Name: Miglioramento della preparazione e la conservazione di fette mouse ippocampo per una registrazione molto stabile e riproducibile di potenziamento a lungo termine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Impara a preparare fette acute di ippocampo murino per registrazioni elettrofisiologiche stabili di potenziamento a lungo termine. Questo protocollo ottimizzato garantisce un tasso di successo del 95% e registrazioni LTP riproducibili per oltre 8 ore.

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Ringraziamo Bernard Foucart per l&#39;assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo belga per la Ricerca Scientifica (FRS-FNRS) e dal Fondo regina Elisabetta per la ricerca medica. Agnès Villers è assegnista di ricerca presso il Fondo belga per la Ricerca Scientifica.

Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti in conformità con il National Institutes of norme sanitarie per la cura e l&#39;uso di animali nella ricerca e con l&#39;accordo del comitato etico locale. 1. Preparazione del Artificial liquido cerebro-spinale Lo stesso supporto utilizzato per sezionare, tagliare e perfusione fette (1 ml / min) durante il periodo di riposo e le registrazioni elettrofisiologiche. Questo supporto è composto da 124 mM NaCl, 4.4 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH 2 PO 4, 2,5 mM CaCl 2, 1,3 mm MgSO 4 e 10 mm D-glucosio. <ol><li> Pesare i diversi componenti per 2 L di ACSF tranne MgSO4 che è già in soluzione (1 M). Usando una soluzione standard permette di essere sicuri della esatta concentrazione di Mg 2 + perché MgSO4 in polvere è altamente igroscopico. Ca 2 +: Mg2 + rapporto influenza notevolmente l&#39;induzione e il mantenimento LTP14 e, quindi, le loro proporzioni vanno sempre rispettati. </li><li> Mettere tutti i componenti ad eccezione CaCl 2 in un bicchiere cilindro graduato e portare a 2 L con acqua distillata H 2 O. </li><li> Mescolare energicamente. Quando tutto è sciolto, aggiungere CARBOGEN attraverso un gorgogliatore acquario e il tubo attaccato al serbatoio (95% O 2, 5% di CO 2). Attendere qualche minuto e aggiungere cloruro di calcio quando il pH è fissato a 7,4 con l&#39;azione del tampone bicarbonato. </li><li> Tenere 600 ml in un piatto di vetro rettangolare refrigerato e raffreddare a 4 ° C con ghiaccio intorno al piatto. Questo supporto saranno utilizzati per la dissezione dell&#39;ippocampo. </li><li> Filtra i restanti 1.400 ml e conservare in una beuta. </li></ol> 2. Preparazione del Rig elettrofisiologici e cervello Slice Recording Camera Il circuito di perfusione è fatto di due pompe peristaltiche, uno di pompaggio del liquido fresco da un serbatoio di riserva e l&#39;altro fluido utilizzato pompaggio da tsi registra da camera per un bidone. Fluido fresco viene aggiunto ad un sistema di perfusione casereccio dove viene ri-ossigenato e riscaldato prima di raggiungere la camera di registrazione di interfaccia per gravità (Figura 1A). La camera di registrazione di interfaccia è stato progettato da FST (Belle Strumenti Scienza, Vancouver, Canada, figura 1b). Fette di tessuto sono posti su filtro di rete tessuta applicato all&#39;anello ben rimovibile e può essere costantemente mantenuta in condizioni di interfaccia regolando l&#39;altezza di aspirazione ben dell&#39;ago. Un tubo di plastica fatta in casa bloccata alla sua estremità e forati lateralmente (0,5 mm) è fissato l&#39;ago di aspirazione per aumentare la stabilità livello nella camera. La testina di registrazione è montata su un bagno d&#39;acqua contenente una pietra dispersione gas che aiuta a mantenere un ambiente umido facendo passare aria umida attraverso i porti deflessione della testa di registrazione (per diminuire la formazione di goccioline d&#39;acqua). Bagno e media temperatura sono controllati dal continuo variando il livello di secolo corrente continuaruvida una gomma siliconica-embedded elemento riscaldatore nel bagno d&#39;acqua. Termistori nel bagno d&#39;acqua e pozzi di registrazione consentono la temperatura della camera per impostare e monitorare con precisione in questi siti. Il sistema di riscaldamento della camera è completata da un sistema di riscaldamento globale controllando la temperatura dell&#39;intero impianto. Il software sviluppato dai ricercatori dell&#39;Università di Edimburgo ( <a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a> ) monitora e equalizza la temperatura dell&#39;aria ossigenata, la fetta cervello, gli elettrodi e l&#39;impianto di perforazione restante fornire un ambiente stabile per registrazioni a lungo termine (Figura 1C) . La temperatura usato per topo fettine ippocampali è di 28 ° C. <ol><li> Risciacquare tutto il circuito di perfusione con H 2 O distillata per almeno 20 min e avviare i sistemi di riscaldamento. </li><li> Avviare il gorgogliare CARBOGEN nel circuito. Carbogen arriva nei fatti in casa-tubi perfusione attraverso fcandele ilter e nel bagno d&#39;acqua al di sotto della camera di registrazione. La portata nel bagno d&#39;acqua è controllata da un flussometro. Se la portata è troppo lento, il tessuto potrebbe diventare ipossico. Viceversa, se la portata è troppo alta, il gas potrebbe non essere sufficientemente riscaldata e idratata conseguente essiccamento del tessuto. Elevata portata di gas potrebbe aumentare la probabilità di spruzzi d&#39;acqua sul tessuto dal bagno d&#39;acqua sottostante che porta a shock osmotico. Ciò può essere evitato aggiungendo pezzetti di maglia di nylon (100 pm) all&#39;uscita dei porti deflessione. </li><li> Svuotare il circuito e riempire con ACSF filtrata. </li><li> Mettere l&#39;anello che sosterrà la fetta nella camera di tenuta. Un filtro a rete tessuto con aperture di maglia che vanno 500-750 micron è allungata e collegata all&#39;anello con colla epossidica resina a due componenti. Il filtro a rete tessuto è fatto di 87% poliammide e 13% elastan (collant 15 den). Colla deve essere applicata con attenzione per evitare la formazione di rilievi sulla superficie del ring. </li><li> Rimuovere con attenzione tutte le bolle d&#39;aria dal circuito. </li><li> Regolare il livello di ACSF nella camera di registrazione con la vite dell&#39;ago di aspirazione. La velocità delle pompe peristaltiche viene regolata a 1 ml / min per la pompa di aspirazione e di 5 ml / min per la pompa di scarico. </li></ol> Il sistema di perfusione è posto su un tavolo resistente alle vibrazioni rigido e circondato da una gabbia di Faraday. 3. Preparazione della Zona Dissection Strumenti chirurgici: un bisturi con lama # 11, piccole forbici standard di dissezione, forbici a molla, pinze curve, due Heidemann spatole e un cucchiaio. Materiale supplementare: una ghigliottina, un underpad, un chopper tessuto McIlwain con una lama di rasoio, carta da filtro, una pipetta Pasteur di vetro con una tettarella di gomma, plastica 2 pipette Pasteur di cui uno con una bocca larga, una capsula di Petri, un cilindro metallico di 7 mm di diametro (Figura 2A). <ol><li&gt; Nel piatto dissezione pieno di freddo ACSF (preparata nella fase 1), immergere un coperchio in vetro refrigerata da un piatto di colorazione, avvolto in carta da filtro. Rimuovere con attenzione le bolle d&#39;aria e ossigenare il ACSF attraverso un acquario gorgogliatore (Figura 2A). </li><li> Disporre di strumenti in ordine di utilizzo. Aggiungere tre strati di carta filtro sulla piastra chopper tessuto e una nuova lama di rasoio pulito con acqua distillata ed etere (Figura 2B). La lama deve essere orizzontale quando tocca la carta. Forza della lama viene regolata a metà del valore massimo e la velocità a circa un terzo del valore massimo. </li><li> Verificare attentamente se tutto è pronto (strumenti, temperatura ...), perché non avrete tempo dopo. </li><li> Chiedere a qualcuno di spruzzare la dissezione con una pipetta Pasteur pieno di ACSF freddo. </li><li> Anestetizzare il mouse con IP Nembutal (100 mg / kg) prima di decapitazione. Alotano può anche essere usato. Abbiamo confrontato entrambi i metodi e obtained stessi risultati. Decapitazione deve essere eseguita in anestesia dislocazione cervicale ma può anche essere usato. Tuttavia dislocazione cervicale necessita di una pratica molto buona per evitare la sofferenza degli animali. </li><li> Sezionare il underpad il più rapidamente possibile sotto doccia fredda continua ACSF. </li></ol> 4. Rimozione Cervello <ol><li> Mentre si tiene ancora la testa con il dito indice e il pollice di una mano sul muso, fare un&#39;incisione con le forbici dissezione lungo la metà della parte superiore della testa a partire dal bordo del taglio ghigliottina e funzionante rostralmente all&#39;osso frontale . </li><li> Tagliare attraverso il muscolo cutaneo su ciascun lato della testa per esporre completamente le piastre cranio e rimuovere i muscoli a lato caudale della testa. </li><li> Con le forbici dissezione, tagliare il muscolo temporale su ogni lato, lungo la piastra temporale, quindi tagliare le piastre frontali in mezzo, trasversalmente. Poi, fare un piccolo taglio sull&#39;osso occipitale, tra i due plAtes. </li><li> Per ogni lato, tagliato alla base caudale delle piastre occipitali. </li><li> Tagliare lungo la sutura sagittale con le forbici a molla. </li><li> Con una pinza, togliere le due metà del cranio, diffondendo loro distanti. </li><li> Con il bisturi, tagliare trasversalmente appena dopo il bulbo olfattivo e poco prima del cervelletto poi precipitare il cervello estratto nel piatto dissezione con freddo ACSF. </li></ol> 5. Dissezione ippocampale <ol><li> Una volta che il cervello è immerso nel piatto dissezione, recidere i due emisferi uno dall&#39;altro con un bisturi inserito nella metà. </li><li> La dissezione di ippocampo viene eseguita con spatole sotto controllo visivo attraverso un microscopio binoculare chirurgico (X25, Figura 2A). Su un emisfero, accuratamente diffondere le strutture di vedere il ventricolo laterale. Rimuovere il tronco cerebrale e diencefalo. Questo viene fatto applicando il spatole sulla corteccia frontale su un lato e sul diencefalo suldall&#39;altro lato. Fare attenzione a non toccare l&#39;ippocampo con spatole e per non allungare durante il sezionamento dei tessuti. </li><li> Sever del fornice quindi spingere delicatamente l&#39;ippocampo fuori della corteccia (rotolare via), con l&#39;inserimento di una spatola nel ventricolo. </li><li> Quando l&#39;ippocampo viene estratta, rimuovere il tessuto in eccesso e corteccia rimanenti vasi sanguigni. </li></ol> 6. Tagliare delle fette <ol><li> Con una bocca di plastica pipetta Pasteur, trasferire l&#39;ippocampo in un cucchiaio, con le sue Alvear verso l&#39;alto di superficie (lato convesso). </li><li> Rimuovere il liquido in eccesso con uno standard di plastica pipetta Pasteur. </li><li> Suggerimento il cucchiaio verticalmente quasi a toccare la carta da filtro del chopper (Figura 2B) e scendere l&#39;ippocampo dal cucchiaio, dal rapido toccando la carta da filtro quindi spostare indietro il cucchiaio. </li><li> Orientare l&#39;ippocampo e tagliatelo a fette trasversalmente a 400 micron con l&#39;elicottero (vedi Figura 2C per l&#39;orientamento dell&#39;ippocampopus relativi alla lama di rasoio). Agire il più rapidamente possibile. </li><li> Rimuovere la carta da filtro con l&#39;ippocampo a fette e avvolgerla intorno al cilindro metallico per diffondere le fette un po &#39;. Poi, libera le fette con spruzzi di ACSF utilizzando una plastica standard di pipetta Pasteur e raccoglierli in una capsula di Petri riempita con ACSF freddo. </li></ol> 7. L&#39;incubazione delle fette di interfaccia <ol><li> Selezionare fette con uno standard di plastica pipetta Pasteur e rapidamente metterli nella camera di registrazione. Fette riprendersi dal trauma dissezione direttamente nella camera di registrazione, in un&#39;interfaccia a 28 ° C. </li><li> La fetta molto probabilmente lavandino. Abbassare il livello del liquido di raggiungere il livello di sezione, e poi sollevarlo per farlo galleggiare. </li><li> Ruotare la fetta nella posizione corretta mentre abbassando il livello. Fette sono sempre orientati nello stesso modo per facilitare il posizionamento di elettrodi (2 stimolante e uno elettrodi di registrazione) nella regione CA1. </li><li> Fermarsi quandoil fluido è in interfaccia. A &quot;menisco&quot; dei media intorno alla fetta è indicativo di un livello sufficiente di supporti. Il filtro di rete deve essere saturo di media, ma non completamente sommerso. </li><li> Tenere la camera coperta con carta da filtro posto sopra il coperchio forato. </li><li> Lasciare riposare la fetta per almeno 1,5 ore a 28 ° C. </li></ol> 8. Registrazione delle risposte sinaptiche <ol><li> Registrazione di elettrodo: vetro capillari sono tirati da ottenere una resistenza punta di 2-5 MW quando è riempita di ACSF. Un piccolo pezzo di carta da filtro è disposto intorno alla punta dell&#39;elettrodo e cera ossea è applicato all&#39;estremità da ridurre la condensazione. Elettrodi stimolanti: platino-iridio elettrodi bipolari a grappolo con un diametro di 12,5 micron sono acquistati da FHC (USA). Con una cura, ciascun elettrodo può essere usato almeno 30 volte (Figura 1B). </li><li> Posizionare gli elettrodi nella radiatum strato della regione CA1, tutti gli elettrodi rivestitiup (Figura 3A). Elettrodi vengono abbassati 75 a 150 micron sotto la superficie della fetta con Narishige micromanipolatori. I due elettrodi di stimolazione sono posti a stimolare due fasci distinti di Schaffer collaterali. Quando gli elettrodi vengono abbassati sulla fetta, carte da filtro sono accuratamente messi tutti intorno a chiudere la camera. </li><li> Stimolazione bifasica (0,08 msec durata dell&#39;impulso per mezza onda) viene eseguita a tensione costante con uno stimolatore Grass collegato a unità di isolamento SIU-V. Massima risposta è controllato aumentando l&#39;intensità dello stimolo da 2 V a 12 V. massimo EPSPs di campo sono amplificati 1.000 volte con un amplificatore WPI ISO-80 e filtrati a 10 Hz e 10 kHz. Il segnale viene poi inviato ad un PC tramite uno strumento nazionale di un convertitore A / D. Stimolazione, l&#39;acquisizione e l&#39;analisi dei dati vengono eseguite utilizzando il programma WinLTP ( <a href="http://www.winltp.com">www.winltp.com</a> ). EPSPs di campo sono registrate al 40% dell&#39;ampiezza massima ottenuta in un ingresso-outmettere curva. Per ogni sezione, le piste fEPSP sono normalizzati contro la pendenza media del 30 min precede LTP induzione. </li><li> LTP è innescato applicando un singolo treno di stimolazione (100 Hz) alla concentrazione di prova su una via mentre il secondo percorso serve da controllo. </li></ol> 9. Pulizia del Setup <ol><li> Sciacquare tutto il circuito con una soluzione al 3% di acqua ossigenata (H 2 O 2) per almeno 10 minuti, poi scolare. Il circuito sarà accuratamente risciacquati con acqua distillata prima di iniziare qualsiasi esperimento. L&#39;uso di H 2 O 2 non è assolutamente necessaria come altri laboratori utilizzano solo acqua distillata per pulizia ma abbiamo notato la deposizione di residui scuri nel sistema di tubazioni utilizzando solo acqua. </li><li> Sostituire l&#39;acqua nel bagno d&#39;acqua sotto la camera di registrazione. </li><li> Bath gli elettrodi stimolanti suggerimenti in alcool per 5 min. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo sviluppato nel nostro laboratorio un protocollo risultante dalla combinazione dei metodi sviluppati e utilizzati da altri laboratori aventi un grande esperienza in registrazioni LTP 11,17. Questo protocollo è atto ad adulto ippocampo mouse e può essere utilizzato in animali di qualsiasi età e qualsiasi sfondo genotipo. Esso permette anche l&#39;analisi LTP in topi transgenici sviluppare malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer 18,19. L&#39;utilizzo ...

Al giorno d&#39;oggi, non vi è limitata comprensione di come le memorie complesse vengono memorizzate e richiamate a livello di circuito neuronale. Tuttavia, un&#39;ipotesi unificante di memoria è disponibile e ampiamente riconosciuti: memorie sono memorizzati come cambiamenti nella forza delle connessioni sinaptiche tra i neuroni nel sistema nervoso centrale. Di per sé, la ricerca sulla plasticità sinaptica ha largamente beneficiato di due scoperte svolta. (1) In un esperimento seminale, Bliss e Lomo 1, utilizzando il coniglio anestetizzato intatta, trovato che la consegna di una breve alta frequenza (1 sec, 100 Hz) impulso alla via perforante dell&#39;ippocampo causato una lunga durata (vari ore) aumento delle relative connessioni sinaptiche. Questo fenomeno affascinante è stato chiamato &quot;potenziamento a lungo termine&quot; o LTP da Douglas e Goddard nel 1975 2. (2) Successivamente, è stato trovato che un fenomeno simile potrebbe essere innescato in fettine cerebrali (0,4 mm) mantenuta artificialmente in vita in vitro </em&gt;. La LTP più studiato è stato osservato in vitro, fornendo uno o più tetani ad un fascio di assoni (cosiddetti collaterali Schaffer) durante la registrazione del campo risultante sinaptica eccitatoria potenziale evocato nei neuroni piramidali della cosiddetta regione CA1. I meccanismi di induzione di LTP sono stati ampiamente rivelato. Fondamentalmente, un afflusso di Ca 2 + attraverso i recettori NMDA attiva enzimi con due conseguenze: una fosforilazione di recettori AMPA (che aumenta la loro efficienza) e una incorporazione di recettori AMPA extra nella membrana postsinaptica 3. Per contro, i meccanismi della fase di mantenimento LTP sono largamente sconosciuti, soprattutto perché é sperimentalmente molto più difficile mantenere una fetta sano per molte ore che per 30 a 60 min. Molti studi sono stati dedicati alla comprensione dei meccanismi di LTP e teorie interessanti sono state elaborate nel corso degli anni, 4-11. Ma ONUfino ad ora, i meccanismi molecolari precisi alla base della crescita stabile in forza sinaptica non sono stati chiariti. Questo potrebbe essere dovuto alla difficoltà di riprodurre i risultati precedenti in laboratori diversi utilizzando tecniche diverse per la preparazione e la manutenzione di fettine ippocampali. Nel loro documento metodologia, Sajikumar et al. 12 ha sottolineato l&#39;importanza delle condizioni sperimentali per la preparazione di fettine di ippocampo di ratto e la registrazione delle LTP stabile. In questo video vi presentiamo tutte le fasi di ottimizzazione sviluppati nel nostro laboratorio nel corso degli anni di essere in grado di registrare un LTP molto stabile nel topo fettine di ippocampo. Questa ottimizzazione è stata fatta dai protocolli sviluppati e utilizzati con successo da altri laboratori che studiano i meccanismi di LTP in topi e ratti 13 11. Esso consente a ricercatori esperti di indurre e registrare un tempo molto lungo LTP duratura in topi adulti con un alto tasso di successo. Il pbase hysiological della indotto LTP è stato attentamente verificato e dimostrato 14. In questo lavoro la metodologia, si dimostra che le modifiche delle condizioni sperimentali, come la temperatura o l&#39;ossigenazione possono avere un profondo impatto sulla manutenzione LTP, mentre la procedura di dissezione può modificare profondamente le fette eccitabilità. Si deve inoltre sottolineare che il controllo preciso di tutti questi parametri richiede una formazione di diversi mesi per gli studenti alle prime armi.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 </td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 1M</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>63126</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air Liquide (Belgio)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillari</td><td>WPI, Inc. (Regno Unito)</td><td>TW150-4</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodi stimolanti</td><td>FHC (USA)</td><td>CE2B30</td><td></td></tr><tr><td>Strumenti chirurgici</td><td>FST (Germania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro 84 g/m2</td><td>Sartorius</td><td>FT-3-105-110</td><td></td></tr><tr><td>Mesh</td><td>Lycra</td><td>15 den</td><td></td></tr><tr><td>Colla</td><td>UHU</td><td>plus endfest300</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Instrument</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>WPI, Inc. (UK)</td><td>ISO-80</td><td></td></tr><tr><td>Interfaccia camera di registrazione</td><td>FST (Germania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompe peristaltiche</td><td>Gilson (USA)</td><td>Minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura</td><td>Università di Edimburgo</td><td><a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Tritatutto</td><td>Mcllwain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stimolatori</td><td>Grass (USA)</td><td>S88X + SIU-V</td><td></td></tr><tr><td>Analisi del programma</td><td>WinLTP</td><td><a href="http://www.winltp.com" target="_blank">www.winltp.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatori</td><td>Narishige</td><td>MM-3 e MMO-220A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio operatorio</td><td>Convertitore A/D Leica Microsystem</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>NIPCI-6229 serie</td><td></td> M</tr></tbody></table>

miglioramento della preparazione e la conservazione di fette mouse ippocampo per una registrazione molto stabile e riproducibile di potenziamento a lungo termine

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Potenziamento a lungo termine (LTP) è un tipo di plasticità sinaptica caratterizzata da un aumento della forza sinaptica e crede di essere coinvolti nella codifica della memoria. LTP suscitato nella regione CA1 di fettine di ippocampo acute è stata ampiamente studiata. Tuttavia i meccanismi molecolari alla base della fase di questo fenomeno manutenzione sono ancora poco conosciuti. Questo potrebbe essere dovuto in parte alle diverse condizioni sperimentali utilizzate da diversi laboratori. Infatti, la fase di mantenimento LTP è fortemente dipendente da parametri esterni come ossigenazione, temperatura e umidità. Esso dipende inoltre parametri interni come orientamento del piano di tranciatura e vitalità fetta dopo dissezione. L&#39;ottimizzazione di tutti questi parametri permette l&#39;induzione di un potenziamento molto riproducibile e molto stabile a lungo termine. Questa metodologia offre la possibilità di esplorare ulteriormente i meccanismi molecolari coinvolti nella crescita stabilein forza sinaptica in fettine di ippocampo. Si evidenzia anche l&#39;importanza delle condizioni sperimentali in vitro in indagini di fenomeni neurofisiologici.

Questa metodologia è stata utilizzata per analizzare le proprietà di potenziamento a lunga durata a lungo termine indotta in fettine ippocampali acute da adulti topi C57BL/6J (JANVIER SAS, Francia) 14. Sorprendentemente, il miglioramento delle condizioni sperimentali ha portato ad un nuovo modo di guardare alla LTP. Abbiamo dimostrato che la crescita di lunga durata in forza sinaptica non ha richiesto la sintesi di nuove proteine. Qui, dimostriamo che l&#39;induzione LTP dipende f...

Questo articolo presenta una metodologia completa per preparare e conservare<em&gt; In vitro</em&gt; Acuta fettine di ippocampo di topi adulti. Questo protocollo permette la registrazione di potenziamento a lungo termine di lunga durata molto stabile (LTP) per più di 8 ore con un tasso di successo del 95%.

Miglioramento della preparazione e la conservazione di fette mouse ippocampo per una registrazione molto stabile e riproducibile di potenziamento a lungo termine

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di registrare una potenziamento a lungo termine estremamente stabile e riproducibile in fette ippocampali acute. Questo risultato si ottiene innanzitutto estraendo il cervello del topo e dissezionando l'ippocampo in un liquido cerebrospinale freddo (A CSF) al microscopio. Il secondo passaggio consiste nel tagliare fette ippocampali trasversali utilizzando un taglia-tessuti.Successivamente, la sezione viene posizionata nella camera di registrazione di interfaccia, che sarà perfusa con liquido cerebrospinale artificiale ossigenato. L'ultimo passaggio consiste nel posizionare gli elettrodi e registrare l'attività sinaptica nella regione CA1 dell'ippocampo. Infine, un protocollo di stimolazione ad alta frequenza viene utilizzato per dimostrare l'induzione di una potenziamento a lungo termine molto stabile.Questo metodo può fornire informazioni sui meccanismi alla base della plasticità sinaptica. Può inoltre essere applicato ad altri sistemi, come modelli animali di malattie neurodegenerative o del sistema nervoso, o a malattie immunitarie. In generale, le persone alle prime esperienze con questo metodo incontreranno difficoltà, poiché tutte le manipolazioni richiedono grande abilità e molta pratica.Iniziare questa procedura risciacquando il circuito di perfusione con acqua distillata per un minimo di 20 minuti. Quindi accendere i sistemi di riscaldamento. Avviare la bollitura di carbogeno nel circuito.Il carbogeno viene fornito al bagno d'acqua sotto la camera di registrazione attraverso diffusori d'aria. Successivamente, regolare la portata nel bagno d'acqua mediante un flussimetro. In seguito, svuotare il circuito e riempirlo con liquido cerebrospinale filtrato per rimuovere le bolle d'aria. Quindi, posizionare l'anello, che sosterrà la sezione nella camera di mantenimento.Rimuovere con attenzione tutte le bolle d'aria dal circuito. Successivamente, regolare il livello di CSF A nella camera di registrazione mediante la vite dell'ago di aspirazione; la velocità della pompa di ingresso viene regolata a un millilitro al minuto, mentre quella della pompa di uscita a cinque millilitri al minuto. Prima della dissezione, preparare tutti gli strumenti chirurgici.Per rimuovere il cervello di un topo sacrificato. Tenere la testa con l'indice e il pollice, e praticare un'incisione con le forbici da dissezione lungo la linea mediana della parte superiore della testa, partendo dal bordo della ghigliottina e proseguendo fino all'osso frontale. Successivamente, tagliare il muscolo cutaneo su ciascun lato della testa per esporre completamente le placche craniche.Quindi rimuovere i muscoli dal lato cefalico del capo. Successivamente, tagliare il muscolo temporale su ciascun lato lungo la lamina temporale. Poi tagliare trasversalmente al centro le lamine frontali.Ora effettuare un piccolo taglio sull'osso occipitale tra le due placche. Tagliare alla base del coddle delle placche occipitali su ciascun lato. Quindi, con le forbici a molla, tagliare lungo la sutura sagittale.Infine, rimuovere il cranio allontanando le due emisferiche con una pinzetta. A questo punto, utilizzando il bisturi, effettuare un taglio appena prima del cervelletto e appena dopo il bulbo olfattivo, in senso trasversale, quindi trasferire il cervello estratto nella piastra di dissezione contenente liquido cefalorachidiano artificiale (A CSF) freddo. Una volta che il cervello è immerso nella piastra di dissezione, dividere i due emisferi cerebrali l'uno dall'altro mediante un bisturi inserito al centro, sotto un microscopio chirurgico binoculare, quindi separare con attenzione la struttura di un emisfero per evidenziare il ventricolo laterale.Rimuovere il tronco encefalico e il cefalone posizionando una spatola sulla corteccia frontale e l'altra spatola sul cefalone. Fare attenzione a non toccare l'ippocampo con la spatola e a non stirarlo durante il sezionamento del tessuto. Successivamente, recidere il fornice.Quindi spingere delicatamente l'ippocampo fuori dalla corteccia inserendo una spatola nel ventricolo. Una volta estratto l'ippocampo, rimuovere il tessuto corticale in eccesso e i vasi sanguigni residui con una pipetta Pasteur di plastica a bocca larga. Trasferire l'ippocampo su un cucchiaio con la superficie alveare rivolta verso l'alto sulla piattaforma del tagliatore.Rimuovere il liquido in eccesso dal cucchiaio con una pipetta Pasteur di plastica standard. Successivamente, inclinare il cucchiaio verticalmente e avvicinarlo quasi a contatto con la carta da filtro sul tritatore. Far cadere l'ippocampo toccando rapidamente la carta da filtro.Quindi ritirare il cucchiaio. Successivamente, orientare l'ippocampo e tagliarlo trasversalmente in fette di 400 micrometri con il tritatore.Eseguire la procedura il più rapidamente possibile. Successivamente, rimuovere la carta da filtro con le sezioni di ippocampo e avvolgerla attorno al cilindro metallico per distribuire leggermente le sezioni. Quindi liberare le sezioni con spruzzi di ACSF utilizzando una pipetta di plastica standard e raccoglierle in una piastra di Petri riempita con liquido freddo.Un CSF. Trasferire la sezione selezionata nella camera di registrazione utilizzando una pipetta pasteur di plastica standard. Lasciare che la sezione si riprenda dal trauma dell'isolamento nella camera di registrazione in interfaccia a 28 gradi Celsius.Se la fetta scende al di sotto del livello del liquido CSF, innalzare nuovamente il livello del liquido CSF fino a far galleggiare la fetta. Successivamente, orientare la fetta nella posizione che faciliti il posizionamento degli elettrodi nella regione CA1. Interrompere l'abbassamento del livello del liquido CSF quando raggiunge l'interfaccia.Il menisco del mezzo intorno alla sezione indica un livello sufficiente di LCS. La rete deve essere satura di mezzo, ma non completamente sommersa. Quindi mantenere la camera coperta con carta da filtro sulla chiusura forata.Lasciare riposare la sezione per almeno un'ora e 30 minuti a 28 gradi Celsius prima della registrazione. Ecco uno schizzo che mostra due input sinaptici indipendenti, S uno e S due, sulla stessa popolazione neuronale. Il percorso S uno è stato utilizzato per indurre la LTP, mentre il percorso S due ha funzionato da controllo.Queste sono le tracce F-E-P-S-P campione registrate subito prima dell'induzione di LTP, indicate dalle tracce rosse, e un'ora dopo l'induzione di LDP, indicate dalle tracce blu. Qui si osservano i F-E-P-S-P di una sezione perfettamente sana, mentre qui sono mostrati i F-E-P-S-P di una sezione che presenta un elevato livello di eccitabilità, quando le sezioni non sono perfettamente sane. Si osservano risposte polisinaptiche e la potenziamento della pendenza del F-E-P-S-P è ridotto.Di seguito è riportato un confronto tra i corsi temporali della pendenza F-E-P-S-P dopo la PTL indotta da un singolo ciclo di stimolazione ad alta frequenza, registrati nel 2005, 2010 e 2011 nel nostro laboratorio. I primi esperimenti sono stati registrati nel 2005 e sono indicati da cerchi pieni. Le registrazioni successive, indicate da quadrati pieni, hanno beneficiato di una procedura di dissezione migliorata.I risultati attuali derivano dall'ottimizzazione dell'ossigenazione dell'interfaccia e del controllo della temperatura, insieme alla standardizzazione degli elettrodi come indicato dai cerchi aperti. Qui mostriamo che un aumento della portata di ossigeno nel bagno d'acqua al di sotto della camera di registrazione da 0,15 a 0,25 litri al minuto, come indicato dalla curva blu, induce una diminuzione del 20% della pendenza F-E-P-S-P aumentando la temperatura da 28 a 29 gradi Celsius. Come indicato, la curva verde induce un aumento superiore al 50% della pendenza F-E-P-S-P.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che ogni passaggio è cruciale e che errori nel protocollo possono portare a risultati diversi. Dopo aver visto questo video, avrai una buona comprensione di come ottenere una potenziamento a lungo termine molto stabile. Registrazione in fette ippocampali acute.

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Questo articolo descrive le procedure per la preparazione di fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche associate con l'invecchiamento cerebrale e le malattie neurodegenerative legate all'età, come la malattia di Alzheimer.

Preparazione di acuta fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche durante l&#39;invecchiamento e Amiloide Patologia

Questo articolo video descrive procedure sperimentali per studiare la plasticità a lungo termine e i suoi processi associativi come il tagging sinaptico, la cattura e il cross-tagging nei neuroni piramidali CA1 utilizzando fette acute di ippocampo da roditori.

Indagine di Synaptic Tagging / Cattura e Cross-cattura utilizzando acuta fettine di ippocampo da Roditore

Questo protocollo viene illustrata l'implementazione di un ottimizzato N-metilico-D-glucamine (NMDG) protezione recupero metodo di preparazione di fetta di cervello. Una formulazione di singolo supporto viene utilizzata per ottenere in modo affidabile fette di cervello sano da animali di tutte le età e per diverse applicazioni sperimentali.

Preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un' ottimizzata N-metilico-D-metodo di ripristino protettivo glucamine

Questo protocollo descrive la stabilizzazione del livello di ossigeno in un piccolo volume di tampone riciclato e aspetti metodologici della plasticità sinaptica attività-dipendente di registrazione in fettine ippocampali acute sommersi.

Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

Abbiamo usato elettrodi di registrazione e stimolazione in fette di cervello ippocampali longitudinali e elettrodi di registrazione e stimolazione longitudinalmente posizionati nell'ippocampo dorsale in vivo per evocare potenziali post-ynaptici extracellulari e dimostrare plasticità sinaptica a lungo termine lungo l'interlamellar longitudinale CA1.

Studiare la plasticità sinaptica a lungo termine nell'Ippocampo Interlamellar CA1 di Electrophysiological Field Recording

Il protocollo presentato descrive il trasporto e la preparazione del tessuto ippocampale umano resected con l'obiettivo finale di utilizzare fette cerebrali vitali come strumento di valutazione preclinica per potenziali sostanze antietiche.

Preparazione di fette acute di ippocampale umano per registrazioni elettrofisiologiche

Questo è un protocollo per la preparazione a slice acuta da ippocampo di topi adulti e invecchiamento che sfrutta la perfusione transcardiale e il taglio delle fette con NMDG-aCSF ghiacciato per ridurre i danni ipossici al tessuto. Le fette risultanti rimangono sane per molte ore e sono adatte per le registrazioni di patch e field a lungo termine.

Ridurre al minimo l'ipossia nelle fette di ippocampale da topi adulti e anziani

Questo protocollo descrive la preparazione di fette orizzontali di corteccia ippocampale-entorinale (HEC) da topi che mostrano un'attività spontanea di increspatura ad onda acuta. Le fette vengono incubate in una camera di tenuta dell'interfaccia semplificata e le registrazioni vengono eseguite in condizioni sommerse con liquido cerebrospinale artificiale a flusso rapido per promuovere l'ossigenazione dei tessuti e l'emergere spontaneo di attività a livello di rete.

Affezione cerebrale acuta del topo per indagare sull'attività spontanea della rete ippocampale

Questo articolo ha lo scopo di descrivere un protocollo sistematico per ottenere fette orizzontali del cervello ippocampale nei topi. L'obiettivo di questa metodologia è preservare l'integrità delle vie della fibra ippocampale, come il percorso perforante e il tratto di fibra muschiata per valutare i processi neurologici correlati al giro dentato.

Fette ippocampali orizzontali del cervello del topo

Presentiamo un protocollo per preparare fette acute dall'ippocampo dorsale-intermedio dei topi. Confrontiamo questa preparazione trasversale con l'affezione coronale in termini di qualità delle registrazioni e conservazione delle caratteristiche morfologiche dei neuroni registrati.

Preparazione di fette acute dall'ippocampo dorsale per la registrazione a cellule intere e la ricostruzione neuronale nel giro dentato di topi adulti

Impara a preparare fette acute di ippocampo murino per registrazioni elettrofisiologiche stabili di potenziamento a lungo termine. Questo protocollo ottimizzato garantisce un tasso di successo del 95% e registrazioni LTP riproducibili per oltre 8 ore.

Miglioramento della preparazione e la conservazione di fette mouse ippocampo per una registrazione molto stabile e riproducibile di potenziamento a lungo termine (Video) | JoVE Journal

Miglioramento della preparazione e la conservazione di fette mouse ippocampo per una registrazione molto stabile e riproducibile di potenziamento a lungo termine

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