Miglioramento della preparazione e la conservazione di fette mouse ippocampo per una registrazione molto stabile e riproducibile di potenziamento a lungo termine

Questo articolo presenta una metodologia completa per preparare e conservare

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di essere in grado di registrare un potenziamento a lungo termine molto stabile e riproducibile nelle fette acute dell'ippocampo. Ciò si ottiene estraendo prima il cervello del topo e sezionando l'ippocampo nel liquido cerebrospinale A freddo al microscopio. Il secondo passo consiste nel tagliare le fette trasversali dell'ippocampo con un tritafazzoletti.

Successivamente, la fetta viene posizionata nella camera di registrazione dell'interfaccia, che verrà perfusa con liquido cerebrospinale artificiale ossigenato. Il passaggio finale consiste nel posizionare gli elettrodi e registrare l'attività sinaptica nella regione CA one dell'ippocampo. In definitiva, viene utilizzato un protocollo di stimolazione ad alta frequenza per mostrare l'induzione di un potenziamento a lungo termine molto stabile.

Attraverso questo metodo è possibile fornire informazioni sul meccanismo alla base della plasticità sinaptica. Può anche essere applicato ad altri sistemi come modelli animali di sistema neurodegenerativo o nervoso, o a malattie immunitarie. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché tutte le manipolazioni richiedono grande abilità e molta pratica.

Iniziare questa procedura risciacquando il circuito di perfusione con acqua distillata per un minimo di 20 minuti. Quindi accendere gli impianti di riscaldamento. Avviare il gorgogliare del carbogeno nel circuito.

Il carbogeno viene erogato al bagno d'acqua sottostante la camera di registrazione attraverso diffusori d'aria. Successivamente, controllare la portata nel bagnomaria con un flussometro Successivamente, svuotare il circuito e riempirlo con un filtro A CSF per rimuovere le bolle. Quindi posizionare l'anello, che sosterrà la fetta nella camera di contenimento.

Rimuovere con cautela tutte le bolle d'aria dal circuito. Quindi regolare il livello A CSF nella camera di registrazione con la vite dell'ago di aspirazione, la velocità della pompa di ingresso viene regolata a un millilitro al minuto e la pompa di uscita viene regolata a cinque millilitri al minuto. Prima della dissezione, preparare tutti gli strumenti chirurgici.

Per rimuovere il cervello di un topo sacrificato. Afferra la sua testa con l'indice e il pollice e fai un'incisione con le forbici da dissezione lungo il centro della parte superiore della testa, partendo dal bordo della ghigliottina, tagliando e correndo verso l'osso frontale. Quindi, tagliare il muscolo cutaneo su ciascun lato della testa per esporre completamente le placche craniche.

Quindi rimuovere i muscoli sul lato della coccola della testa. Successivamente tagliare il muscolo temporale su ciascun lato lungo la placca temporale. Quindi tagliare trasversalmente le piastre frontali al centro.

Ora fai un piccolo taglio sull'osso occipitale tra le due placche. Tagliare alla base delle placche occipitali su ciascun lato. Quindi, con le forbici a molla, tagliare lungo la sutura sagittale.

Infine, rimuovi il cranio allargando le metà l'una dall'altra con una pinza. Ora con il bisturi tagliato appena prima del cervelletto e subito dopo il bulbo olfattivo, trasferire trasversalmente quindi il cervello estratto nel piatto di dissezione con A CSF freddo. Una volta che il cervello è emerso nel piatto di dissezione, recidere i due emisferi l'uno dall'altro con un bisturi inserito al centro sotto un microscopio chirurgico binoculare, allargare con cura la struttura di un emisfero per rivelare il ventricolo laterale.

Rimuovere il tronco encefalico e il cephalon mettendo una spatola sulla corteccia frontale e l'altra spatola sul cephalon. Fare attenzione a non toccare l'ippocampo con la spatola e a non allungarlo durante il sezionamento dei tessuti. Dopodiché, recidere il fornice.

Quindi spingere delicatamente l'ippocampo fuori dalla corteccia inserendo una spatola nel ventricolo. Quando l'ippocampo viene estratto, rimuovere il tessuto corticale in eccesso e i vasi sanguigni rimanenti con una pipetta da pascolo in plastica a bocca larga. Trasferisci l'ippocampo in un cucchiaio con la sua superficie alvi verso l'alto fino alla piattaforma del tritatutto.

Rimuovere il liquido in eccesso dal cucchiaio con una normale pipetta di plastica per pascoli. Dopodiché, inclina il cucchiaio verticalmente e quasi tocca la carta da filtro sul tritatutto. Stacca l'ippocampo toccando rapidamente la carta da filtro.

Quindi ritira il cucchiaio. Quindi, orienta l'ippocampo e affettalo. Trasversalmente a 400 micron con il tritatutto.

Eseguire la procedura il più rapidamente possibile. Successivamente, rimuovere la carta da filtro con le fette di ippocampo e avvolgerla attorno al cilindro metallico in modo da allargare un po' le fette. Quindi liberare le fette con spray di A CSF utilizzando una normale pipetta pastorale in plastica e raccoglierle in una capsula di Petri riempita di freddo.

Un liquido cerebrospinale. Trasferire la fetta selezionata nella camera di registrazione con una pipetta di plastica standard. Lasciare che la fetta si riprenda dal trauma da dissezione nella camera dell'interfaccia di registrazione a 28 gradi Celsius.

Se la sezione affonda, abbassare il livello A CSF al livello della sezione, quindi aumentare nuovamente il livello A CSF per rendere la fetta mobile. Successivamente, orientare la fetta nella posizione che faciliterebbe il posizionamento degli elettrodi nella regione CA uno. Interrompere l'abbassamento del livello A CSF quando si trova all'interfaccia.

Il menisco del mezzo attorno alla fetta è indicativo di un livello sufficiente di A CSF. La rete deve essere satura di fluidi ma non completamente sommersa. Quindi tenere la camera coperta con carta da filtro sopra il coperchio perforato.

Lasciare riposare la fetta per almeno un'ora e 30 minuti a 28 gradi Celsius prima di registrare. Ecco uno schizzo che mostra due input sinaptici indipendenti come uno e S due per la stessa popolazione neuronale. La via S uno è stata utilizzata per indurre LTP mentre la via S due ha agito come controllo.

Queste sono le tracce campione F-E-P-S-P registrate appena prima dell'induzione LTP come indicato dalle tracce rosse e un'ora dopo l'induzione LDP indicato dalle tracce blu. Ecco gli EPSP F di una fetta perfettamente sana e qui ci sono gli EPSP F di una fetta che presenta un alto livello di eccitabilità quando le fette non sono perfettamente sane. Si osservano risposte polisinaptiche e il potenziamento della pendenza F-E-P-S-P è ridotto.

Ecco un confronto tra i corsi temporali del pendio F-E-P-S-P dopo LTP indotto da un singolo treno di stimolazione ad alta frequenza registrato nel 2005, 2010 e 2011 nel nostro laboratorio. I primi esperimenti sono stati registrati nel 2005 indicati da cerchi pieni. Le registrazioni successive indicate da quadrati riempiti hanno beneficiato di una migliore procedura di dissezione.

I risultati attuali derivano dall'ottimizzazione dell'ossigenazione dell'interfaccia e del controllo della temperatura, insieme alla standardizzazione degli elettrodi come indicato dai cerchi aperti. Qui mostriamo che l'aumento della portata di ossigeno nel bagno d'acqua sotto la camera di registrazione da 0,15 a 0,25 litri al minuto, come indicato dalla curva blu, induce una diminuzione della pendenza F-E-P-S-P del 20% aumentando la temperatura da 28 a 29 gradi Celsius. Come indicato, la curva verde induce un aumento di oltre il 50% della pendenza F-E-P-S-P.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che ogni passaggio è cruciale e che gli errori nel protocollo possono portare a risultati diversi. Dopo aver visto questo video, avrai una buona comprensione di come ottenere un potenziamento a lungo termine molto stabile. Registrazione in fette di ippocampo acuto.