene prima lizzando le cellule mediante disgregazione meccanica. Il secondo passo consiste nell'idrolizzare il glicogeno con l'alfa amilasi per ottenere il glucosio.

Successivamente, il glucosio viene ossidato producendo una specie fluorescente. Il passaggio finale consiste nel misurare la fluorescenza. In definitiva, la titolazione biochimica del glicogeno viene utilizzata per mostrare i cambiamenti nel contenuto di glicogeno nelle cellule.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che è competitiva, sensibile, accurata e molto specifica. Per iniziare questa procedura, seminare le cellule a una concentrazione da 0,5 a 2 milioni per piatto di 100 millimetri di diametro. Incubare le cellule per 24, 48 o 72 ore in ipossia in una postazione di lavoro anaerobica impostata all'1% di ossigeno, al 94% di azoto e al 5% di anidride carbonica.

Parallelamente, incubare un altro set di cellule in normossia per ogni condizione di ossigeno. Cambiare il terreno contenente glucosio da 25 millimolari ogni 24 ore per ridurre al minimo le variazioni della concentrazione di glucosio durante l'esperimento dopo il trattamento. Lavare le cellule due volte con PBS per rimuovere le tracce di glucosio dal terreno di coltura.

Quindi raschiare le cellule nella centrifuga PBS fredda, la soluzione PBS a 1000 RPM per cinque minuti. Scartare il surnatante e lavare il pellet una volta con PBS. Successivamente, sospendere nuovamente il pellet in 100 microlitri di acqua distillata e aggiungere 100 microlitri del tampone di idrolisi del glicogeno ottenuto da un kit per il dosaggio del glicogeno.

Far bollire il lisato a 95 gradi Celsius per cinque minuti per inattivare gli enzimi. Una volta che il lisato si è raffreddato a temperatura ambiente, agitare e centrifugare. Il lisato a 13.000 volte.

Gravità per 10 minuti per rimuovere i prodotti insolubili. Quindi mettere da parte il surnatante per normalizzare i livelli di glicogeno al contenuto proteico tra i campioni. Quantificare le proteine con 25-35 microlitri di surnatante utilizzando il saggio dell'acido bsico.

Dopo questa miscelazione, 50 microlitri del surnatante dei passaggi precedenti con un microlitro della miscela enzimatica per idrolisi. Incubare la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente e mettere da parte per preparare la curva di calibrazione standard, diluire il kit standard glicogeno con tampone di idrolisi per dare una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro. Quindi, aggiungi 0, 4, 8, 12, 16 e 20 microlitri dei 10 microgrammi per millilitro.

Standard in sei provette separate diluire ogni standard con tampone di idrolisi per ottenere un volume finale di 50 microlitri e una concentrazione di glicogeno rispettivamente di 0,04, 0,08, 0,12, 0,16 e 0,2 microgrammi per millilitro. Aggiungere un microlitro di miscela enzimatica per idrolisi agli standard e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per ogni condizione di ossigeno. Etichettare la provetta uno come concentrazione di glucosio libero e le provette due e tre come concentrazione di glucosio totale.

Quindi aggiungere 15 microlitri del surnatante estratto alla prima provetta seguita da 35 microlitri del tampone di idrolisi per ottenere un volume finale di 50 microlitri. La fluorescenza corrispondente alla concentrazione di glucosio libero sarà misurata in seguito. Aggiungere quattro microlitri di glicogeno idrolizzato alla provetta due e regolare fino a un volume finale di 50 microlitri con tampone di idrolisi.

Per mantenere i valori di fluorescenza entro le concentrazioni della curva di calibrazione, aggiungere due microlitri di glicogeno idrolizzato alla provetta tre e regolare fino a un volume finale di 50 microlitri con tampone di idrolisi. Successivamente, preparare una soluzione di sviluppo per tutti i campioni e gli standard mescolando 48,7 microlitri di tampone di sviluppo, un microlitro di miscela di enzimi di sviluppo e 0,3 microlitri di sonda Oxy Redd. Per ogni campione standard, aggiungere 50 microlitri di questa miscela a ciascuna provetta e incubare al buio per 30 minuti.

A temperatura ambiente per la misurazione della fluorescenza, impostare la fessura a tre nanometri per l'eccitazione e l'emissione, quindi misurare la fluorescenza. La regolazione dell'immagazzinamento e dell'ipossia del glicogeno è stata studiata poiché il glicogeno è il principale polimero energetico del glucosio nelle cellule di mammifero. Il calcolo e la standardizzazione della concentrazione di glicogeno negli stati cellulari sono stati eseguiti sui dati grezzi della fluorescenza.

Come mostrato qui dalle misurazioni fluorescenti, è stata calcolata la concentrazione totale di glucosio libero. Utilizzando questi risultati, è stata determinata la quantità di glucosio derivata dal glicogeno. Il test biochimico per il glicogeno ha confermato che gli aggregati densi di elettroni osservati sulle micrografie elettroniche delle cellule ccl 39 erano particelle di glicogeno.

L'accumulo di glicogeno e ipossia dipende dal fattore di trascrizione. Il fattore uno inducibile dall'ipossia, il principale fattore di trascrizione coinvolto nell'adattamento cellulare all'ipossia in diverse linee cellulari tumorali e non tumorali, il glicogeno immagazzinato può essere rapidamente metabolizzato dalla cellula in meno di sei ore. Inoltre, l'uso del glicogeno protegge dalla morte cellulare in condizioni di carenza di glucosio Seguendo questa procedura.

Inoltre, è possibile eseguire metodi come la microscopia elettronica e la colorazione periodica con spostamento acido per rispondere a ulteriori domande come la distribuzione del glicogeno nelle cellule.