Costruzione di un microscopio ad alta risoluzione con convenzionali e Holographic Capabilities intrappolamento ottico
22 aprile 2013
Il sistema qui descritto impiega una trappola ottica tradizionale e una linea intrappolamento ottico olografico indipendente, capace di creare e manipolazione di più trappole. Questo consente la creazione di complessi arrangiamenti geometrici di particelle di rifrazione e che permetta ad alta velocità misurazioni simultanee, ad alta risoluzione della attività degli enzimi biologici.
In questa procedura, vengono assemblate e allineate una trappola ottica convenzionale e una trappola ottica olografica. Per realizzare ciò, misurare innanzitutto le posizioni dei componenti ottici, quindi montare saldamente i componenti nelle rispettive posizioni. Successivamente, allineare gli elementi ottici in modo da consentire l'intrappolamento. L'ultimo passaggio consiste nel bloccare il fascio TED proveniente dallo specchio olografico.
In definitiva, il sistema finito permette la cattura olografica e ordinaria simultanea. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la sola cattura ordinaria, è che consente il posizionamento simultaneo di più oggetti refrattivi in tre dimensioni e misurazioni di manipolazione rapida degli oggetti. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo potranno incontrare difficoltà perché progettazione, disposizione e allineamento possono risultare complessi.
Il punto di partenza di questo video è un banco ottico con il microscopio posizionato per creare una trappola ottica a 980 nanometri. Iniziare con uno dei diodi laser facilmente disponibili a tale lunghezza d'onda. Utilizzare un laser a fibra monomodale con controllo di inclinazione (pig tilt) e mantenimento della polarizzazione, dotato di fibra di diametro del campo modale noto.
La fibra deve essere abbastanza lunga da fungere da filtro modale e deve terminare con un connettore per canale in fibra, dotato di un connettore FCPC oppure F-C-A-P-C. La fibra ottica monomodale va maneggiata con cura, evitando torsioni. Fissare il diodo laser e il supporto che consente il controllo di potenza e temperatura.
Il supporto deve essere fissato direttamente al banco ottico per massimizzare lo smaltimento passivo del calore. Successivamente, montare il connettore della fibra sulle ottiche di collimazione del fascio. Assicurarsi che la porta della fibra scelta corrisponda al diametro del campo modale del diodo.
Collegare la fibra con connettore a coda di maiale all'adattatore di collimazione fissandolo al tavolo ottico a una distanza sufficiente dal microscopio da permettere l'espansione del percorso del fascio e il posizionamento di altri componenti. I colori delle aste possono essere utilizzati per fissare la distanza tra le lenti, garantendo un posizionamento robusto e ripetibile. Regolare la porta della fibra per assicurare un'uscita costante del fascio su distanze paragonabili all'intero percorso ottico verso il microscopio.
Ci sono cinque specchi sul percorso del fascio laser DDE. A partire dal laser dde, ci sono due specchi per indirizzare l'uscita all'interno dell'alloggiamento del microscopio. Il fascio deve inoltre passare attraverso uno specchio dicotroico, che consente la trasmissione inalterata del fascio del diodo laser a 45 gradi rispetto all'angolo di incidenza.
Infine, due ulteriori specchi dicroici corti che trasmettono la luce visibile, ma riflettono l'infrarosso vicino e le lunghezze d'onda superiori. Indirizzare il fascio all'interno e all'esterno del microscopio. Lo spazio infinito uno si trova all'interno dell'alloggiamento del microscopio per regolare gli specchi; rimuovere l'obiettivo del microscopio.
Utilizzare gli specchi e una scheda di visualizzazione a infrarossi per indirizzare il fascio attraverso l'apertura nel supporto dell'obiettivo. Se il fascio è fuori centro, regolare gli specchi per correggere l'allineamento in modo che il fascio sia centrato. Quando si montano le lenti, un sistema a gabbia può garantire un assemblaggio rigido.
Il calibro può essere utilizzato per misurare preventivamente le distanze tra le lenti lungo le aste del telaio prima dell'installazione. Montare temporaneamente un puntatore laser rosso con un adattatore personalizzato al posto dell'obiettivo, in modo che il suo fascio sia allineato con l'asse ottico del microscopio. Utilizzare il fascio visibile del puntatore laser per posizionare e allineare approssimativamente l'espansore del fascio a 980 nanometri.
Questa configurazione utilizza lenti con lunghezza focale di 60 millimetri e 125 millimetri disposte in configurazione keary per raddoppiare approssimativamente la sezione del fascio. Successivamente, installare le lenti di puntamento da 980 nanometri utilizzando il fascio indicatore come guida. Ogni lente ha un supporto con lunghezza focale di 60 millimetri; la prima lente nel percorso del fascio è montata su una fase di precisione X, Y, Z con un'escursione minima di mezzo pollice per consentire la deviazione del fascio.
Ora è possibile posizionare la seconda lente in modo da formare un allineamento uno-a-uno con la prima lente. Questa lente deve essere posizionata in modo da essere otticamente coniugata con il piano focale posteriore dell'obiettivo. Per preparare la trappola olografica, montare il laser a 1064 nanometri su una piattaforma rialzata all’incirca all’altezza del fascio a 980 nanometri.
Posizionare una piastra a mezzo onda e un polarizzatore subito dopo l'uscita del laser, per permettere la regolazione manuale della potenza laser. Installare l'espansore del fascio per questo laser in modo che il fascio venga ampliato per adattarsi alle dimensioni diagonali dello specchio olografico.
Se lo spazio è limitato, utilizzare qui lenti con piccole lunghezze focali, 16 millimetri e 175 millimetri. Utilizzare ora il fascio del puntatore laser per posizionare il modulatore spaziale della luce o SLM, che fa parte del pacchetto olografico commerciale impiegato. In questo esperimento, il modulatore spaziale della luce deve essere posizionato in modo da essere otticamente coniugato al piano focale posteriore dell'obiettivo.
Posizionarlo in modo che il raggio del puntatore laser formi l'angolo di incidenza minimo possibile, ma in modo che il suo riflesso superi in sicurezza tutte le apparecchiature presenti sul tavolo ottico. Posizionare un altro specchio davanti all'espansore del raggio laser a 1064 nanometri per deviare la luce verso il modulatore spaziale della luce. Assicurarsi che la luce del puntatore laser colpisca il centro dell'apertura dell'espansore del raggio.
Infine, installare una coppia di lenti telescopiche tra il modulatore spaziale della luce e lo specchio dicromatico. Queste lenti hanno lunghezze focali di 125 millimetri e 200 millimetri. Rimuovere il puntatore laser, lasciando il supporto adattatore personalizzato a fungere da apertura per l'allineamento approssimativo.
Iniziare a verificare l'allineamento utilizzando esclusivamente il fascio a 980 nanometri. Utilizzare un visualizzatore a infrarossi per allineare il fascio a 980 nanometri lungo l'asse centrale del diaframma presente nell'adattatore personalizzato. Successivamente, usare la scheda a infrarossi per assicurarsi che il fascio a 1064 nanometri colpisca gli stessi punti del fascio a 980 nanometri lungo il loro percorso comune.
Una volta completata questa operazione, sostituire l'adattatore personalizzato per il puntatore laser con un obiettivo ad alto numero di apertura, a immersione in olio o in acqua. Successivamente, allineare il trap a 980 nanometri spostando il fascio laser fino a quando non si osserva una figura di interferenza radialmente simmetrica sulla telecamera, con lo specchio olografico spento. Allineare il trap a 1064 nanometri utilizzando il modulatore spaziale della luce e il primo specchio dicromatico per spostare il fascio a 1064 nanometri NON DIFFRATTO.
In questo esempio, l'immagine allineata per entrambe le trappole indica un buon allineamento per un intrappolamento efficiente, ma può essere ulteriormente perfezionato. Sono inoltre presenti lievi aberrazioni associate al fascio rotondo a 1064 nm che colpisce uno specchio SLM quadrato, le quali non possono essere facilmente eliminate ottimizzando l'allineamento delle lenti. Per bloccare la trappola prodotta dal fascio sottoposto a modulazione insufficiente proveniente dal modulatore spaziale della luce, inserire un piccolo oggetto opaco lungo il percorso del fascio sottoposto a modulazione insufficiente in una posizione coniugata al piano del campione per questo sistema.
Una microsfera opaca di diametro compreso tra 100 e 300 micron, costituita da materiale metallico, viene incollata su un’ampolla di vetro rotonda trasparente all'infrarosso o su una finestra. Il blocco viene posizionato nel punto focale comune delle lenti, che è otticamente coniugato al piano del campione. Se i fasci di trappola ottica vengono iniettati nello spazio all'infinito del microscopio, il blocco del fascio può essere posizionato per ostacolare la luce non deviata oppure può essere spostato per permettere il passaggio di tutta la luce.
Il sistema assemblato permette all'operatore di intrappolare in tempo reale più oggetti refrattivi e di posizionarli in tutte e tre le dimensioni all'interno del campo visivo. Qui, le capacità olografiche dello strumento vengono mostrate intrappolando microsfere sospese in acqua deionizzata; cerchi rossi e verdi indicano le posizioni delle trappole, con il verde che segnala una trappola selezionata per essere riposizionata in questo filmato, la riproduzione viene accelerata dopo che un oggetto è stato intrappolato. La sua trappola viene riposizionata manualmente.
La disposizione finale presenta 11 perline che raffigurano il logo dell'Università dello Utah, dove è stato condotto questo esperimento. Il sistema consente inoltre l'uso combinato di trappole olografiche e convenzionali. Qui vengono definite e controllate due file di trappole olografiche da parte dell'operatore.
Una trappia convenzionale aggiuntiva viene definita tra le due file. Le microsfere sospese in acqua deionizzata sono trattenute dalle trappie. La perlina centrale viene spostata fino a un massimo spostamento spaziale di 4,1 micrometri e poi riportata alla sua posizione originale nelle stesse condizioni.
Ma con la perla centrale che si muove a 82 micrometri al secondo, viene prodotta questa sequenza di fotogrammi. Osservare la sfocatura del movimento nelle seconde e terze immagini. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come configurare e allineare un sistema di trappole ottiche doppie con una trappola olografica e una normale indipendenti all'interno dello stesso apparato.
Non dimenticare che lavorare con laser ad alta potenza può essere estremamente pericoloso; adotta precauzioni come l'uso di appositi occhiali di protezione.
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Panoramica
Questo articolo descrive un sistema che integra tecniche convenzionali e di trappolaggio ottico olografico, consentendo la manipolazione di molteplici trappole. Questo approccio innovativo facilita la creazione di complesse disposizioni geometriche di particelle rifrattive, permettendo al contempo misurazioni ad alta velocità e ad alta risoluzione dell'attività enzimatica biologica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Trappolaggio ottico
- Biophysica
- Misurazione dell'attività enzimatica
Sfondo
- I metodi tradizionali di trappolaggio ottico presentano limitazioni nella capacità di manipolare contemporaneamente più oggetti.
- Il trappolaggio ottico olografico offre una maggiore flessibilità nel posizionamento e nella manipolazione delle particelle.
- La combinazione di queste tecniche può migliorare l'accuratezza e la velocità delle misurazioni.
- I nuovi utenti potrebbero incontrare difficoltà nella progettazione e allineamento dei componenti ottici.
Scopo dello studio
- Sviluppare un sistema che consenta il trappolamento ottico convenzionale e olografico simultaneo.
- Permettere la manipolazione di multipli oggetti rifrattivi in tre dimensioni.
- Facilitare misurazioni rapide dell'attività enzimatica biologica.
Metodi Utilizzati
- Assemblaggio e allineamento dei componenti della trappola ottica.
- Misurazione delle posizioni per i componenti ottici.
- Fissaggio sicuro dei componenti nelle posizioni designate.
- Allineamento delle ottiche per consentire un confinamento efficace.
Risultati principali
- Il sistema integra con successo tecniche di trappolaggio convenzionali e olografiche.
- Consente il posizionamento simultaneo di più oggetti rifrattivi.
- Sono state ottenute misurazioni ad alta velocità dell'attività enzimatica.
- Gli utenti hanno segnalato difficoltà nella configurazione iniziale, ma hanno riconosciuto i vantaggi del sistema.
Conclusioni
- Il sistema sviluppato migliora le capacità delle tecniche di optical trapping.
- Offre vantaggi significativi ai ricercatori che studiano processi biologici.
- Potrebbe essere necessario un ulteriore addestramento per i nuovi utenti al fine di padroneggiare l'allestimento.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I sistemi di trappole ottiche permettono una manipolazione precisa di oggetti rifrattivi per misurazioni ad alta risoluzione di forze e movimenti su scale di nanometri e piconewton. L'integrazione di trappole convenzionali ed olografiche consente un posizionamento simultaneo di più oggetti e un controllo tridimensionale in tempo reale, supportando studi meccanicistici sulle interazioni molecolari e sulla meccanica cellulare. Questa capacità aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi, permettendo una valutazione quantitativa delle forze di legame e dei cambiamenti conformazionali in condizioni fisiologiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la misurazione diretta delle forze molecolari di legame e della dinamica di formazione dei complessi.
- Valore operativo: Fornisce una validazione funzionale del bersaglio misurando in tempo reale forze nell'ordine dei piconewton generate da motori molecolari o dall'attività enzimatica.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio progettuale generando dati quantitativi di forza-spostamento che si correlano con l'interazione con il bersaglio e il meccanismo d'azione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi, consentendo la manipolazione controllata di microsferette dielettriche o organelli cellulari come sensori di forza.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità del saggio mediante un posizionamento preciso e la lettura simultanea della posizione del trappolamento rispetto al movimento dell'oggetto.
- Scalabilità: Favorisce la predisposizione per analisi ad alto rendimento grazie alla generazione di schemi olografici per il trappolamento parallelo di più oggetti nel campo visivo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Mantiene la rilevanza per la malattia consentendo la misurazione delle proprietà meccaniche a livello nanometrico in cellule primarie o modelli derivati da tessuti in condizioni prossime a quelle fisiologiche.
- De-risking meccanicistico: Collega le osservazioni della fase di scoperta alla validazione preclinica attraverso letture della produzione di forza che informano le strategie di modulazione del bersaglio.
- Avanzamento basato sul rischio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione quantificando in che modo le perturbazioni influenzano l'output meccanico in sistemi rilevanti per la malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il sistema si inserisce nel percorso della scoperta, dalla verifica delle ipotesi fino all'identificazione dei composti promettenti e alla validazione preclinica, fornendo letture biophysiche quantitative che guidano la priorizzazione degli obiettivi e l'elucidazione dei meccanismi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la misurazione diretta delle forze intermolecolari e dei cambiamenti conformazionali nei complessi proteici.
- Screening: Offre prontezza del saggio grazie al tracciamento rapido e ad alta risoluzione della posizione di oggetti intrappolati, facilitando la valutazione affidabile di composti mediante letture basate sulle forze.
- Analisi: Genera misurazioni di spostamento su scala nanometrica e di forze nell'ordine dei piconewton, consentendo ai gruppi di confrontare condizioni e valutare l'efficacia della modulazione del bersaglio.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica permettendo la fenotipizzazione meccanica in sistemi cellulari rilevanti per la malattia, sostenendo l'allineamento dei biomarcatori per i percorsi di meccanotrasduzione.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per l'analisi multiparametrica in diversi progetti, riducendo configurazioni ridondanti e consentendo la standardizzazione tra gruppi di lavoro dei protocolli di misurazione delle forze.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile attraverso misurazioni dirette, prive di marcatori, degli output meccanici che riducono l'ambiguità nell'interpretazione del meccanismo bersaglio.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e scalabilità mediante modelli di trappole olografiche e controllo simultaneo di più oggetti, migliorando la produttività nelle campagne di misurazione delle forze.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo una riduzione precoce dei rischi associati ai bersagli grazie a dati quantitativi sulle forze, riducendo i fallimenti tardivi dovuti a criticità meccaniche inattese.
- Impatto sul portafoglio: Informa la priorizzazione corretta per rischio fornendo dati oggettivi e quantitativi sulla forza di interazione con il bersaglio e sulle dinamiche conformazionali tra le molecole candidate.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'allineamento ottico, nella sicurezza laser e nell'ottimizzazione del percorso del fascio per sistemi di trappole a doppia lunghezza d'onda.
- È fortemente dipendente da un banco ottico stabile, da stage di traslazione di precisione e da componenti compatibili con l'infrarosso per l'integrazione di laser a 980 nm e 1064 nm.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo ai protocolli di trappolamento, alle procedure di calibrazione e alle pipeline di analisi dati per la misura di forza e spostamento.
- Comporta considerazioni di adattamento nel passaggio da saggi basati su microsfere a cellule primarie o espianti di tessuto, a causa delle diverse indice di rifrazione e dei vincoli sulla vitalità del campione.
- È limitato dalla complessità di allineamento e dalla presenza di possibili aberrazioni dovute a profili di fascio non corrispondenti, in particolare quando schemi olografici interagiscono con la geometria del modulatore spaziale della luce.
