Name: Trapianto nella camera anteriore dellocchio per longitudinale, non invasiva In vivo Imaging con Single-cella di risoluzione in tempo reale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Impara il trapianto di isole pancreatiche nella camera anteriore dell'occhio del topo per imaging longitudinale non invasivo. Questo metodo consente il monitoraggio in vivo con risoluzione a singola cellula per studi sul diabete.

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Riconosciamo Drs. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, Stephan Speier e Daniel Nyqvist per le discussioni fruttuose. Ringraziamo anche Eleut Hernandez e Diego Espinosa-Heidmann per l&#39;assistenza tecnica, e Mike e Margaret Valdes Formoso aiuto con registrazione video. Byron Maldonado registrare, modificare e prodotto il video finale. Sostegno alla ricerca è stato fornito dal Diabetes Research Institute Foundation ( <a href="http://www.DiabetesResearch.org" target="_blank">www.DiabetesResearch.org</a> ), il NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 di MHA, NIH RO3DK075487 ad AC; U01DK089538 a PO.B.). Sostegno alla ricerca addizionale PO.B stato fornito mediante fondi del Karolinska Institutet, il Consiglio svedese della ricerca, la Fondazione Diabete svedese, il Erling Persson-Family Foundation, la Famiglia Knut e Alice Wallenberg Foundation, la Skandia Insurance Company Ltd., VIBRANT ( FP7-228933-2), programma di ricerca strategica nel diabete al Karolinska Institutet, la Novo Nordisk Foundation e Fondazione Berth von Kantzow di.

La seguente procedura viene eseguita sotto la stereoscopio in due fasi, la prima fase consiste nel caricare le isolette nella cannula e la seconda fase è il trapianto effettivo nel ACE. Tutte le procedure eseguite su animali sono stati approvati dalla cura degli animali e del comitato istituzionale uso (IACUC) dell&#39;Università di Miami. 1. Isolotti Caricamento in Cannula per trapianto <ol><li> Centro gli isolotti in piastra di coltura, facendo girare il piatto nei circoli restringimento. </li><li> Scollegare la cannula del &quot;serbatoio&quot; e posizionare la cannula e il tubo di collegamento su una superficie pulita. Il serbatoio può essere realizzata con una punta di 300 ml monouso pipetta di plastica senza filtro (Figura 1a). </li><li> Lavare le bolle d&#39;aria dal serbatoio per garantire flusso continuo di isolette aspirazione quando nel serbatoio. Lavaggio del serbatoio è fatto da portare avanti a mani libere motorizzato siringa-driver usando il pedale(Figura 1b, c). Questo renderà anche spazio nella siringa per consentire l&#39;aspirazione degli isolotti nel serbatoio (pre-caricato con soluzione sterile come supporti salina, PBS o cultura). </li><li> Aspirare delicatamente quantità desiderata di isolotti nel serbatoio. Isolotti tenderà a ricciolo che entrano nel serbatoio e rimarrà insieme verso il basso. L&#39;aspirazione è fatto da guida in retromarcia il motore siringa driver usando il pedale. </li><li> Ricollegare la cannula al serbatoio attraverso il tubo di collegamento. </li><li> Posizionare la punta della cannula indietro nel piatto di coltura e lavare gli isolotti dal serbatoio nel tubo poi nella cannula. Assicurarsi che le isole restare insieme come back-riempire il tubo / cannula delicatamente &quot;sfogliando&quot; (tapping) il tubo (Figura 1d). Arrestare prima o dopo le bolle d&#39;aria prima delle isolette sono lavata la cannula. Se non è sicuro, come smettere isolotti immettere retro della cannula come aria rimanentebolle davanti a isole può aiutare a prevenire il reflusso (riflusso) di isolotti fuori dalla ACE. Will dissipare durante la notte. </li><li> A questo punto, si è pronti a iniettare le isole nel ACE (si prega di vedere i passi successivi). </li></ol> 2. Trapianto di Isole nella camera anteriore dell&#39;occhio <ol><li> Posizionare il mouse anestetizzato su un tappetino caldo sotto stereoscopio. </li><li> Posizionare il muso del mouse in anestesia &quot;maschera&quot; collegato all&#39;ossigeno / macchina di anestesia isoflurano. La maschera è realizzata su una punta di 1 ml pipetta monouso in plastica (senza filtro) e collegata al tubo anestesia attraverso l&#39;estremità stretta (Figura 2a, b). </li><li> Estrarre con cautela le palpebre dell&#39;occhio da trapiantare con il dito indice e il pollice della mano libera e &quot;pop&quot; l&#39;occhio per una migliore esposizione e di facile accesso (Figura 2c). Ciò richiederà una certa pratica per perfezionare senza ostacolare la respirazione del mouse da una pressione eccessiva sulcollo o bloccare il flusso di sangue alla testa. </li><li> Usando una siringa monouso di insulina (29 - 31G) come bisturi, cura solo la punta penetrare nella cornea e fare una singola incisione laterale. Effettuare l&#39;incisione al punto intermedio tra l&#39;apice della cornea e limbus minimizzare riflusso delle isolette durante l&#39;iniezione dal ACE (figura 2d). </li><li> Inserire delicatamente la cannula (precaricato con isolotti) attraverso l&#39;incisione. </li><li> Lentamente espellere isolotti fuori della cannula e depositarli sopra il diaframma. Per evitare il riflusso isolotto causa di un accumulo di pressione eccessiva nel ACE, espellere gli isolotti di spinte brevi come piccolo volume (s) possibile nel quadrante opposto della incisione. Questo può essere ulteriormente garantita da compattazione isolotti nel tubo durante il caricamento della cannula (si prega di vedere il punto 1.6). </li><li> Lentamente ritirare la cannula dalla ACE. Questa è una fase critica, in particolare, se un grande volume di isolotti stato iniettato come riflusso isolotto causa presche accumula all&#39;interno del ACE può essere inevitabile. Per eliminare / ridurre al minimo il reflusso isolotto, ruotare delicatamente la cannula mentre all&#39;interno della ACE per scaricare la pressione in eccesso attraverso l&#39;incisione intorno alla cannula. Verificare la presenza di segni di reflusso come si tenta di ritrarre la cannula e, se necessario, attendere fino alla scomparsa di pressione prima di ritrarre completamente la cannula dalla ACE. </li><li> Sciacquare l&#39;occhio trapiantato con PBS sterile o soluzione fisiologica. </li><li> Iniettare buprenorfina per postoperatoria (0,05-0,1 mg / kg, per via sottocutanea) per le prime 48 ore. </li><li> Applicare oftalmica unguento antibiotico eritromicina a occhio trapiantato immediatamente dopo il trapianto. </li><li> Posizionare l&#39;animale indietro in una gabbia riscaldata per permettere il recupero dall&#39;anestesia. </li></ol>

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PO.B. è uno dei fondatori della Biocrine società biotech, che sta per utilizzare la camera anteriore dell&#39;occhio come una piattaforma di servizio commerciale. AC è il brevetto che protegge questa tecnologia.

Isole pancreatiche murine sono state isolate mediante digestione con collagenasi seguita da purificazione su gradienti di densità, come descritto in precedenza 33. Isole isolate sono state coltivate durante la notte prima del trapianto. Mentre questo può non essere necessario, si raccomanda di consentire gli isolotti di recuperare dalla procedura di isolamento. Questo è fondamentale quando il trapianto viene eseguito nei pazienti diabetici in quanto garantirà il trapianto di sopravvivere / isole robuste. ...

I progressi nella microscopia intravitale hanno rivelato fenomeni fisiologici non previsto da studi in vitro 1. Questo mette in evidenza la sfida di tradurre i risultati ottenuti con convenzionali metodi in vitro nell&#39;animale vivente. Negli ultimi dieci anni, la visualizzazione dei tessuti negli animali vivi è stata notevolmente migliorata dai progressi tecnologici in modalità di imaging 2, 3, 4, 5, 6. Questo ha stimolato la necessità di approcci di imaging in vivo con applicazione realizzabile in modelli animali sperimentali per consentire la visualizzazione longitudinale dei tessuti bersaglio non invasivo. Le tecniche di imaging come la risonanza magnetica e la tomografia ad emissione di positroni o bioluminescenza hanno permesso non invasiva per immagini di organi / tessuti in profondità all&#39;interno del corpo 7-8, 9. Ma queste tecniche non possono realizzare singola cella di risoluzione a causa di segnali di fondo e alla bassa risoluzione spaziale, nonostante l&#39;uso of materiali ad alto contrasto o di tessuto-specifica 4 luminescenza. Questo è stato affrontato con l&#39;avvento di due fotoni microscopia a fluorescenza confocale 10. Due-fotone microscopia abilitato studi di imaging intravitale per visualizzare e quantificare gli eventi cellulari con dettagli senza precedenti 11, 12. Questo ha portato alla caratterizzazione dei principali processi biologici in salute e malattia 13, 14, 15, 16. Mentre pionieristici studi di imaging intravitale sono principalmente &quot;imitato&quot; in condizioni in vivo nel tessuto asportato (linfonodi ad esempio), altri studi hanno utilizzato poco invasive per tessuti bersaglio di immagini esposte in situ 17, 18, ​​19, 20, 21. Altri studi hanno utilizzato anche modelli a camera &quot;finestra&quot; per aggirare le limitazioni connesse con approcci invasivi e la risoluzione limitata di imaging in vivo 22, 23, 24, 25. Nel modello camera di finestra, una camera con una finestra trasparente viene impiantato chirurgicamente nella pelle con diffelocalità affitto (pelle dorsale o l&#39;orecchio, mammaria cuscinetto adiposo, fegato, ecc) su l&#39;animale (ad esempio topo, ratto, coniglio). Anche se questo approccio consente in modo chiaro ad alta risoluzione di immagini in vivo, che richiede un intervento chirurgico invasivo per impiantare la camera e non può essere in grado di ospitare studi di imaging longitudinale su diverse settimane o mesi 22. È stato recentemente dimostrato che la combinazione di alta risoluzione microscopia confocale con una procedura minimamente invasiva, ossia trapianto nella camera anteriore dell&#39;occhio (ACE) fornisce una &quot;finestra naturale corpo&quot; come un potente e versatile in vivo imaging piattaforma 26, 27. Trapianto nel ACE è stato usato negli ultimi decenni per studiare aspetti biologici di una varietà di tessuti 28, 29, 30, e la sua combinazione con la recente imaging ad alta risoluzione abilitato studiando la fisiologia delle isole pancreatiche con singola cella di risoluzione non- invasiva e longitudinalmente &lt;sup&gt; 26, 27. Questo approccio è stato utilizzato per studiare le risposte autoimmuni durante lo sviluppo di diabete di tipo 1 in modelli animali (dati non pubblicati). E &#39;stato anche utilizzato per studiare lo sviluppo del pancreas, così come, negli studi di funzione renale da trapianto in gemme pancreatiche l&#39;asso o singoli glomeruli renali, rispettivamente (dati non pubblicati). Un recente rapporto di questo approccio ulteriormente dimostrato la sua applicazione per studiare la risposta immunitaria dopo trapianto di isole pancreatiche 31. Importante, questo studio ha dimostrato che il trapianto nella camera anteriore dell&#39;occhio fornisce una finestra naturale del corpo per eseguire: (1) longitudinale, non invasiva dei tessuti trapiantati in vivo; (2) in vivo per valutare cytolabeling fenotipo cellulare e la vitalità in situ, (3) monitoraggio in tempo reale di infiltrare cellule immunitarie nel tessuto bersaglio, e (4) intervento locale per l&#39;applicazione topica o iniezione intraoculare. Qui, Siamo demonstrate come eseguire il trapianto nella camera anteriore dell&#39;occhio utilizzando isole pancreatiche.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Descrizione / Commenti </td></tr><tr><td> IsoTHESIA (isoflurano) </td><td> Buttler Animal Health di alimentazione </td><td> 11695-6775-2 </td><td> 99,9% isoflurano / ml </td></tr><tr><td> Ketaset (ketamina HCL) </td><td> Fort Dodge Animal Health </td><td> 0856-2013-01 </td><td> Alternative anestesia iniettabile </td></tr><tr><td> Beprenex (buprenorfina HCL) </td><td> Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. </td><td> 12496-075-7-1 </td><td> 0,3 mg / ml </td></tr><tr><td> Eritromicina unguento oftalmico USP, 0,5% </td><td> Akron </td><td> 17478-070-35 </td><td> Applicato profilassi per gli occhi trapiantati </td></tr><tr><td> Di sodio cloruro 0,9% (Saline) </td><td> Hospira Inc. </td><td> 0409-7983-03 </td><td> Per iniezione endovenosa. Sterile </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010-023 </td><td> 1X. Sterile </td></tr><tr><td> CMRL media 1066 </td><td> Cellgro </td><td> 98-304-CV </td><td> Completato, CIT modifica. Mezzi preferiti per isole </td></tr></tbody></table>

trapianto nella camera anteriore dell&#39;occhio per longitudinale, non invasiva<em&gt; in vivo</em&gt; imaging con single-cella di risoluzione in tempo reale

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Intravitale immagini è emerso come uno strumento indispensabile nella ricerca biologica. Nel processo, tecniche di imaging sono state sviluppate molte differenti per studiare processi biologici negli animali non invasivo. Tuttavia, un grande limite tecnico in vigore le modalità di imaging intravitale è l&#39;incapacità di combinare non invasivo, l&#39;imaging longitudinale con cella singola capacità di risoluzione. Mostriamo qui come il trapianto nella camera anteriore dell&#39;occhio elude tale limitazione significativa che offre una piattaforma versatile sperimentale che permette di non invasivo, l&#39;imaging longitudinale con risoluzione cellulare in vivo. Dimostriamo la procedura di trapianto nel topo e di fornire risultati rappresentativi utilizzando un modello con rilevanza clinica, in particolare trapianto di isole pancreatiche. Oltre a consentire la visualizzazione diretta in una varietà di tessuti trapiantati nella camera anteriore dell&#39;occhio, questo approccio fornisce una piattaforma per ghialonefarmaci n eseguendo a lungo termine di follow-up e il monitoraggio nei tessuti bersaglio. Grazie alla sua versatilità, tessuto / trapianto di cellule nella camera anteriore dell&#39;occhio non solo terapie di trapianto benefici, si estende ad altre applicazioni in vivo per studiare processi fisiologici e fisiopatologici quali trasduzione del segnale e nel cancro o sviluppo della malattia autoimmune.

Ci sono alcuni parametri che definiscono un trapianto &quot;buono&quot;. Un trapianto buona è quella che procede senza sanguinamento quando si effettua l&#39;incisione come si può vedere nel video. Sanguinamento è impedito / minimizzato penetrare solo la punta del bisturi (aghi) nel ACE (Figura 3a). Questo aiuterà anche a prevenire il contatto e la puntura dell&#39;iride. Essa garantirà inoltre una piccola incisione che guarirà molto bene senza causare opacità della cornea nel tempo (figura 3c, ...

Un nuovo approccio che combina il trapianto intraoculare e la microscopia confocale permette longitudinale, non invasivo imaging in tempo reale con singola cella di risoluzione all&#39;interno di tessuti innestati<em&gt; In vivo</em&gt;. Dimostriamo come trapiantare isole pancreatiche nella camera anteriore dell&#39;occhio mouse.

Trapianto nella camera anteriore dell&#39;occhio per longitudinale, non invasiva<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging con Single-cella di risoluzione in tempo reale

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Ciao, sono Doretta del Diabetes Research Institute presso la Miller School of Medicine dell'Università di Miami. In questo video mostrerò come trapiantare isolotti pancreatici nella camera anteriore dell'occhio del topo. La procedura prevede due passaggi.Il primo passo consiste nel caricare gli isolotti pancreatici isolati nella cannula, e il secondo passo è la procedura di trapianto vera e propria. Per informazioni dettagliate su strumentazione e reagenti, si prega di fare riferimento al testo allegato. Qui evidenziamo il driver motorizzato per siringa con la siringa montata e gli attacchi per il serbatoio e la cannula, che saranno al centro del video seguente.Iniziamo caricando gli occhielli nella cannula. Tutte le procedure vengono eseguite sotto il microscopio stereoscopico. Iniziare centrando gli occhielli ruotando la piastra in cerchi.Una volta centrato, scollegare la cannula dal serbatoio ed eliminare eventuali bolle d'aria spingendo in avanti il driver della siringa motorizzato. Questa operazione viene eseguita premendo il pedale anteriore. Quando si è pronti, iniziare ad aspirare gli occhielli nel serbatoio muovendo ora il driver della siringa motorizzato in direzione opposta.E nuovamente, ciò si ottiene premendo il pedale posteriore. Osservare come gli occhielli tendano ad accumularsi nella parte inferiore del serbatoio. Quindi ricollegare la cannula al serbatoio ed espellere gli occhielli dal serbatoio.Quindi inserire il tubicino nella cannula per staccare gli occhielli dal serbatoio e favorire il loro mantenimento all'interno del tubicino. Toccare leggermente il serbatoio mentre si sposta in avanti il driver della siringa motorizzata. Osservare quanto siano compatti gli occhielli all'interno del tubicino mentre iniziano a entrare nella parte posteriore della cannula.A questo punto, dovresti essere pronto per trapiantare gli anellini. Posiziona il topo di taglia NS su un supporto ed espone o fuoriesci l'occhio da trapiantare tirando la pelle della testa con l'indice e il pollice. Utilizzando un ago nuovo come bisturi.Avvicinarsi all'occhio con l'estremità smussata rivolta verso il basso per evitare contatti e lesioni dell'iride. Inserire la punta dell'ago nella cornea ed effettuare un'incisione laterale. Successivamente, introdurre la cannula, precaricata con le palpebre, nella camera interna attraverso l'incisione, e iniziare a infondere nuovamente gli occhielli nella camera azionando il driver della siringa motorizzato in avanti.Non preoccuparsi delle bolle d'aria che potrebbero rimanere intrappolate all'interno della cannula, poiché si dissolveranno successivamente. Inoltre, agiranno come una barriera naturale per ridurre al minimo o impedire il reflusso delle palpebre all'esterno della camera. Ritirare lentamente e con attenzione la cannula dall'interno della camera.Ora lavare l'occhio con PBS sterile. Iniettare l'analgesico di scelta e, infine, applicare un unguento oftalmico antibiotico. Il trapianto è terminato.Ora mostriamo risultati rappresentativi con palpebre pancreatiche trapiantate nella camera anteriore dell'occhio. Per studi di imaging longitudinali dei singoli occhietti al giorno sette. Dopo il trapianto, gli occhietti sono chiaramente attecchiti sulla superficie dell'iride entro il giorno 28.Gli occhielli si trovano nelle stesse posizioni osservate in precedenza 42 giorni dopo il trapianto. Gli occhielli sono chiaramente visibili nelle stesse posizioni. Si noti inoltre quanto bene si sia rimarginata l'incisione, escludendo qualsiasi possibilità di interferenza con l'acquisizione delle immagini dei singoli occhielli.

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Live tracking dei singoli progenitori retinici WT in background genetici distinti consente la valutazione del contributo delle cellule di segnalazione non autonomo durante la neurogenesi. Qui, una combinazione di knockdown gene, generazione chimera tramite trasferimento di embrioni in time-lapse imaging confocale vivo è stata utilizzata per questo scopo.

Imaging in vivo del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo

Cellule epiteliali del pigmento retinico potrebbero servire come una terapia di sostituzione delle cellule per la forma avanzata di degenerazione maculare senile secca. Questo protocollo descrive la generazione di un modello di grande-eyed di atrofia geografica e il subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivati da cellule staminali embrionali umane in questo modello della malattia.

Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed

L'obiettivo del protocollo è di mostrare longitudinale videomicroscopia tracking in tempo reale dei timociti di scansione microscopia in impianti timici nell'alloggiamento anteriore dell'occhio del mouse laser. La trasparenza della cornea e la vascolarizzazione dell'innesto permette di registrare continuamente reclutamento di cellule progenitrici e l'uscita di cellula T maturo.

Inseguimento In Vivo dei timociti nell'alloggiamento anteriore dell'occhio di microscopia a scansione Laser in tempo reale

Qui è presentata una piattaforma microscopica multifoto per l'imaging della superficie oculare del mouse vivo. Il mouse transgenico fluorescente consente la visualizzazione di nuclei cellulari, membrane cellulari, fibre nervose e capillari all'interno della superficie oculare. I segnali di seconda generazione armonica non lineari derivati da strutture collagenose forniscono immagini senza etichette per architetture tropiche.

Una piattaforma di microscopia multifoto personalizzata per l'imaging dal vivo di Mouse Cornea e Conjunctiva

L'imaging in vivo è un potente strumento per lo studio della biologia in salute e malattia. Questo protocollo descrive l'imaging transpupillare della retina del topo con un microscopio standard a due fotoni. Dimostra anche diversi metodi di imaging in vivoimaging per marcare in modo fluorescente più coorti cellulari della retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

Il protocollo presenta un nuovo strumento per semplificare l'imaging intravitale utilizzando la microscopia confocale invertita.

Approccio semplificato di imaging intravitale per il monitoraggio a lungo termine della dinamica del tessuto epiteliale su un microscopio confocale invertito

Qui, descriviamo una piattaforma che consente l'imaging non invasivo in vivo di sferoidi epatici innestati nella camera anteriore dell'occhio del topo. Il flusso di lavoro spazia dalla generazione di sferoidi da cellule epatiche primarie al trapianto nell'occhio di topo e all'imaging in vivo a risoluzione cellulare mediante microscopia confocale.

Imaging in vivo di sferoidi epatici trapiantati nella camera anteriore dell'occhio del topo

Alta frequenza Doppler è una nuova tecnologia per la valutazione della funzione miocardica regionale. Questo lavoro presenta prima prova che dimostrano l'applicabilità di questa piattaforma di imaging versatile per la misura ripetuta di ceppo del miocardio, insufficienza dp / dt, e mitralica nella ischemia-riperfuso (IR) cuore murini.

Ad alta frequenza ad alta risoluzione Ecocardiografia: Prima Prova a non invasiva misura ripetuta di deformazione miocardica, contrattilità, e rigurgito mitralico in Ischemia-riperfuso Cuore Murine

Siamo qui presentiamo un modello di trapianto di rene di ratto per valutare in modo non invasivo rigetto acuto utilizzando la tomografia ad emissione di positroni con 18F-fluorodeossiglucosio.

Imaging non invasivo di acuta Alloinnesto rigetto dopo trapianto renale Rat Utilizzo<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG PET

Abbiamo combinato nel dominio della frequenza del vicino infrarosso misure di spettroscopia di ossigenazione dell'emoglobina cerebrale con misure di spettroscopia di correlazione di diffuse indice flusso ematico cerebrale per stimare un indice di metabolismo dell'ossigeno. Abbiamo testato l'utilità di questa misura come strumento di screening letto per valutare la salute e lo sviluppo del cervello neonato.

Non invasiva di misurazione ottica del metabolismo cerebrale ed emodinamica nei neonati

Impara il trapianto di isole pancreatiche nella camera anteriore dell'occhio del topo per imaging longitudinale non invasivo. Questo metodo consente il monitoraggio in vivo con risoluzione a singola cellula per studi sul diabete.

Trapianto nella camera anteriore dellocchio per longitudinale, non invasiva In vivo Imaging con Single-cella di risoluzione in tempo reale (Video) | JoVE Journal

Trapianto nella camera anteriore dell'occhio per longitudinale, non invasiva

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