Protocolli per la valutazione radiofrequenza interazioni con nanoparticelle di oro e Sistemi Biologici per la non-invasiva Ipertermia Cancer Therapy

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare le proprietà di riscaldamento delle nanoparticelle d'oro in un campo elettrico a radiofrequenza di 13,56 megahertz, in vitro e in vivo. Ciò si ottiene valutando prima la velocità di riscaldamento delle nanoparticelle d'oro concentrate e del loro tampone in un veterinario al quarzo. La seconda fase della procedura consiste nell'eseguire studi di tossicità in vitro di nanoparticelle d'oro con cellule tumorali in coltura.

Il terzo passo consiste nell'eseguire studi in vivo di nanoparticelle d'oro in un modello di cancro ectopico di topo. In definitiva, i risultati possono mostrare se la nanoparticella studiata potrebbe essere un agente efficace da utilizzare con l'ipertermia mediata da RF attraverso l'analisi delle nanoparticelle in sospensione, in vitro e in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ipotermia a radiofrequenza non invasiva mediata da nanoparticelle, come ad esempio il riscaldamento dovuto alle particelle stesse e può essere utilizzato per scopi terapeutici?

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché non ci sono molti protocolli ben consolidati per eseguire questo tipo di esperimenti. A dimostrare la procedura saranno marchiati Cisneros, un assistente di ricerca, Stuart Core, uno scienziato post-dottorato, e Leila Green, un'altra scienziata post-dottorato. Ad esempio, inizia con una bottiglia da 500 millilitri disponibile in commercio di nanoparticelle d'oro con un diametro di cinque nanometri.

Prendi circa 125 millilitri della soluzione di nanoparticelle d'oro e dividila tra sei provette filtranti per centrifuga da 50 kilodalton, centrifuga le nanoparticelle a 3000 giri/min per due minuti e cinque secondi. Rimuovere il surnatante che è il tampone filtrato e riempire ogni filtro. Con più soluzione di magazzino.

Continuare la centrifusione, rimuovendo il tampone e ricaricando le provette fino a quando tutta la soluzione di nanoparticelle non è stata filtrata. Dopo l'ultima aggiunta, sostituire il tampone filtrato con un volume simile di acqua deionizzata e ripetere il processo circa altre otto volte dopo aver caricato il campione di tampone filtrato sulla macchina RF. Utilizzando il software della telecamera a infrarossi, creare scatole sopra il QVE per catturare il profilo di riscaldamento Dopo otto lavaggi, i dati di riscaldamento del filtrato di nanoparticelle d'oro a cinque nanometri si avvicinano a quelli dell'acqua deionizzata.

L'analisi UV-vis può essere utilizzata anche per monitorare l'assorbimento dei contaminanti. Picchi. Qui è mostrato uno spettro pulito. Una volta che i contaminanti tampone sono stati completamente rimossi, sospendiamo le nanoparticelle in 0,5 millilitri di acqua deionizzata nei tubi del filtro che rimuovono le nanoparticelle dal filtro.

Quindi combina tutte e sei le sospensioni in un tubo da 15 millilitri. Ora, analizza il campione utilizzando UV, VIS e zeta potential per i dati di stabilità. Utilizzare la spettrometria di massa I-C-P-O-E-S e/o ICP per determinare la concentrazione di nanoparticelle.

L'analisi SEM e/o TEM può anche essere utilizzata per ottenere dati morfologici utilizzando un sistema RF Kansas o derivazioni di carico, una siringa di quarzo da 1,3 millilitri e impostare il campo elettrico RF a circa 90 kilovolt per metro in aria dove risiederebbe il Q vete. Per un campione salino standard con cloruro di sodio allo 0,9%, il campo elettrico si ridurrebbe a circa 1,1 kilovolt per metro. Queste sono le condizioni approssimative utilizzate per consentire di effettuare confronti tra diversi sistemi RF.

Ora, carica un quarzo pulito con 1,3 millilitri di sospensione di nanoparticelle d'oro purificato a una concentrazione di 1000 milligrammi per litro. Esporre il campione al campo RF per un periodo di 120 secondi o fino a quando il campione non raggiunge i 70 gradi Celsius. La sovraesposizione può portare alla formazione di archi elettrici o all'ebollizione rapida.

Acquisisci i dati delle immagini termiche e le aree di controllo utilizzando una telecamera IR e il software associato. Ripetere questa procedura tre volte sullo stesso campione. Ora filtrate il campione attraverso un altro filtro da centrifuga da 50 kilodalton per estrarre le nanoparticelle d'oro dal tampone d'acqua.

Quindi riesporre il buffer da solo al campo RF. Ancora una volta, tre volte la differenza nelle ore tra il colloide di nanoparticelle d'oro e il filtrato determina l'HR a causa delle nanoparticelle d'oro stesse. Infine, sospendiamo le nanoparticelle d'oro rimanenti dal filtro in 1,3 millilitri di acqua per ulteriori esperimenti.

Questi studi in vitro possono essere applicati a qualsiasi tipo di cellula tumorale che forma monostrati 2D. In questo esempio, verranno utilizzate cellule Hep tre B derivate dal carcinoma epatocellulare umano su piastra di circa 50.000 cellule. In tre pozzetti di una piastra a 12 pozzetti con un millilitro di crescita.

I terreni continuano a caricare le celle fino a quando non vengono riempite tre piastre per gli studi sulle nanoparticelle e tre piastre vengono riempite come controlli. Incubare le piastre a 37,5 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno successivo introdurre 0,1 millilitri di una soluzione di nanoparticelle d'oro da 1000 milligrammi per litro in ciascun pozzetto delle tre piastre di nanoparticelle alle piastre di controllo.

A 0,1 millilitri di acqua in ciascuna, incubare bene tutte le piastre per altre 24 ore. Dopo altre 24 ore, aspirare il terreno cellulare e lavare le cellule con PBS per rimuovere eventuali nanoparticelle d'oro legate alla superficie. Quindi sostituire il supporto cellulare.

Le celle sono ora pronte per l'esposizione alle radiofrequenze. Posizionare ogni pacco di celle da 12 pozzetti all'interno del campo RF e attendere che le celle si siano raffreddate a 31 gradi Celsius. Una volta leggermente raffreddate, esporre le celle a 3,5 minuti di rf.

La temperatura finale del mezzo cellulare sarà di circa 37 gradi Celsius. Trasferire le cellule in un incubatore e attendere 24 ore prima di analizzarle. Quando le cellule sono pronte, aspirare il terreno e sostituirlo con due millilitri di reagente MTT al 25% in terreno.

Quindi lasciare incubare le cellule per altre quattro ore. Quindi, sostituire il supporto MTT con due millilitri di DMSO. Posizionare le piastre cellulari su un bilanciere da banco per 10 minuti per consentire al DMSO di solubilizzare i reagenti MTT.

Infine, pipettare campioni da 100 microlitri da ciascun pozzetto in una piastra da 96 pozzetti e leggere otticamente la piastra a 570 nanometri. Questi studi in vivo possono essere applicati a qualsiasi tipo di cancro che forma tumori solidi in un modello di mirroring ortotopico o ectopico. In questo esempio, le cellule tumorali epatiche 3 B vengono utilizzate con topi nudi BPC.

Iniziare con circa 100.000 cellule, tripsina, ghiacciare le cellule e produrre una soluzione di 2 milioni di cellule per 25 microlitri. Aggiungere una quantità uguale di gel matri ghiacciato alla sospensione cellulare e mescolare accuratamente aspirando ripetutamente in una pipetta. Ora iniettare la sospensione mista nella posizione desiderata sulla schiena di ciascun animale.

Dopo alcune settimane, i tumori saranno rotondi da mezzo a un centimetro in questo momento, inizieranno il trattamento RF e anestetizzeranno i topi con la soluzione di ketamina e xilazina mediante iniezione IP e tenerli al caldo. Quindi iniettare le nanoparticelle d'oro direttamente in metà dei tumori utilizzando una siringa da un cc con un ago calibro 27 o 30. Utilizzare un tampone chirurgico per assorbire il sangue e pulire il sito di iniezione con una salvietta imbevuta di alcol.

Come controllo, iniettare solo PBS nell'altra metà dei tumori. Ora, tratta metà dei topi di ogni gruppo. Montare il mouse sulla testina ricevente del generatore RF e schermare le aree non trattate con nastro di rame, inclusi occhi, orecchie e dita dei piedi.

La parte più importante di questo esperimento è la corretta messa a terra dei topi. Senza un'adeguata messa a terra, l'accumulo di carica sugli animali può causare lesioni termiche o elettrodermiche. Questo può essere facilmente prevenuto.

Posizionare il tumore fuori dalla testa di trasmissione di almeno un centimetro in più rispetto alla larghezza del sito di trattamento desiderato. Ora, posiziona la termocamera IR in modo che il tumore e l'area di trattamento siano visibili. Accendere la RF per cinque minuti e registrare la curva di temperatura risultante.

Se la temperatura superficiale della pelle supera i 42 gradi Celsius, interrompere il trattamento immediatamente dopo l'esposizione alle radiofrequenze. Lascia che i topi si riprendano in una camera calda fino a quando non sono coscienti. Ripetere i trattamenti due volte a settimana per tre settimane.

Quindi sopprimere i topi 48 ore dopo l'esposizione finale alle radiofrequenze ed elaborare i tumori. Il riscaldamento RF delle nanoparticelle d'oro purificate è stato determinato dalla differenza in ore tra loro e la soluzione tampone di acqua deionizzata di fondo. I risultati sono stati quelli attesi sia per le nanoparticelle a cinque nanometri che per quelle a 10 nanometri.

Le nanoparticelle d'oro purificate integrate nel carcinoma epatocellulare umano derivavano da tre cellule B Hep. Quando tali celle sono esposte a un campo RF, di solito diventano meno vitali di quelle esposte a RF senza nanoparticelle internalizzate. La figura tre illustra uno scenario idealizzato in cui le nanoparticelle d'oro utilizzate hanno una tossicità limitata di per sé, ma eccellenti proprietà citotossiche avviate RF consultare la letteratura per una revisione completa dei risultati in vitro fino ad oggi utilizzando vari tipi di nanomateriali.

Le cellule tumorali del fegato sono state utilizzate per generare tumori sul dorso di topi nudi babsi. Questi tumori sono stati iniettati con nanoparticelle d'oro sospese PBS, seguite dall'esposizione alle radiofrequenze. L'analisi post-trattamento Thomas ha rivelato che il trattamento controllava la crescita del tumore e diminuiva la massa tumorale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare le nanoparticelle per l'uso nell'ipotermia mediata da RF determinando le loro proprietà di risposta RF e la soluzione in vitro e in vivo. Non dimenticare che lavorare con campi elettrici RF ad alta potenza può essere estremamente pericoloso. Non toccare o raggiungere mai all'interno di un campo elettrico attivo.

Effettuare misurazioni del campo elettrico e, se necessario, utilizzare una schermatura adeguata come una gabbia di Faraday. In generale, ridurre sempre al minimo l'esposizione a campi elettrici prolungati ad alta intensità.