Name: Microdissezione laser di neuroni da cellule differenziate Neuroprogenitor umani in coltura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Impara la microdissezione laser di neuroni da cellule neuroprogenitrici umane differenziate in coltura. Questo metodo consente di isolare popolazioni neuronali pure per analisi dell'espressione genica.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione Merit Review (NEUD-004-07F) dal Veterans Administration (SP).

1. Ampliamento della NPC umani (Figura 1) <ol><li> Revive lo stock congelati di NPC umani da cervello fetale (Lonza, Walkersville, MD, USA) e la cultura in sospensione in T-75 palloni come neurosfere (Figura 1A) in mezzo Neurobasal contenenti integratori proliferazione, EGF (10 ng / ml) e FGF (10 ng / ml). </li><li> Dopo 3 giorni di coltura, trasferire le neurosfere una provetta da 15 ml e centrifugare a 500 rpm per 5 min. </li><li> Eliminare il supernatante lasciando dietro ~ 100 microlitri di media sopra il pellet cellulare e trasferire in una provetta Eppendorf. Un pellet 100 microlitri di cellule è sufficiente per dividere in 2 T-75 palloni. Se meno, ridurre il numero di flaconi come cellule neuroprogenitor non riescono a proliferare se dividere sottile. </li><li> Triturare il pellet con un microlitri punta 50x 200 mantenendo la punta 200 microlitri contro il fondo della provetta. Dividere la sospensione cellulare equamente in due parti e aggiungerli a 2 T-75 palloni (1-2 split), uno per continuareespansione e un altro per la differenziazione. </li><li> Continuare la coltura delle cellule neuroprogenitor per l&#39;espansione (primo pallone) cambiando il mezzo ogni 4-5 giorni fino a quando le neurosfere raggiungono la loro dimensione originale di 300-500 micron. Cambiare mezzo mediante centrifugazione (500 rpm; 5 min), scartare il vecchio medio e aggiungere nuovo mezzo. </li></ol> 2. Differenziazione dei NPC umano in un Neuron ricco Cultura (Figura 2) <ol><li> Per differenziazione delle cellule neuroprogenitor in una ricca cultura neurone, posizionare un singolo coprioggetto in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e cappotto con 100 ug / ml di poli-L-lisina aggiungendo 500 microlitri in ciascun pozzetto. Incubare i piatti per 30 minuti a RT. </li><li> Aspirare la soluzione di poli-L-lisina e lavare la piastra con acqua sterile. </li><li> Successivamente, cappotto pozzetti della piastra con 500 ml di 5 mcg / ml del mouse la laminina e incubare per 30 min. Dopo l&#39;incubazione, lavare i pozzetti con PBS. </li><li> 4 giorni dopo splitting le cellule (fase 1.4), trasferire i piccoli neurosfere nel pallone dicitura «differenziazione &#39;nei piatti rivestiti con una densità di ~ 500 neurosfere per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. </li><li> Dopo 6 ore, quando le neurosfere attribuiscono al piatto, rimuovere il terreno proliferazione e differenziazione aggiungere mezzo costituito da mezzo Neurobasal, B27 supplemento, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM), e acido retinoico (2 mM). </li></ol> 3. Immunofluorescenza di dissociati NPC (Figura 3) <ol><li> Seguendo coltura di cellule neuroprogenitor in terreno di differenziamento neuronale per due settimane, si ottiene una ricca cultura-neurone. Risciacquare i neuroni una volta in PBS e poi fissare in paraformaldeide al 4% per 30 min. Una volta fissato, lavare le cellule tre volte con PBS. </li><li> Incubare le cellule con tampone permeabilizzazione (5% BSA e 0,2% Triton X-100 in PBS) a temperatura ambiente per 60 min. </li><li> Incubare le stoviglie O / N a 4 ° C ina shaker con la seguente combinazione di anticorpi policlonali e monoclonali nel 3% BSA in PBS: NeuN (1:250) e synapsin (1:250); acetil colinesterasi (1:500) e synaptophysin (1:250); BDNF (1 : 500) e GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) e GFAP (1:1.000). </li><li> Lavare i coprioggetti tre volte con PBS e poi incubare con anti-coniglio-Cy3 e anticorpi secondari anti-topo-FITC a RT al buio per 90 min. Dopo l&#39;incubazione, lavare i vetrini tre volte con PBS. </li><li> Mettere 10 ml di mezzo di montaggio su un vetrino, estrarre il vetrino dalla piastra di coltura con una pinza, e metterlo a testa in giù sul supporto di montaggio. Delicatamente, spazzare via qualsiasi mezzo di montaggio in eccesso e sigillare i bordi con smalto. </li><li> Esaminare i neuroni immunostained in un microscopio a fluorescenza. </li></ol> 4. Microdissezione laser di neuroni (Figura 4) <ol><li> Differenziare NPC in una cultura ricca di neuroni su PEN membrana diapositivas rivestite con poli-L-lisina e mouse laminina seguendo le procedure descritte per la Figura 2. </li><li> Eseguire tutti i passaggi successivi in ​​condizioni di RNasi-free. </li><li> Macchiare le culture usando HistoGene Stain (Arcturus) per visualizzare le cellule. </li><li> Trova le aree di popolazioni neuronali pure privi di astrociti utilizzando la mappa stradale immagine di tutto il vetrino con il sistema Veritas LCM. Marcare i neuroni utilizzando gli strumenti di disegno. </li><li> Eseguire cattura laser di queste zone con precisione controllato da computer e automazione in un processo a due fasi. In primo luogo, IR (a raggi infrarossi) è sparato in più punti con un livello di potenza del laser di 70 mW e un impulso di 2.500 psec per ottenere la membrana allegare al tappo. Successivamente, la zona evidenziata viene asportato con un utensile da taglio UV a un livello basso livello di 10 mV. </li><li> La combinazione di questi processi cattura selettivamente le aree contrassegnate dalla membrana PEN su CapSure LCM caps macro. Quando il tappo viene sollevato, la membrana con il neurons aderisce al cap. </li><li> Isolare RNA totale da campioni LCM utilizzando un kit di isolamento PicoPure RNA (Arturo) e trattare con DNasi. </li><li> Amplificare l&#39;RNA isolato usando il kit di amplificazione RiboAMP RNA seguendo le istruzioni del kit. </li><li> Eseguire in tempo reale RT-PCR usando sonde TaqMan per rilevare neurofilament umana catena pesante (hNFHc). </li></ol> Abbreviazioni: DC, il morbo di Alzheimer; BDNF, fattore neurotrofico cervello-derivato, CREB, ciclico elemento di risposta AMP proteina legante, DBC, dibutirril AMP ciclico, EGF, fattore di crescita epidermico, FGF, fattore di crescita dei fibroblasti, GFAP, proteina acidica fibrillare gliale, LCM, laser cattura microdissezione, NGF, fattore di crescita nervosa, NPC, neuroprogenitor cellulare, PEN, polietilennaftalato.

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</ol>

Nessun conflitto di interesse da dichiarare.

Descriviamo in questo studio un ricco di neurone modello di coltura cellulare per la differenziazione delle cellule autorinnovanti neuroprogenitor umani e un metodo per isolare una popolazione pura di neuroni cattura microdissezione laser. Abbiamo utilizzato una combinazione di NGF, BDNF, DBC e acido retinoico per la differenziazione neuronale di NPC. DBC viene utilizzato per attivare CREB, un fattore di trascrizione che migliora neurogenesi 12. L&#39;acido retinoico induce uscita dal ciclo cellulare e riduce...

Vita lunga neurogenesi si verifica nella zona subventricular dei ventricoli laterali e nello strato subgranulare del giro dentato dell&#39;adulto cervello dei mammiferi 1. Cellule Neuroprogenitor (NPC) che provengono da queste regioni sono cellule multipotenti che possono differenziarsi in neuroni, astrociti e oligodendrociti 2. NPC hanno generato interesse a causa del loro potenziale per essere trapiantate nei pazienti affetti da varie patologie neurodegenerative tra cui il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica, ictus e malattie (AD) 3 di Alzheimer. Studi con NPC sono generalmente concentrati su questo angolo trapianto ma il potenziale di neuroni NPC-derivati ​​come modello di coltura cellulare per determinare il meccanismo di neurodegenerazione non è stato sfruttato appieno. Studi precedenti hanno generalmente utilizzato neuroni post-mitotici isolate da tessuti cerebrali roditore che devono essere isolati per ogni esperimento in quanto non sonoauto-rigenerante. Anche se le linee di cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y compreso e le cellule SK-N-MC può essere ampliato, non hanno le caratteristiche di neuroni primari. NPC umani, invece, offrono vantaggi sia perché possono essere espansi per passaggi multipli e possono essere differenziate per generare una popolazione di cellule con le caratteristiche di neuroni primari 4,5. In questo studio, descriviamo un nuovo protocollo di differenziazione per ottenere una popolazione ricca di neuroni coerente da NPC disponibili in commercio isolati da cervello fetale umano. Poiché queste culture contengono una piccola percentuale di cellule gliali, dobbiamo metodi aggiuntivi per isolare una popolazione pura di neuroni per la caratterizzazione molecolare. Microdissezione laser (LCM) è un romanzo tecnica mediante la quale una popolazione omogenea di cellule da una sezione di tessuto può essere selettivamente catturato per analisi di espressione genica 6. Il cervello è un tessuto eterogeneo costituito da neuroni, glia e altri ty cellapes. LCM è stato usato per determinare l&#39;espressione genica specifica del neurone analisi 7-10. Abbiamo già effettuato LCM di neuroni dell&#39;ippocampo da AD (Tg2576) sezioni di cervello del mouse per visualizzare diminuita espressione di ciclico elemento di risposta AMP binding protein (CREB) e BDNF specificamente in neuroni dell&#39;ippocampo 11. Nel presente studio, si descrivono le procedure per l&#39;espansione della NPC umani, la differenziazione neuronale, immunofluorescenza per i marcatori neuronali e LCM per l&#39;isolamento dei neuroni coltivati ​​su PENNA diapositive membrana.

<table><tbody><tr><td>Cellule neuroprogenitrici (NPC) </td><td>Lonza</td><td>PT-2599</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A Medium basale umano</td><td>Tecnologia delle cellule staminali</td><td>5750</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A Integratore per la proliferazione</td><td>Tecnologia delle cellule staminali</td><td>5753</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A Integratore per la differenziazione</td><td>Tecnologia delle cellule staminali</td><td>5754</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B-27 (50x) </td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico umano</td><td>Tecnologia delle cellule staminali</td><td>2633</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti </td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Fattore neurotrofico derivato dal cervello </td><td>Segnalazione cellulare</td><td>3897S</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita nervoso </td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Dibutirrile ciclico AMP</td><td>Sigma</td><td>D-0627</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lisina </td><td>Sigma</td><td>P-5899</td><td></td></tr><tr><td>Lamina di topo </td><td>Sigma</td><td>L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>Anticorpo Sigma</td><td>R-2625</td><td></td></tr><tr><td>STAT3</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9132</td><td></td></tr><tr><td>GFAP Anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>3670</td><td></td></tr><tr><td>GAP43 Laboratori</td><td>di trasduzione</td><td>degli</td> anticorpi 612262 <td></td></tr><tr><td>Anticorpo BDNF</td><td>Millipore</td><td>AB1534SP</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo acetil colinesterasi </td><td>Santz cruz</td><td>Sc-11409</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo sinaptofisina</td><td>Abcam</td><td>ab18008-50</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo NeuN</td><td>Chemicon</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo sinapsina</td><td>Novus</td><td>NB300-104</td><td></td></tr><tr><td>Anti topo FITC</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-095-146</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laboratori</td><td></td><td></td>di ricerca</tr><tr><td>Anti Rabbit Cy3</td><td>Jackson Immuno</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laboratori di</td><td></td><td></td>ricerca</tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1653</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Acros</td><td>21568-2500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehye </td><td>Fisher</td><td>4042</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti (vetrino coprioggetto per cerchi grandi)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-102</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio (Prolong Gold)</td>Membrana per penna <td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biosistemi applicati</td><td>LCM0521</td><td></td></tr><tr><td>Kit di colorazione della sezione congelata Histogene LCM</td><td>Biosistemi applicati</td><td>KIT0401</td><td></td></tr><tr><td>Kit di amplificazione dell'RNA RiboAmp</td><td>Biosistemi applicati</td><td>KIT0201</td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento dell'RNA Picopure</td><td>Biosistemi applicati</td><td>KIT0202</td><td></td></tr><tr><td>Capsure Macro LCM Tappi</td> per <td>biosistemi applicati</td><td>LCM0211</td><td></td></tr></tbody></table>

microdissezione laser di neuroni da cellule differenziate neuroprogenitor umani in coltura

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Cellule Neuroprogenitor (NPC) isolati dal cervello fetale umano sono stati espansi in condizioni proliferative in presenza del fattore di crescita epidermico (EGF) e fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) per fornire un rifornimento abbondante di cellule. NPC sono state differenziate in presenza di una nuova combinazione di fattore di crescita nervosa (NGF), cervello-derivato fattore neurotrofico (BDNF), dibutirril cAMP (DBC) e acido retinoico su piatti rivestito con poli-L-lisina e mouse laminina per ottenere neurone -ricche culture. NPC sono stati differenziati anche in assenza di neurotrofine, DBC e acido retinoico e in presenza di fattore neurotrofico ciliare (CNTF) per produrre colture ricche di astrociti. NPC dissociati sono stati caratterizzati da immunofluorescenza per un pannello di marcatori neuronali tra cui NeuN, synapsin, acetilcolinesterasi, synaptophysin e GAP43. Proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) e STAT3, marcatori astrociti, sono stati rilevati nel 10-15% dei NPC differenziati. Per facilitaretipo cellulare caratterizzazione molecolare specifico, cattura microdissezione laser è stata eseguita per isolare neuroni coltivati ​​su polietilennaftalato (PEN) scorre membrana. I metodi descritti in questo studio forniscono strumenti preziosi per far progredire la nostra comprensione dei meccanismi molecolari della neurodegenerazione.

Ampliamento della NPC (Figura 1) Quando neurosfere sono ripartiti per una singola sospensione cellulare da triturazione, la punta della pipetta deve toccare il fondo della provetta in modo che vi sia una certa resistenza quando la sospensione è pipettati su e giù. Il numero di volte di triturazione può variare tra individui e deve essere decisa per tentativi ed errori esaminando la sospensione cellulare risultante sotto un microscopio. È importante fornire sufficiente densità d...

Cellule neuroprogenitor umane (NPC) sono stati ampliati in condizioni proliferanti. NPC sono stati differenziati in colture ricche di neuroni in presenza di una combinazione di neurotrofine. Marcatori neuronali sono state rilevate mediante immunofluorescenza. Per isolare una popolazione pura di neuroni, NPC sono stati differenziati sulla penna scivoli di membrana e cattura microdissezione laser è stata eseguita.

Microdissezione laser di neuroni da cellule differenziate Neuroprogenitor umani in coltura

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è sviluppare un modello di coltura neuronale umana, identificare marcatori neuronali e isolare una popolazione pura di neuroni per l'analisi dell'espressione genica. Questo risultato si ottiene innanzitutto espandendo cellule progenitrici neuroepiteliali umane per creare una fornitura continua di cellule progenitrici. Come secondo passaggio, le cellule progenitrici neurali vengono coltivate in presenza di supplementi di differenziamento e fattori di crescita neurotrofici in piastre rivestite con fattori di adesione.Successivamente, viene eseguita una colorazione immunofluorescente per marcatori neuronali al fine di determinare il destino delle cellule progenitrici neurali differenziate. Infine, viene effettuata la microdissezione laser con cattura di neuroni coltivati su vetrini con membrana PEN per facilitare l'analisi dell'espressione genica specifica per i neuroni. I risultati ottenuti mostrano che le cellule progenitrici neurali differenziate sono prevalentemente di natura neuronale.In base alla colorazione immunofluorescente e al recupero di neuroni. Mediante microdissezione laser, le cellule progenitrici neurali umane possono esse

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Questo protocollo descrive una procedura dettagliata per la resuspending e la coltura di neuroni derivati da cellule staminali umane che in precedenza erano differenziati dai progenitori neurali in vitro per più settimane. La procedura facilita i saggi basati sull'imaging di neuriti, sinapsi e marcatori neuronali che esprimono tardivamente in un formato compatibile con la microscopia leggera e lo screening ad alto contenuto.

Replatazione post-differenziazione dei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umane per lo screening ad alto contenuto di neuritogenesi e maturazione delle sinapsi

Impara la microdissezione laser di neuroni da cellule neuroprogenitrici umane differenziate in coltura. Questo metodo consente di isolare popolazioni neuronali pure per analisi dell'espressione genica.

Microdissezione laser di neuroni da cellule differenziate Neuroprogenitor umani in coltura

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