Name: Proteine saggezza: un banco di lavoro per In silico De novo Progettazione di biomolecole (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Scopri il design computazionale di proteine con Protein WISDOM per migliorare stabilità e affinità di legame. Questo strumento online permette di progettare biomolecole con proprietà ottimizzate per applicazioni biotecnologiche.

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CAF ringrazia il supporto di NSF, NIH (R01 GM52032; R24 GM069 736) e l'Agenzia per la protezione dell'ambiente degli Stati Uniti, EPA (R 832721-010). Una parte di questa ricerca è stata resa possibile grazie al sostegno del governo del DoD, Air Force Office of Scientific Research. JS ringrazia il sostegno di NIH (P50GM071508-06). MLBP riconosce con gratitudine il sostegno di una borsa di studio per laureati in scienze e ingegneria della difesa nazionale (NDSEG), 32 CFR 168a. GAK riconosce con gratitudine il sostegno di una borsa di studio per laureati in ricerca della National Science Foundation con il numero di sovvenzione DGE-1148900.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il framework di progettazione delle proteine de novo è costituito da due fasi, una fase di selezione della sequenza e una fase di convalida. Il framework è sufficientemente robusto da gestire modelli di progettazione rigidi e flessibili e può essere applicato a progetti di proteine singole o complesse. Il framework è stato applicato con successo a numerosi sistemi proteici con applicazioni a dozzine di malattie. Un certo numero di disegni sono stati convalidati sperimentalmente, fornendo i più potenti inibitori ...

Il design delle proteine de novo è l'identificazione di sequenze proteiche che produrranno una struttura terziaria desiderata con proprietà o funzioni migliorate. Poiché il ripiegamento nativo di una proteina è la conformazione che si trova al minimo di energia libera, la progettazione di proteine de novo cerca sequenze che avranno un minimo di energia libera nel ripiegamento bersaglio. Questo problema è stato descritto per la prima volta da Drexler1 e Pabo2 ed è stato definito "problema di ripiegamento inverso". Tuttavia, a differenza del problema del ripiegamento delle proteine, in cui una sequenza può produrre una sola soluzione di struttura ripiegata, il problema de novo della progettazione delle proteine mostra degenerazione. Molte diverse sequenze di amminoacidi possono produrre la stessa struttura e funzione terziaria.
Mentre la progettazione delle proteine è stata tradizionalmente eseguita sperimentalmente attraverso la progettazione razionale e l'evoluzione diretta, i metodi computazionali sono stati impiegati più recentemente per superare lo spazio di ricerca limitato inerente ai metodi sperimentali. Sono stati utilizzati una varietà di metodi computazionali, inclusi metodi deterministici, metodi stocastici e metodi probabilistici. 3,4 I primi metodi computazionali utilizzavano modelli a spina dorsale fissa per rendere il problema più facile da risolvere. 5-7 Con l'avvento di processori più veloci, calcolo ad alte prestazioni e algoritmi più efficienti, la flessibilità della dorsale è stata incorporata utilizzando un insieme di modelli a spina dorsale fissa8-14 o incorporando la vera flessibilità della dorsale esprimendo il modello in termini di intervalli di distanze da atomo ad atomo e angoli diedri. 15,16
Questo articolo descrive in dettaglio Protein WISDOM, uno strumento online che è stato messo a disposizione della comunità accademica per utilizzare il nostro framework computazionale di progettazione di proteine de novo. Questo quadro è stato applicato alla progettazione di numerose proteine, per uso terapeutico mirate a malattie come l'HIV, il cancro, le malattie del complemento e altre malattie autoimmuni. Molti dei peptidi previsti sono stati convalidati sperimentalmente, dimostrando la potenza del metodo. La tabella 1 fornisce un riepilogo delle diverse proteine che sono state progettate, comprese le dimensioni della proteina o del peptide, il numero di previsioni e la convalida sperimentale.
<bordo della tabella="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Progettazione delle proteine</td>
			<td>Lunghezza delle proteine</td>
			<td># di previsioni computazionali</td>
			<td># di Convalide Sperimentali</td>
			<td>riferimento</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progettazione dell'intera sequenza della beta-defensina-2 umana</td>
			<td>41</td>
			<td>340</td>
			<td> </td>
			<td>(17)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibitori della compstatina del C3 umano</td>
			<td>13</td>
			<td>28</td>
			<td>3/3</td>
			<td>(18, 19)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analoghi della compstatina che si legano al C3c di ratto</td>
			<td>13</td>
			<td>5</td>
			<td> </td>
			<td>E 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analoghi della Compstatin con estensione della di-serina</td>
			<td>15</td>
			<td>8</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Struttura stabilizzante dell'analogo della compstatina W4A9</td>
			<td>13</td>
			<td>18</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agonisti e antagonisti del recettore C3a</td>
			<td>77</td>
			<td>20</td>
			<td>4/7</td>
			<td>E 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agonisti e antagonisti del recettore C5a</td>
			<td>74</td>
			<td>61</td>
			<td>2/61</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibitori dell'HIV-1 gp14</td>
			<td>12</td>
			<td>6</td>
			<td>4/5</td>
			<td>(22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibitori dell'HIV-1 gp120</td>
			<td>9</td>
			<td>14</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibitori Bak di Bcl-x L e Bcl-2</td>
			<td>16-18</td> anni
			<td>10</td>
			<td>5/5</td>
			<td>(23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibitori di ERK2</td>
			<td>11</td>
			<td>25</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibitori di EZH2</td>
			<td>21</td>
			<td>17</td>
			<td>10/10</td>
			<td>(24)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibitori di LSD1 e LSD2</td>
			<td>16</td>
			<td>41</td>
			<td>17/20</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibitori di HLA-DR1</td>
			<td>13</td>
			<td>6</td>
			<td> </td>
			<td>(25)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inibitori della PNP</td>
			<td>5</td>
			<td>13</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1. Riassunto delle proteine e dei peptidi progettati utilizzando il framework di progettazione delle proteine de novo. Il # delle previsioni computazionali è presentato come il numero di previsioni favorevoli (cioè specificità di piegatura superiori a un certo cutoff o affinità di legame approssimate maggiori della sequenza nativa). Il # delle convalide sperimentali dà due numeri: il primo è il numero di previsioni che sono state convalidate sperimentalmente, mentre il secondo è il numero totale di previsioni che sono state testate sperimentalmente.
La progettazione della beta-defensina-2 umana (hβD-2) è stata eseguita per migliorare la proprietà antimicrobica del peptide. 17 Per questo disegno, abbiamo considerato due casi: 1) fino a 10 mutazioni lungo hβD-2 e 2) disegno a sequenza completa di tutte le posizioni dei residui di hβD-2 tranne le cisteine (8, 15, 20, 30, 37 e 38). Nella progettazione sono stati utilizzati tre diversi modelli di design e tre diversi modelli di selezione delle sequenze. Alti livelli di somiglianza nelle mutazioni sono stati osservati tra la media ponderata e i modelli di distance bin sia per il disegno a 10 mutazioni che per il disegno a sequenza completa. Inoltre, è stato riscontrato che un gran numero di sequenze ha valori di specificità di piegatura calcolati più favorevoli rispetto alla sequenza nativa.
Gli inibitori del sistema del complemento (di C3, C3a e C5a) sono stati progettati per combattere una serie di malattie immunitarie come ictus, infarto, morbo di Alzheimer, asma, artrite reumatoide, rigetto di xenotrapianto, malattie respiratorie adulte, psoriasi e morbo di Crohn. Tre inibitori della compstatina di C3c previsti dal framework di progettazione della proteina più tre sequenze progettate razionalmente sono stati convalidati sperimentalmente per essere leganti migliori rispetto alla compstatina nativa. 18,19
Ulteriori studi hanno esaminato la perdita di attività della compstatina contro il C3c non primate e hanno progettato una serie di inibitori C3c candidati per ratti e topi. Cinque sequenze hanno dimostrato di avere energie libere di associazione più favorevoli con il C3c di ratto rispetto al mutante della compstatina W4A9 noto per inibire il C3c. Ciò è dovuto a una nuova formazione di ponti salini da parte di Arg1. 20 Otto sequenze con un'estensione N-terminale sono state previste come leganti migliori di W4A9 con un'estensione di-Serine. Infine, è stato previsto che 18 sequenze di compstatina stabilizzino la conformazione legata di W4A9, fornendo forti candidati per inibitori di C3c primati e non primati.
Oltre agli inibitori C3c, sono stati progettati agonisti e antagonisti dei recettori C3a e C5a basati sulle strutture di C3a e C5a. Sette sequenze C3a previste dal modello sono state testate sperimentalmente. Due delle sequenze erano potenti agonisti, mentre altre due erano agonisti parziali. 21 I due potenti agonisti hanno mostrato un miglioramento di 58 volte rispetto a un "superagonista" precedentemente scoperto. La progettazione di agonisti e antagonisti del recettore C5a ha fornito un set di 61 sequenze. Tutte le sequenze sono state sintetizzate e due sono risultate essere nuovi agonisti del C5a.
Gli inibitori di fusione dell'HIV-1, il virus che causa l'AIDS, sono stati progettati per impedire all'HIV-1 di infettare le cellule. Il primo progetto ha preso di mira gp41, una glicoproteina dell'involucro dell'HIV-1. Il framework di progettazione delle proteine ha previsto sei sequenze che erano leganti migliori rispetto alla sequenza nativa. Quattro di queste sequenze previste sono state convalidate sperimentalmente per inibire l'HIV-1 con la migliore sequenza con un IC50 a partire da 29 μM. Questa sequenza ha mostrato un miglioramento di 3-15 volte rispetto alla sequenza nativa e non ha avuto alcuna perdita di attività contro un ceppo virale resistente all'Enfuvirtide. 22 Il secondo disegno ha preso di mira gp120, un'altra glicoproteina dell'involucro dell'HIV-1. Quattordici sequenze sono state previste come leganti di gp120 e forniscono ulteriori potenziali inibitori di fusione dell'HIV-1.
Numerose proteine legate al cancro hanno fornito bersagli promettenti per le terapie antitumorali. Bcl-2 e Bcl-xL sono proteine anti-apoptotiche che prevengono la morte cellulare. Gli inibitori di queste due proteine sono stati progettati per indurre la morte cellulare nelle cellule tumorali. Dieci sequenze sono state previste come leganti migliori rispetto a quelle native e questi risultati hanno catturato i precedenti risultati sperimentali e di mutagenesi. 23 Un'altra proteina bersaglio, ERK2, è coinvolta nelle cascate di trasduzione del segnale che la rendono un bersaglio promettente per le terapie antiproliferative contro il cancro. Venticinque sequenze sono state previste come inibitori di ERK2.
Le metiltransferasi e le demetilasi istoniche controllano dinamicamente la metilazione degli istoni, che è stata collegata a molti tipi di cancro tra cui prostata, mammella, linfoma, mieloma, vescica, colon, pelle, fegato, endometrio, polmone e gastrico. Il framework di progettazione proteica de novo ha identificato 17 inibitori di EZH2 (una lisina metiltransferasi) e dei dieci testati sperimentalmente, tutti sono risultati inibire EZH2. 24 Il peptide più potente aveva un IC50 di circa 13 μM, era ugualmente efficace con elevate concentrazioni enzimatiche e non competeva con il cofattore. Questi peptidi sono stati il primo set di inibitori di EZH2. 53 inibitori di LSD1 (una demetilasi) sono stati previsti dal quadro e dei 20 testati sperimentalmente, 17 erano inibitori di LSD1 e 18 erano inibitori di LSD2. I migliori inibitori avevano valori di IC50 inferiori a 1 μM, il che li rendeva gli inibitori peptidici più potenti scoperti fino ad oggi.
Gli ultimi due sistemi proteici hanno fornito bersagli per il trattamento di varie malattie autoimmuni come la celiachia, il diabete mellito di tipo 1, il lupus eritematoso sistemico, la sindrome di Sjögren, la sindrome di Churg-Strauss, la tiroidite di Hashimoto, il morbo di Graves, la porpora trombocitopenica idiopatica, l'artrite reumatoide e le allergie. Nessuno di questi potenziali inibitori è stato convalidato sperimentalmente, tuttavia il framework ha previsto sei sequenze che si legano a HLA-DR1 e 13 sequenze che si legano a PNP.
La Tabella 2 riassume gli inibitori e gli agonisti convalidati sperimentalmente previsti utilizzando il framework di progettazione delle proteine de novo. La metrica dell'affinità di legame approssimata è stata utilizzata per prevedere nove delle sequenze (inibitori di C3c umano, HIV-1 gp41, EZH2, LSD1 e LSD2), mentre la metrica della specificità del ripiegamento è stata utilizzata per identificare quattro delle sequenze (agonisti/antagonisti di C3aR). Questi peptidi evidenziano il successo del framework di progettazione proteica de novo, in particolare la metrica di affinità di legame approssimativa aggiunta. Il framework è estremamente versatile nella sua applicabilità. Sei diverse proteine legate a venticinque diverse malattie sono state progettate con successo e convalidate sperimentalmente.
<bordo della tabella="1" cellpadding="1" cellspacing="1" height="147" width="856">
	<tbody>
		<tr>
			<td>nome</td>
			<td>IC50</td>
			<td>EC50</td>
			<td>Bersaglio proteico</td>
			<td>Malattie applicabili</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ027</td>
			<td>0,94 μM</td>
			<td> </td>
			<td>umano C3c</td>
			<td colspan="1" rowspan="7">ictus, infarto, morbo di Alzheimer, asma, artrite reumatoide, lupus eritematoso sistemico, sclerosi multipla, psoriasi, diabete di tipo I, morbo di Crohn, pancreatite e fibrosi cistica</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ086</td>
			<td>1,98 μM</td>
			<td> </td>
			<td>umano C3c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ059</td>
			<td>4,73 μM</td>
			<td> </td>
			<td>umano C3c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ110-4</td>
			<td> </td>
			<td>15,2 nM</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ060-4</td>
			<td> </td>
			<td>36,4 nM</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ007-5</td>
			<td>15,4 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ002-5</td>
			<td>26,1 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ435</td>
			<td>29 - 253 μM</td>
			<td> </td>
			<td>HIV-1 gp41</td>
			<td>AIDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ037</td>
			<td>13,57 μM</td>
			<td> </td>
			<td>EZH2</td>
			<td colspan="1" rowspan="5">Cancro alla prostata, al seno, al linfoma, al mieloma, alla vescica, al colon, alla pelle, al fegato, all'endometrio, ai polmoni e allo stomaco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ011-1</td>
			<td>0,521 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ016-1</td>
			<td>0,249 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ026-1</td>
			<td>2,51 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ015-1</td>
			<td>1.332 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2. Peptidi predetti computazionalmente e convalidati sperimentalmente mirati a varie malattie.

proteine ​​saggezza: un banco di lavoro per<em&gt; in silico</em&gt;<em&gt; de novo</em&gt; progettazione di biomolecole

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

L&#39;obiettivo di disegno de novo di proteine ​​è di trovare le sequenze amminoacidiche che si piega in una struttura 3-dimensionale desiderata con miglioramenti nelle proprietà specifiche, quali affinità di legame, agonista o antagonista comportamento, o stabilità, relativi alla sequenza nativa. Progettazione di proteine ​​si trova al centro del progresso attuale progettazione di farmaci e di scoperta. Non solo progettazione di proteine ​​fornisce previsioni per bersagli farmacologici potenzialmente utili, ma migliora anche la nostra comprensione del processo di folding delle proteine ​​e le interazioni proteina-proteina. Metodi sperimentali come evoluzione diretta hanno dato risultati positivi in ​​progettazione di proteine. Tuttavia, tali metodi sono limitate dallo spazio sequenza limitata che possono essere cercati trattabile. In contrasto, strategie di progettazione computazionali permettono la proiezione di un insieme più ampio di sequenze che coprono una vasta gamma di proprietà e funzionalità. Abbiamo sviluppato una serie di calcolo de novo di proteine ​​disegno metoDS in grado di affrontare diverse importanti aree di progettazione di proteine. Questi includono la progettazione di proteine ​​monomeriche per una maggiore stabilità e complessi per una maggiore affinità di legame. Per diffondere questi metodi per il più ampio uso presentiamo SAGGEZZA Proteine ​​( <a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a> ), uno strumento che fornisce metodi automatici per una varietà di problemi di progettazione di proteine. Modelli strutturali sono state inoltrate per inizializzare il processo di progettazione. La prima fase di progettazione è una sequenza fase di selezione di ottimizzazione che mira a migliorare la stabilità mediante minimizzazione dell&#39;energia potenziale nello spazio sequenza. Sequenze selezionate sono poi eseguiti attraverso una fase di specificità piega e una fase di affinità di legame. Una lista ordinata rango delle sequenze per ogni fase del processo, insieme con strutture progettate pertinenti, fornisce all&#39;utente una valutazione quantitativa completa del disegno. Qui forniamo i dettagli of ciascun metodo di progettazione, così come diversi successi notevoli sperimentali ottenuti attraverso l&#39;uso dei metodi.

Progettazione De Novo di Inibitori dell'Entrata per l'HIV-1
Il framework di progettazione de novo implementato in Protein WISDOM è stato utilizzato per la progettazione di peptidi inibitori per diversi importanti sistemi terapeutici (Tabelle 1 e 2). Un sistema particolarmente rilevante è la progettazione di peptidi in grado di inibire l’ingresso dell’HIV-1 nel recettore cellulare ospite CD4, qui utilizzato come sistema rappresentativo per dimostrare l’utilizzo p...

Abbiamo sviluppato metodi computazionali di progettazione di proteine de novo in grado di affrontare diverse importanti aree della progettazione di proteine. Per diffondere questi metodi presentiamo Protein WISDOM, uno strumento online per la progettazione di proteine (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). Partendo da un modello strutturale, è possibile eseguire la progettazione di proteine monomeriche per una maggiore stabilità e di complessi per una maggiore affinità di legame.

Proteine ​​saggezza: un banco di lavoro per<em&gt; In silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Progettazione di biomolecole

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è progettare proteine o peptidi con proprietà migliorate di ripiegamento, legame o funzionali. Ciò si ottiene caricando la struttura della proteina o del complesso e definendo vincoli di mutazione e biologici. Come secondo passaggio, si definisce l'obiettivo di progettazione mediante un'ottimizzazione della selezione della sequenza, che produce un elevato numero di possibili sequenze di proteine o peptidi con proprietà migliorate di stabilità e interazione. Successivamente, ripiegamento.Viene effettuata un'analisi della specificità e/o del calcolo approssimativo dell'affinità di legame sulla sequenza progettata al fine di convalidare le proteine o i peptidi progettati per le proprietà migliorate desiderate. Si ottengono risultati che mostrano proprietà migliorate delle sequenze progettate, basati sull'analisi computazionale delle strutture ottenute attraverso la procedura. Questo protocollo è stato sviluppato nel laboratorio del Professor Chris Doles, un flautista presso l'Università di Princeton.Questo protocollo generale di progettazione computazionale *de novo* di proteine è in grado di affrontare diverse aree importanti della proget

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