Name: Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Impara un metodo rapido e riproducibile per indurre la transizione epitelio-mesenchimale (EMT) in vitro su diverse linee cellulari. Questa tecnica facilita lo studio della metastasi tumorale e lo screening di farmaci.

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Gli autori desiderano ringraziare Julia Hatler e Martin Ramsden (R &amp; D Systems) per l&#39;utile discussione e revisione del manoscritto.

1. L&#39;induzione di EMT <ol><li> Terreni di coltura riscaldare a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. I terreni di coltura utilizzato è lo stesso che i supporti utilizzati per la coltura standard le cellule di interesse. Ad esempio, la linea cellulare di carcinoma polmonare umano A549 è coltivato in F12 di Kaighn supplementato con 10% di siero bovino fetale e glutammina 2 mM. </li><li> Celle di raccolta di interesse utilizzando una soluzione di dissociazione (es. TrypLE Express). </li><li> Sospendere le cellule in terreni di coltura pre-riscaldato in una provetta da 15 ml. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 400 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante da versare in un contenitore per rifiuti. </li><li> Sospendere il pellet cellulare in mezzi di coltura pre-riscaldato. </li><li> Contare le cellule vitali utilizzando Trypan Blue. Rimuovere un campione della sospensione cellulare e diluire nel 0,4% soluzione Trypan Blue. Mettere 10 ml di campione diluito su un emocitometro e contare le cellule vitali (cellule che non diventano blu). Utilizzare conta delle cellule per determinare la cella densità nella soluzione. </li><li> Cellule piatto sulla coltura di tessuto trattati piastre o fiasche a 0,9-1,0 x 10 4 cellule per cm 2. Ad esempio, 0,5 x 10 6 cellule piastrate in una piastra a 100 mm in terreni di coltura contenente Supplemento 1X EMT Induzione supporti (6 ml supporti per mm piastra 100). </li><li> Cultura cellule placcato in C / 5% CO 2 incubatore 37 °. Controllo morfologia cellulare ogni giorno. </li><li> Tre giorni dopo la placcatura, rimuovere il supporto e sostituirlo con fresco terreni di coltura pre-riscaldato contenente Supplemento 1X EMT Indurre media. Continuare a cultura in un C / 5% CO 2 incubatore 37 °. </li><li> Cinque giorni dopo la placcatura, le cellule sono pronte per l&#39;analisi. Morfologia cellulare viene visualizzato al microscopio ottico invertito. </li></ol> 2. Analisi delle proteine ​​Expression da Immunocytochemistry <ol><li> Preparare sterili 12 millimetri coprioggetto per una piastra da 24 pozzetti mettendo coprioggetto in una capsula di Petri contenente il 95% di etanolo. Rimuovere delicatamente coprioggetto da etanolo noizione di un ago e pinze curve e fiamme sterilizzare. Mettere vetrino sterile in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Ripetere con rimanenti lamelle. </li><li> Preparare la sospensione cellulare come descritto nella sezione 1,1-1,7. </li><li> Piatto 1,6 x 10 4 cellule / pozzetto in 0,5 ml di media cultura pre-riscaldato contenente Supplemento 1X EMT Indurre media. </li><li> Crescere e nutrire le cellule, come descritto nelle sezioni 1,9-1,11. </li><li> Cinque giorni dopo la placcatura, rimuovere i supporti e fissare le cellule con 300 microlitri / pozzetto di 4% paraformaldeide in 1X tampone fosfato (PBS) per 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere fissativo e lavare le cellule 2x con PBS 1X, 500 microlitri / pozzetto. </li><li> Incubare le cellule in 400 microlitri / pozzetto di tampone di bloccaggio (1X PBS contenente 1% di albumina sierica bovina (BSA), siero asino normale 10%, e 0,3% Triton X-100) per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Incubare in anticorpo primario a costruttori consigliano di concentrazione in 400 microlitri / pozzetto di tampone di bloccaggio per 3 ore a temperatura ambiente temperaturE o la notte a 4 ° C. Quando si utilizza un anticorpo primario direttamente coniugato ad un fluorocromo, incubare campioni al buio. </li><li> Lavare le cellule tre volte in 500 microlitri / pozzetto di 1X PBS contenente 0,1% BSA per 5 minuti ogni lavaggio. Quando si utilizza un anticorpo primario direttamente coniugato ad un fluorocromo, passare direttamente al punto 2.12. </li><li> Incubare le cellule in anticorpo secondario a concentrazione raccomandata dal produttore in 400 pl / pozzetto di 1X PBS contenente 1% BSA per 1 ora a temperatura ambiente al buio. </li><li> Lavare le cellule tre volte in 500 microlitri / pozzetto di 1X PBS contenente 0,1% BSA per 5 minuti ogni lavaggio. </li><li> Se lo si desidera, nuclei con soluzione colorante di contrasto DAPI. </li><li> Lavare le cellule in acqua deionizzata e montare vetrini a faccia in giù su un vetrino utilizzando supporti di montaggio. </li></ol>

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</ol>

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I metodi precedenti per l&#39;induzione EMT sono generalmente utilizzati TGF-β stimolazione o modificazione genetica. Sebbene TGF-β da solo ha mostrato di indurre EMT in alcuni tipi di cellule, è stato ora dimostrato che TGF-β è necessaria per EMT, ma non è sufficiente in tutti i tipi di cellule 6,14. Utilizzo di modificazione genetica per l&#39;induzione EMT è in termini di tempo e manodopera. Il metodo qui descritto utilizza una combinazione di fattori, tra cui, E-caderina anti-umano, sFRP-1 anti-umano, Dkk-1 anti-umano, ricombinante umano Wnt-5a e ricombinante TGF-β1 umano per indurre affidabile EMT. Questa combinazione di fattori è progettata per bloccare E-base-caderina adesione, un passaggio critico per l&#39;induzione EMT 4, e migliorare Wnt aggiungendo la proteina Wnt-5a nonché utilizzando anticorpi bloccanti agli inibitori di Wnt, sFRP-1 e Dkk -1. Wnt e TGF-β hanno dimostrato di agire in un loop autocrino per indurre e mantenere la stat cellule mesenchimalie 6. Questo metodo di induzione evita la manipolazione genetica ed è più efficace rispetto all&#39;utilizzo di TGF-β alone. Importante, siamo in grado di osservare l&#39;induzione di EMT in tipi cellulari, comprese MCF7 e PANC-1 le cellule, che sono stati precedentemente mostrato di non rispondere esclusivamente alla stimolazione TGF-β (figura 5) 14. Le cellule trattate con supplemento spettacolo EMT Indurre media morfologia fusiforme meno compatto e aumentata (Figura 1). Inoltre, vi è una riduzione della superficie E-caderina espressione concomitante con un aumento della fibronectina, che sono caratteristiche di EMT (figure 2 e 3). Altri marcatori mesenchimali quali Vimentin e la lumaca sono anche sovraregolati nelle EMT cellule indotte, rispetto ai controlli non indotte (Figura 4). Aumento capacità di migrazione e di invasione sono le principali caratteristiche funzionali delle cellule mesenchimali. In in vitro </em&gt; Migrazione e l&#39;invasione saggi, cellule trattate con supplemento EMT Induzione supporti dimostrato un significativo aumento di capacità di migrare e invadere (Figura 6). Questo semplice metodo per l&#39;induzione EMT è utile per lo studio di segnalazione EMT come dimostrato utilizzando i dati di espressione di matrice anticorpo mostrati nella Figura 7. Diversi tipi di cellule possono essere confrontati pre-e post-induzione EMT avere profili di espressione comuni associati con EMT, come l&#39;aumento della CREB fosforilato e ERK1 / 2 risulta sia MCF7 e cellule EMT indotta A549. S133 fosforilazione di CREB stimola legame al DNA ed è stato dimostrato di agire a valle di TGF-β1-indotta EMT 15. ERK1 / 2 fosforilazione è stato anche dimostrato di agire a valle di TGF-β1-indotta EMT 16. Le differenze a vie di segnalazione tra tipi cellule possono anche essere chiariti come visto con l&#39;aumento della GSK-3β fosforilazione in cellule A549 rispetto p70S6K fosforilazione in MCF7. GSK-3β fosforilazione della serina 9 diminuisce funzione, e GSK-3β ha dimostrato di inibire il fattore di trascrizione pro-EMT, lumaca 17. Al contrario, p70S6K induce l&#39;attività della lumaca e la sua fosforilazione è associata con l&#39;attivazione di questa proteina 18. Nel complesso, l&#39;induzione semplice e affidabile di EMT, in particolare nelle cellule precedentemente indicate non rispondere unicamente a TGF-β, è utile per comprendere la biologia di EMT, identificando firme espressione comune per l&#39;uso come marcatori prognostici, e sviluppare e valutare nuove terapie per il cancro e la malattia fibrotica.

La transizione epitelio mesenchimale (EMT) è il processo mediante il quale una cellula epiteliale polarizzata subisce vari cambiamenti risultanti in una cella mesenchimali fibroblasto-come altamente mobili. Questo processo avviene, in parte, attraverso cambiamenti di espressione genica e della degradazione delle giunzioni adherens, con un conseguente aumento della capacità di migrare e invadere. Fisiologicamente, EMT svolge un ruolo importante durante lo sviluppo embrionale e la guarigione delle ferite. Perdita di controllo adeguato su EMT può portare a fibrosi e metastasi dei carcinomi 1,2. La riduzione di E-caderina sulla superficie delle cellule epiteliali è una fase critica nella progressione di una cellula attraverso EMT 3,4. E-caderina è una proteina transmembrana a passaggio singolo che interagisce direttamente con le proteine ​​caderina sulle cellule adiacenti. Oltre al suo ruolo nella adesione cellulare, segnalazione E-caderina influenze cellulare tramite interazioni tra la coda citoplasmatica di E-caderina unda varietà di proteine ​​regolatrici, in particolare β-catenina. β-catenina gioca un ruolo nella stabilizzazione adherens giunzioni. Durante segnalazione canonica Wnt, β-catenina viene rilasciato da E-caderina e traslocato nel nucleo dove agisce come un fattore di trascrizione a valle nel pathway Wnt 3,4,5. Nel nucleo, β-catenina ha dimostrato di aumentare la trascrizione di numerosi fattori EMT-relativi compreso Twist, Slug, fibronectina, e una varietà di metalloproteasi della matrice 3,6. Oltre a Wnts, segnalazione del TGF-β ha dimostrato di giocare un ruolo significativo nella induzione EMT sia durante lo sviluppo normale e in stati malati 7,8,9. TGF-β è coinvolto nella EMT che si verifica durante la formazione palato e nel cuore di sviluppo 10. E &#39;stato anche implicato nella fibrosi e nella progressione del cancro alla metastasi 7. La procedura qui descritta provides induzione di EMT consistente in una varietà di tipi di cellule senza la necessità di manipolazione genetica. Questa procedura utilizza un cocktail di E-caderina, sFRP-1, e Dkk-1 bloccanti anticorpi e Wnt-5a e proteine ​​ricombinanti TGF-β1. Questo cocktail è stato progettato per bloccare E-caderina base di aderenza, migliorando Wnt e TGF-β. La possibilità per l&#39;induzione EMT robusto è fondamentale per la comprensione della biologia di questo processo e come manipolare per scopi terapeutici. Indicatori comuni correnti di EMT, E-caderina (inibiti in EMT) e Vimentin (sovraregolata in EMT), si possono trovare co-espressi nei tumori e quindi non forniscono le migliori marcatori diagnostici di potenziali cellule metastatiche 12. È importante sottolineare che l&#39;analisi di una varietà di tipi di cellule che hanno subito EMT è utile sviluppare firme espressione genica comuni che possono essere utilizzati per scopi diagnostici in cancro e fibrosi 11. Inoltre, recenti studi hanno dimostrato che EMT può giocare un ruolo nella formazione di cellule staminali tumorali, suggerendo che le cellule che hanno subito EMT possono essere utili per lo screening di farmaci per identificare composti che possono indirizzare queste cellule 13.

<table><tbody><tr><td>Cellule epiteliali di interesse</td><td></td><td></td><td>Abbiamo testato: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7 e PANC1</td></tr><tr><td>Integratore di terreni che inducono EMT</td><td>R& D Systems</td><td>CCM017</td><td></td></tr><tr><td>TGF umano ricombinante-&#946; 1</td><td>R& D Systems</td><td>240-B</td><td>utilizzato a 10 ng/ml</td></tr><tr><td>anticorpo coniugato anti-E-caderina NL557</td><td>R& D Systems</td><td>NL648R</td><td>Utilizzato a una diluizione 1:10 per immunocitochimica</td></tr><tr><td>Anti-E-Caderina </td><td>R& I sistemi D</td><td>MAB1838</td><td>utilizzati a 0,1 &mu; g/ml per western blotting</td></tr><tr><td>Anti-Fibronectina</td><td>R& I sistemi D</td><td>MAB1918</td><td>utilizzati a 10 &mu; g/ml per immunocitochimica; Usato a 0,5 &mu; g/ml per western blotting</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>R& D Systems</td><td>AF5718</td><td>Usato a 0,2 &mu; g/ml per western blotting</td></tr><tr><td>Capra Anti-Topo NL493 Anticorpo secondario</td><td>R & D Systems</td><td>NL009</td><td>Utilizzato a una diluizione 1:200 per immunocitochimica</td></tr><tr><td>Asino Anti-capra HRP Anticorpo</td><td>secondario R& D Systems</td><td>HAF109</td><td>utilizzato a 1:2000 per western blotting</td></tr><tr><td>capra anticorpo secondario HRP anti-topo</td><td>r & D Systems</td><td>HAF007</td><td>Utilizzato a 1:2000 per western blotting</td></tr><tr><td>EMT Kit di immunocitochimica a 3 colori</td><td>R & D Systems</td><td>SC026</td><td>Usato secondo il produttore' . Questo kit contiene anticorpi direttamente coniugati contro E-caderina, Vimentina e Lumaca.</td></tr><tr><td>96 pozzetti BME Cell Invasion Assay</td><td>R& D Systems</td><td>3455-096-K</td><td>Questo kit è stato utilizzato secondo le raccomandazioni del produttore.</td></tr><tr><td>Proteome Profiler Kit array fosfo-MAPK umano</td><td>r & D Systems</td><td>ARY002B</td><td>Questo kit è stato utilizzato secondo le raccomandazioni del produttore19.</td></tr><tr><td>Supporti di montaggio</td><td>R& D Systems</td><td>CTS011</td><td></td></tr><tr><td>0,4% Trypan Blue</td><td>Solution Life Technologies</td><td>15350-061</td><td></td></tr><tr><td>1X Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>95% Etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Jackson Labs</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Roche Molecular Biochemicals</td><td>789-704</td><td>Diluire in 1X PBS per ottenere una soluzione madre al 10%</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Diluire in 1X PBS a una concentrazione di lavoro del 4%.</td></tr><tr><td>Soluzione DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Preparare la soluzione madre a 14,3 mM sciogliendola in acqua. La soluzione di lavoro è una diluizione 1:5000 della soluzione madre in 1X PBS.</td></tr><tr><td>Pinza curva a punta fine</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti da 12 mm</td><td>Carolina Biological</td><td>633009</td><td></td></tr><tr><td>Latte</td><td></td><td></td> in polvere scremato <td>Utilizzato al 5% in TBST per il blocco del Western blotting</td></tr><tr><td>TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]</td><td></td><td></td><td>Per il blocco del western blotting e il lavaggio</td></tr><tr><td>Membrana</td><td></td><td></td> <td>in PVDFPer western blotting </td></tr><tr><td>4-20% SDS-page gel</td><td></td><td></td><td>Per western blotting</td></tr><tr><td>Substrato</td><td></td><td></td> ECL <td>Per western blotting</td></tr><tr><td>Provette</td><td></td><td></td><td></td>coniche da 15 ml</tr><tr><td>Piastre/matracce, piastre a</td> 24 pozzetti trattate <td></td><td></td><td></td>con coltura</tr><tr><td>tissutale, pipette</td>/puntali per <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>per pipette / pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Bagno d'acqua</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 gradi C/5%CO2 Incubatore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Microscopio <td></td><td></td><td></td>a<td>luce invertita</td></tr><tr>Microscopio <td></td><td></td><td></td>a<td>fluorescenza</td></tr></tbody></table>

induzione e analisi dei epiteliale a mesenchymal transizione

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

La transizione epitelio mesenchimale (EMT) è essenziale per il corretto morfogenesi durante lo sviluppo. Una cattiva regolazione di questo processo è stato implicato come un evento chiave nella fibrosi e la progressione dei carcinomi a uno stato metastatico. Comprendere i processi che sono alla base EMT è indispensabile per la diagnosi precoce e il controllo clinico di questi stati patologici. Induzione affidabile di EMT in vitro è un utile strumento per la scoperta di farmaci e di identificare firme comuni espressione genica per scopi diagnostici. Qui mostriamo un metodo semplice per l&#39;induzione di EMT in una varietà di tipi cellulari. Sono inclusi anche i metodi per l&#39;analisi di cellule pre-e post-induzione EMT immunocitochimica. Inoltre, abbiamo dimostrato l&#39;efficacia di questo metodo attraverso l&#39;analisi di matrice a base di anticorpi e saggi di migrazione / invasione.

. EMT inducono condizioni di coltura qui descritti forniscono un metodo robusto per l&#39;induzione di EMT in una varietà di tipi cellulari Figure 1 e 2 dimostrano la morfologia e livelli di espressione marcatore per 4 diverse linee cellulari umane: cellule di glioblastoma T98G, cellule HT29 colon adenocarcinoma , cellule di carcinoma del polmone A549, e cellule epiteliali mammarie MCF10A. Le cellule che sono stati trattati con supplemento EMT Indurre media modificate da una morfologia classica epiteliale (Figure 1A - 1D) per un mesenchimale, morfologia fusiforme (Figure 1E - 1H). Cellule EMT-indotte sono apparsi meno densamente in colonie stretti rispetto alle cellule non indotte. Campioni uninduced MCF10A contenute cluster serrato circondate da cellule più liberamente al sacco. Questi cluster serrato erano E-caderina positivi (Figura 2D) e scomparvero in seguito al trattamento con l&#39;EMT Indurre media Supplement (Figura 2H). EMT è stata anche valutata la down-regulation dei marcatori epiteliali e up-regulation dei marcatori mesenchimali. Il downregulation di E-caderina è tipicamente osservata in seguito all&#39;induzione EMT in diversi tipi cellulari 3,4 Figura 2 dimostra superficie espressione di E-caderina nella maggior parte delle cellule non trattate (Figure 2A - 2D, rosso). Rispetto alla sua assenza dopo induzione di EMT (Figure 2E - 2H, rosso). Una linea cellulare, T98G, è stato trovato per avere un bassissimo livello basale di E-caderina prima dell&#39;induzione EMT, che precludeva la sua analisi. Upregulation del marker mesenchimale, fibronectina, era visibile anche dopo induzione con supplemento EMT Indurre media (Figure 2A - 2D contro Cifre 2E - 2H, verde). I livelli di espressione di E-caderina e fibronectina visti da immunocitochimicasono state ulteriormente confermate attraverso western blotting di lisati cellulari totali (Figura 3). Il Western Blot ha confermato down-regulation di E-caderina e aumenta i fibronectina visto da immunocitochimica. Le bande sono state quantificate mediante densitometria e normalizzati per GAPDH per determinare il cambiamento volte rispetto dopo induzione EMT. Livelli di E-caderina sono stati ridotti del 6,4 e 3,4 volte in A549 e cellule MCF10A, rispettivamente. Livelli di fibronectina sono stati aumentati 4.6, 4.1, e 2.3 volte nei T98G, A549, e le cellule MCF10A, rispettivamente. Sebbene il western blot non mostra una significativa riduzione dei livelli della proteina E-caderina in cellule HT29 induzione post-EMT, i risultati immunocitochimica dimostrano una riduzione della superficie espressione di E-caderina (Figura 2B contro 2F), che non può essere distinto in western blotting dei lisati cellulari totali. Per valutare ulteriormente lo stato EMT, ulteriore indicatore di notas per EMT sono stati analizzati pre-e post-induzione di EMT. Coerentemente con i risultati precedenti, E-caderina è stato downregulated in tutte le linee cellulari esaminati, indicando che EMT è stata indotta. Inoltre, i marcatori mesenchimali, vimentina e lumaca, sono stati upregulated in A549, T98G, e cellule MCF10A dopo il trattamento con supplemento EMT Induzione media (Figura 4). La linea cellulare HT29 non ha mostrato espressione di questi marcatori mesenchimali con o senza induzione EMT (dati non mostrati), che può indicare che queste cellule utilizzano percorsi alternativi per induzione EMT. Sebbene TGF-β è sufficiente per indurre EMT in certa cella contesti 7,8,9, altri tipi di cellule non rispondono alla sola aggiunta di TGF-β 14. Materno umano le cellule tumorali MCF7 e PANC-1 le cellule di carcinoma pancreatico umano sono entrambi segnalati non rispondere a del TGF-β segnalazione solo il 14. Per determinare se entrambe le linee potrebbero subire EMT in VitrO, le cellule sono state coltivate in presenza del Supplemento EMT Indurre multimediale. Le cellule sono state stimolate con ricombinante TGF-β1 da solo, alla concentrazione nel Supplemento EMT Indurre media. Queste cellule mantengono la loro morfologia epiteliale, costituito da colonie serrato di cellule (dati non riportati) e livelli di E-caderina superficie sono stati simili a quelli osservati in cellule di controllo (Figure 5C e 5D contro Figure 5A e 5B). Al contrario, cellule stimolate con supplemento EMT Induzione media hanno mostrato una drastica riduzione dei livelli di E-caderina superficiali (Figure 5E e 5F). Queste cellule ottenuti anche una più mesenchimale morfologia, come cellule divennero meno compatta e più mandrino-like (dati non mostrati). Questi risultati dimostrano che il metodo EMT inducendo qui descritta è in grado di promuovere EMT morfologia e marcatori cambiamenti di espressione in cellule tipicamente resistenti al TGF-β-iEMT nduced. In aggiunta ai cambiamenti nell&#39;espressione di servirlo, un altro segno distintivo di cellule mesenchimali è la loro capacità di migrare e invadere. La migrazione e l&#39;invasione delle cellule in coltura con o senza supplemento EMT Indurre media sono stati analizzati utilizzando il 96 e BME cellulare Invasion test secondo le istruzioni del produttore. Brevemente, le cellule sono state seminate su piastre da 96 pozzetti (50.000 cellule / pozzetto) contenente inserti del filtro con pori 8,0 micron. Dopo 48 ore, la migrazione è stata valutata mediante calceina AM colorazione di cellule che erano migrate attraverso il filtro. Ciascun campione è stato testato in triplicato due volte con risultati simili. Risultati rappresentativi di un esperimento sono mostrati in Figura 6A. Aumenti statisticamente significativi (p-value &lt;0.003) nella migrazione delle cellule sono stati osservati sia con A549 e PANC-1 le cellule dopo induzione EMT. Per valutare la capacità di queste cellule di invadere (cioè migrare attraverso la matrice extracellulare), la stessa analisi è stataeseguito con un filtro estratto rivestite membrana basale. Cellule EMT indotta hanno mostrato un aumento statisticamente significativo (P-value &lt;0.001) aumento della capacità di invasione rispetto alle cellule non trattate, come mostrato nella Figura 6B. Il robusto induzione di EMT è utile per l&#39;analisi dei cambiamenti di espressione genica e di segnalazione che si svolgono in queste cellule. Analisi matrice a base di anticorpi utilizzando lisati da cellule sia trattati e non è un metodo per analizzare i livelli di espressione di una varietà di molecole in un singolo campione. Come esempio, abbiamo analizzato i livelli di fosforilazione di MAPK familiari in lisati da un-indotta e EMT indotta MCF7 e cellule A549 utilizzando il Kit Array proteoma Profiler umano fosfo-MAPK. L&#39;array è stato eseguito due volte da trattamenti EMT-induzione indipendenti con risultati simili. Figura 7 mostra i dati rappresentativi di una matrice. Entrambi i tipi di cellule hanno mostrato un aumento della fosforilazione di CREB (S133), ERK1 (T2<html> 02/Y204), e ERK2 (T185/Y187) in cellule EMT-indotte rispetto ai controlli. Differenze negli eventi di segnalazione sono stati osservati tra i due tipi di cellule pure. Cellule A549 hanno mostrato un aumento di GSK-3 β (S9) fosforilazione, mentre le cellule MCF7 hanno mostrato un aumento p70S6K (T421/S424) fosforilazione. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in"/> Figura 1. Induzione morfologia mesenchimali dopo stimolazione con supplemento EMT Indurre Media (A - D). Morfologia epiteliale nei quattro tipi di cellule indicato di seguito coltura per 5 giorni in terreni di coltura standard senza supplemento EMT Indurre media (E - H). Morfologia mesenchimali nel quattro tipi di cellule indicati coltivate con supplemento EMT Indurre media per 5 giorni. nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in"/> Figura 2. Downregulation di espressione marcatore epiteliale e upregulation di espressione marcatore mesenchimali in cellule EMT-indotte. Cellule sono state colorate mediante immunofluorescenza per rilevare l&#39;espressione del marcatore epiteliale, E-caderina (rosso), e il marker mesenchimale, fibronectina (verde). (A - D) Le cellule di controllo in coltura, senza supplemento EMT Indurre media per 5 giorni (E -. H) cellule in coltura con supplemento EMT Indurre media per 5 giorni. Tutte le cellule sono di contrasto con DAPI (blu). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Conferma di espressione marcatore epiteliale e mesenchimale con la macchia di un occidentale<html> . ALISI Western blot di lisati cellulari totali dei quattro tipi di cellule indicato, trattati con (EMT) o senza (-) supplemento EMT Induzione media per 5 giorni. Bande di E-caderina, fibronectina e il controllo GAPDH carico sono quelle indicate sulla sinistra. L&#39;indicatore di dimensione è indicata sulla destra. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Sovraregolazione dei marcatori mesenchimali, vimentina e lumaca in cellule EMT-indotte. Cellule sono state colorate mediante immunofluorescenza multicolore a rilevare l&#39;espressione del marcatore epiteliale, E-caderina (grigio), ei marcatori mesenchimali, vimentina (verde) e lumaca (rosso) Le cellule di controllo coltivate senza il supplemento EMT Indurre media per 5 giorni. - (C A). (D - F) cellule in coltura con supplemento EMT Indurre media per 5 giorni. lways &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="Figura 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in"/> Figura 5. Induzione di EMT in cellule non responsive TGF-β1. (A e B) Le cellule coltivate con supporti solo per 5 giorni. (C e D) cellule coltivate in terreni contenenti 10 ng / ml di TGF-β1 per 5 giorni. (E e F) cellule coltivate in Supplemento EMT Indurre media per 5 giorni. Tutte le cellule sono colorate per l&#39;espressione di E-caderina (rosso) e di contrasto con DAPI (blu). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Cellule EMT-indotta sono aumentate le capacità di migrazione e l&#39;invasione. A. Numero medio di cellule che migrarono attraverso un filtro a pori 8 micron dopo incubazione per 48 ore. B. Numero medio dicellule che erano in grado di invadere attraverso un filtro a pori 8 micron rivestita con estratto di membrana basale dopo incubazione per 48 ore. Le barre di errore indicano la deviazione standard su 3 pozzetti. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Analisi di espressione di matrice a base di anticorpi Figura 7. Dell&#39;induzione EMT. I lisati da A549 (A e C) e MCF7 (B e D), le cellule in coltura con o senza supplemento EMT Indurre mezzi sono stati utilizzati per l&#39;analisi array utilizzando il kit Array Proteome Profiler umano fosfo-MAPK. Spot evidenziati in A e B sono state poi quantificate utilizzando densitometria. Confronti di non-indotte lisati di EMT-indotti sono riportati nei corrispondenti grafici a barre qui sotto (C e D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura &lt;</a>/ A&gt;.

Un metodo semplice è descritto per l&#39;induzione della transizione epitelio mesenchimale (EMT) in una varietà di tipi cellulari. Metodi per l&#39;analisi di cellule in EMT stati di immunocitochimica sono inclusi.

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un metodo semplice e riproducibile per l'induzione della transizione epitelio-mesenchimale o EMT in vitro. Questo viene ottenuto innanzitutto seminando il tipo cellulare epiteliale di interesse in presenza del supplemento per il mezzo di coltura induttore di EMT. Il secondo passaggio della procedura consiste nel sostituire il mezzo di coltura con mezzo fresco contenente il supplemento induttore di EMT tre giorni dopo il semina iniziale.L'ultimo passaggio consiste nel raccogliere le cellule a cinque giorni dal loro iniziale semina per una successiva caratterizzazione, come la colorazione immunoistochimica. In definitiva, i risultati possono dimostrare l'acquisizione di caratteristiche mesenchimali da parte delle cellule, osservabili mediante microscopia ottica, immunocitochimica, analisi con array di western blot o un altro procedimento analitico scelto. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la stimolazione con TGF-beta o la modifica genetica, sono la rapidità e la semplicità d'uso, a differenza della modifica genetica, e la capacità di indurre la transizione epitelio-mesenchimale in vari tipi cellulari, alcuni dei quali potrebbero non rispondere esclusivamente alla stimolazione con TGF-beta.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia e alla diagnosi della metastasi tumorale. Questa tecnica consente ai ricercatori di sviluppare firme di espressione comuni delle cellule metastatiche che potrebbero essere utilizzate nella diagnosi. Fornisce inoltre cellule da utilizzare per lo screening di farmaci.Si inizia riscaldando il terreno di coltura per le cellule di interesse a 37 gradi Celsius in un bagno termostatato. Successivamente, raccogliere le cellule utilizzando una soluzione di dissociazione, come ad esempio triple E express. Quindi sospendere le cellule in terreno di coltura preriscaldato in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare la sospensione cellulare a 400 G per cinque minuti.Rimuovere con attenzione il soprannatante versandolo in un contenitore per rifiuti e sospendere il pellet cellulare nel mezzo di coltura preriscaldato. Contare ora le cellule vitali, diluendo un campione della sospensione cellulare in soluzione di blu di triam allo 0,4%. Posizionare 10 microlitri del campione diluito su un emo citometro e contare le cellule vitali.Celle vitali. Non diventano blu dopo aver calcolato la densità cellulare nella tua piastra di soluzione. Nove-dieci mila cellule per centimetro quadrato in mezzo di coltura preriscaldato contenente un integratore specifico per mezzo induttivo XEMT, utilizzando piastre o fiale di coltura tessutale trattate.Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e monitorarne la morfologia giornalmente mediante microscopio ottico invertito. Tre giorni dopo, sostituire il mezzo con un mezzo di coltura fresco preriscaldato contenente un supplemento di mezzo induttivo XEMT. Cinque giorni dopo il seeding, le cellule sono pronte per l'analisi.Visualizzare la morfologia delle cellule al microscopio ottico invertito; le cellule possono ora essere fissate o raccolte per studi successivi. Preparare coprioggetti sterili da 12 millimetri per una piastra a 24 pozzetti posizionando i coprioggetti in una capsula di Petri contenente etanolo al 95%. Rimuovere delicatamente i coprioggetti dall'etanolo utilizzando una pinzetta curva.Le fiamme sterilizzano ciascun quadratino di vetrino e lo trasferiscono in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, maneggiando i vetrini con cura ed esperienza. Successivamente, aggiungere 0,5 millilitri di mezzo di coltura preriscaldato contenente un mezzo induttore XEMT. Integrare il mezzo con le cellule e seminare 16.000 cellule per pozzetto.Ora coltivare e nutrire le cellule come descritto in precedenza. Cinque giorni dopo la semina, rimuovere il mezzo e fissare le cellule con 300 microlitri per pozzetto di paraformaldeide al 4% in 1X PBS, lasciando procedere la fissazione per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere il fissativo e risciacquare le cellule due volte con 500 microlitri di 1X PBS per pozzetto.Successivamente, incubare le cellule fissate in 400 microlitri di buffer bloccante per pozzetta per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'applicazione del blocco, preparare l'anticorpo primario alla concentrazione raccomandata dal produttore in 400 microlitri di buffer bloccante per pozzetta. Rimuovere quindi la soluzione di blocco dalle pozzette e aggiungere alle cellule la miscela di anticorpi.Incubare le cellule per tre ore a temperatura ambiente oppure per tutta la notte a quattro gradi Celsius. E se l'anticorpo primario è direttamente coniugato a un fluorocromo, incubare al buio. Successivamente, rimuovere l'anticorpo primario e lavare le pozzette tre volte con 500 microlitri per pozzetta di PBS 1X contenente lo 0,1% di BSA, lasciando ogni lavaggio agire per cinque minuti e, se necessario, proteggendo le cellule dalla luce.Se necessario, incubare le cellule in un anticorpo secondario alla concentrazione raccomandata dal produttore. Diluire l'anticorpo in 400 microlitri per pozzetto di una XPBS contenente 1% BSA. Lasciare incubare per un'ora a temperatura ambiente, protetto dalla luce, dopo un'ora.Lavare le cellule tre volte, esattamente come fatto in precedenza per rimuovere l'anticorpo primario dopo i lavaggi. Se desiderato, applicare alle cellule una colorazione di contrasto con DPI. Infine, risciacquare le cellule in acqua deionizzata e montare i coverslip a faccia in giù sui vetrini utilizzando un mezzo di montaggio.Anche in questo caso, siate cauti nel maneggiare i coprioggetti. Le condizioni di coltura induttive per l'EMT forniscono un metodo solido per l'induzione dell'EMT in una variet&agrave; di tipi cellulari. Questo &egrave; stato testato su quattro linee cellulari umane diverse.Le cellule trattate con il supplemento del mezzo induttore di EMT sono cambiate da una classica morfologia epiteliale a una morfologia mesenchimale a forma di fuso. La doppia colorazione per l'espressione di e-caderina e fibronectina ha dimostrato la downregolazione del marcatore epiteliale e-caderina in rosso e l'upregolazione del marcatore mesenchimale fibronectina in verde. Nei campioni CF10A non indotti erano presenti ammassi strettamente compatti circondati da cellule più rade. Questi ammassi erano positivi per e-caderina, mostrati in rosso.I cluster sono scomparsi dopo il trattamento con il supplemento del mezzo induttore di EMT. Ciò ha coinciso con un aumento dell'espressione di fibronectina in verde. T 98.È stato riscontrato che G presenta un livello basale estremamente basso di terrina prima dell'induzione della MET, condizione che ne ha precluso l'analisi. Tuttavia, con questo marcatore, i livelli di fibronectina sono risultati significativamente aumentati in seguito all'induzione della MET in queste cellule. I livelli di espressione di e adesione e fibronectina sono stati ulteriormente confermati mediante immunoblotting su lisati cellulari totali.Sebbene il western blot non mostri una riduzione significativa dei livelli totali della proteina EAD herrin nelle cellule HT 29, si è osservata una riduzione dell'espressione superficiale di terrin evidenziata mediante immunoistochimica. Per ulteriormente valutare lo stato di EMT, i marcatori mesenchimali caratteristici dell'EMT, menton in verde e snail in rosso, sono stati analizzati prima e dopo l'induzione dell'EMT, in accordo con risultati precedenti. Eki, mostrato in grigio, è risultato downregolato in tutte le linee cellulari esaminate, indicando che l'EMT era stato indotto. Inoltre, si è verificata una upregolazione di snail in rosso e di menton in verde nelle cellule A 5 49, T 98 G e MCF 10 A. Si riporta che le cellule CCF sette, cellule di carcinoma mammario umano, e le cellule PanIN, carcinoma pancreatico umano, non entrano in EMT mediante segnalazione del TGF beta da solo.Questi risultati sono stati confermati utilizzando soltanto TGF beta ricombinante di tipo uno. Alla concentrazione presente nel supplemento del mezzo induttore di EMT, le cellule hanno mantenuto la loro morfologia epiteliale e i livelli superficiali di E-coerentina erano simili a quelli delle cellule di controllo. Al contrario, le cellule stimolate con il supplemento del mezzo induttore di EMT hanno mostrato una drastica riduzione dei livelli superficiali di E-caderina.Queste cellule hanno inoltre assunto una morfologia più mesenchimale. Un altro tratto distintivo delle cellule mesenchimali è la loro capacità di migrare e invadere. Questo è stato analizzato utilizzando il saggio di invasione cellulare BME in piastre a 96 pozzetti.Secondo le istruzioni del produttore, si sono osservati aumenti significativi della migrazione cellulare sia nelle cellule 5 49 che nelle cellule pan one. Dopo l'induzione dell'EMT, lo stesso saggio è stato eseguito con un filtro rivestito di estratto di membrana basale per valutare l'invasione. Le cellule con EMT indotto hanno mostrato un aumento significativo delle capacità invasive rispetto alle cellule non trattate.L'induzione robusta di EMT è utile per l'analisi dei cambiamenti nell'espressione genica e del segnale che avvengono in queste cellule. È stato utilizzato un array commerciale basato su anticorpi, impiegando lisati provenienti da cellule MCF seven e a 5 49, per analizzare i livelli di fosforilazione dei membri della famiglia della MA chinasi. Entrambi i tipi cellulari hanno mostrato un aumento della fosforilazione di kreb irk one e irk two nelle cellule in cui era stata indotta l'EMT, rispetto ai controlli.Le cellule A549 hanno mostrato anche un aumento della fosforilazione di GSK-3β. Le cellule Mc7 hanno mostrato un aumento della fosforilazione di P70S6K oltre all'aumento della fosforilazione di kreb-1 e DIRK2. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che possono verificarsi alcune variabilità nei risultati a seconda dei diversi tipi cellulari, non tutte le cellule.Utilizziamo gli stessi percorsi a valle per l'induzione della transizione epitelio-mesenchimale (EMT), che determina differenze nell'espressione dei marcatori tra i diversi tipi cellulari. Inoltre, molti marcatori della EMT non mostrano stati completamente attivi o inattivi e possono presentare livelli basali nelle cellule epiteliali. Tali marcatori possono mostrare un aumento dello scambio di localizzazione durante la transizione mesenchimale seguendo questa procedura.Altri metodi, come lo screening di farmaci, possono essere utilizzati per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio quali composti sono in grado di modulare la transizione da epiteliale a mesenchimale. Questi composti potrebbero rivelarsi molto utili nel trattamento del cancro e della fibrosi.

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Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione

Qui, descriviamo lo sviluppo e l'applicazione di un test di contrazione del gel per valutare la funzione contrattile nelle cellule mesenchimali che hanno subito una transizione epitelio-mesenchimale.

Sviluppo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Test per valutare funzione contrattile del mesenchimali Le cellule che sono stati sottoposti a transizione epitelio-mesenchimali

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