Microdissezione laser di neuroni da cellule differenziate Neuroprogenitor umani in coltura

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di sviluppare un modello di coltura neuronale umana, identificare marcatori neuronali e isolare una popolazione pura di neuroni per l'analisi dell'espressione genica. Ciò si ottiene espandendo prima le cellule neuroprogenitrici umane per creare un rifornimento continuo di cellule progenitrici. In una seconda fase, le cellule neuro progenitrici vengono coltivate in presenza di integratori di differenziazione e fattori di crescita neurotrofici in piastre rivestite con fattori di attaccamento.

Successivamente, viene eseguita la colorazione immunofluorescente per i marcatori neuronali per determinare il destino delle cellule neuroprogenitrici differenziate. Infine, viene eseguita la microdissezione a cattura laser di neuroni coltivati su vetrini di membrana PEN per facilitare l'analisi dell'espressione genica specifica del neurone. Si ottengono risultati che mostrano che le cellule neuroprogenitrici differenziate sono prevalentemente di natura neuronale.

Basato sulla colorazione immunofluorescente e sulla cattura dei neuroni. Mediante microdissezione a cattura laser, le cellule neuroprogenitrici umane possono essere espanse e differenziate in colture ricche di neuroni. Per gli studi in vitro, poiché queste colture hanno alcune cellule galiche, possiamo utilizzare la micro dissezione a cattura laser per isolare una popolazione pura di neuroni.

A dimostrare queste procedure sarà Ron Bouchard, un ricercatore senior associato presso la nostra struttura di riferimento per microscopi. Per iniziare questa procedura, rianimare uno stock congelato di cellule neuroprogenitrici umane isolate dal cervello fetale riscaldandole rapidamente a 37 gradi Celsius, e quindi aggiungendole a un T 75 contenente 15 millilitri di terreno neurobasale preriscaldato, integrato con 10 nanogrammi per millilitro, EG, F e FGF. Dopo aver coltivato le cellule per tre giorni, trasferire le neurosfere in una provetta da 15 millilitri e pellettare mediante centrifugazione a 1000 giri/min per cinque minuti dopo la centrifugazione, scartare il surnatante, lasciando circa 100 microlitri di terreno, e trasferire il pellet cellulare in una provetta einor.

Un pellet di cella da 100 microlitri è sufficiente per dividersi in due matracci T 75. Se inferiore, ridurre il numero di fiasche poiché le cellule neuroprogenitrici non riescono a proliferare. Se diviso in un filo, rompi completamente le neurosfere in una singola sospensione cellulare pipettando su e giù 50 volte mantenendo la punta da 200 microlitri contro il fondo della provetta.

Controllare visivamente i progressi utilizzando un microscopio per garantire la dissociazione delle neurosfere. Quindi, dividere equamente la sospensione cellulare e aggiungerla a due matracci T 75. Uno per l'espansione continua e un altro per la differenziazione.

Quindi incubare i flaconi. Cambiare il mezzo delle cellule neuroprogenitrici nel pallone contrassegnato per l'espansione mediante centrifugazione. Quindi scartando il vecchio mezzo e aggiungendone di nuovo.

Cambia il mezzo ogni quattro o cinque giorni fino a quando le neurosfere raggiungono la loro dimensione originale di 300-500 micron. Per iniziare la differenziazione delle cellule neuroprogenitrici in una coltura ricca di neuroni, posizionare un singolo vetrino copritore in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e rivestire aggiungendo 500 microlitri di 100 microgrammi per millilitro di poli-L lisina a ciascuno. Incubare bene le piastre per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare la soluzione di poliolo lisina.

Sciacquare la piastra con acqua sterile deionizzata e aspirare nuovamente. Successivamente, rivestire i pozzetti della piastra con 500 microlitri da cinque microgrammi per millilitro, laminina di topo e incubare per 30 minuti dopo l'incubazione, lavare nuovamente i pozzetti con aspirato PBS e metterli ad asciugare nella cappa di coltura tissutale. Quattro giorni dopo la divisione delle cellule, trasferire le piccole neurosfere dal pallone etichettato per la differenziazione nella piastra rivestita a 24 pozzetti.

Aggiungere una densità di circa 500 neurosfere per pozzetto dopo l'incubazione per sei ore quando le neurosfere si sono attaccate alla capsula, rimuovere il mezzo di proliferazione e aggiungere la differenziazione. Terreno costituito da integratore di terreno basale neurologico B 27 N-G-F-B-D-N-F-D-B-C e acido retinoico. Rimettere la piastra nell'incubatrice dopo la coltura di cellule neuroprogenitrici in terreno di differenziazione neuronale per due settimane, si ottiene una coltura ricca di neuroni.

Sciacquare i neuroni una volta in PBS e poi fissarli in aldeide paraforme al 4% per 30 minuti. Una volta fissate, sciacquare le celle tre volte con PBS. Quindi preparare le cellule per l'immunocolorazione incubandole con tampone permeabile a temperatura ambiente per 60 minuti.

Quindi, aggiungere ai pozzetti gli anticorpi policlonali e monoclonali in 3% di BSA in PBS. Aggiungendo una coppia di anticorpi diversa in ciascuno, incubarli bene durante la notte a quattro gradi Celsius in uno shaker la mattina successiva. Lavare i vetrini coprioggetto tre volte con PBS e poi incubarli con anticorpi secondari anti coniglio P SI tre e anticorpi secondari anti-US fitzy a temperatura ambiente al buio per 90 minuti dopo l'incubazione.

Lavare i vetrini coprioggetto tre volte con PBS. Quindi posizionare 10 microlitri di terreno di montaggio su un vetrino. Estrarre il vetrino coprioggetto dal piatto di coltura e posizionarlo capovolto sul terreno di montaggio.

Pulisci delicatamente il mezzo di montaggio in eccesso e sigilla i bordi con lo smalto. Per preparare prima le cellule per la microdissezione, differenziare le cellule neuroprogenitrici in una coltura ricca di neuroni sulla membrana PEN. Vetrini rivestiti con poli L lisina e laminina.

Eseguire tutti i passaggi successivi in condizioni prive di RNA. Successivamente, colorare le colture utilizzando la colorazione del gene istogenico per visualizzare le cellule Il gene istografico colora i nuclei di viola e il citoplasma, un rosa chiaro, facilitando la differenziazione dei neuroni e delle cellule gliali in base alle loro morfologie distinte. Immergere il vetrino in etanolo al 75% e acqua sterile deionizzata per 30 secondi.

Quindi posiziona il vetrino su una salvietta Kim. Aggiungere 200 microlitri di istogene e attendere 20 secondi. Quindi, posizionare il vetrino in sequenza per 30 secondi ciascuno in acqua sterile deionizzata, etanolo al 75%, etanolo al 95% ed etanolo al 100%.

Quindi immergere lo xilene per cinque minuti e asciugare su una salvietta Kim per cinque minuti. Quindi posizionare un vetrino a membrana PEN sul vetrino normale e posizionarlo nel sistema di micro dissezione di acquisizione laser Veritas o LCM utilizzando il software. Scatta un'immagine della mappa per trovare le aree di popolazioni neuronali pure prive di astrociti.

Contrassegna questi neuroni usando gli strumenti di disegno. Successivamente, esegui l'acquisizione laser di queste aree utilizzando la precisione e l'automazione controllate dal computer in un processo in due fasi. In primo luogo, l'IR viene sparato in più punti con un'impostazione della potenza del laser di 70 milliwatt e un impulso di 2.500 microsecondi per collegare la membrana al cappuccio.

Successivamente, l'area contrassegnata viene asportata utilizzando un utensile da taglio UV a un livello basso di 10 millivolt. La combinazione di questi processi acquisisce selettivamente le aree contrassegnate sui macro condensatori LCM di acquisizione. Quando sono stati catturati almeno 100 neuroni, utilizzare un microscopio per rimuovere la membrana dal tappo e posizionarla su un tubo.

Isolare l'RNA totale dai campioni LCM utilizzando un kit di isolamento dell'RNA P OPU e trattare con il DNA. Quindi amplificare l'RNA isolato utilizzando il kit di amplificazione dell'RNA ribo amp seguendo le istruzioni del kit. Infine, eseguire l'analisi R-T-P-C-R in tempo reale utilizzando le sonde TAC MAN per rilevare la catena pesante del neurofilamento umano.

Una coltura ricca di neuroni si ottiene dalla differenziazione di neurosfere di quattro giorni utilizzando poli-L lisina e superfici rivestite di laminato in combinazione con fattori di crescita specifici per la differenziazione. Dopo due settimane, una coltura ricca di neuroni mostrata qui si ottiene in aree a bassa densità. Le cellule possono differenziarsi in astrociti come quelli visti qui.

La differenziazione degli astrociti può anche essere diretta utilizzando il fattore di crescita CNTF invece di quelli utilizzati per la differenziazione dei neuroni. La differenziazione dei neuroni può essere identificata utilizzando anticorpi contro specifici marcatori neuronali, nuovo N e sinapsina, acetilcolinesterasi e sinaptofisina, e BDNF e GAAP 43 La colorazione positiva è la prova che le cellule differenziate hanno le caratteristiche dei neuroni primari. Inoltre, gli astrociti possono essere identificati attraverso la statistica tre positiva e la colorazione immunologica GAP.

La microdissezione a cattura laser dei neuroni viene eseguita su cellule che sono state differenziate su membrana PEN rivestita di poli-L lisina e laminina Le diapositive mostrate qui sono neuroni colorati con colorazione istologica. Per visualizzare le cellule, le cellule di interesse possono quindi essere delineate utilizzando un laser, che fonde la membrana PEN, facendola aderire al cappuccio di cattura posto sopra di essa. Alla fine, numerose cellule possono essere delineate e catturate sullo stesso cappuccio per l'analisi del DNA o dell'RNA.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i neuroni utilizzando la microdissezione a cattura laser.