Microdissezione laser di neuroni da cellule differenziate Neuroprogenitor umani in coltura

L'obiettivo generale del seguente esperimento è sviluppare un modello di coltura neuronale umana, identificare marcatori neuronali e isolare una popolazione pura di neuroni per l'analisi dell'espressione genica. Questo risultato si ottiene innanzitutto espandendo cellule progenitrici neuroepiteliali umane per creare una fornitura continua di cellule progenitrici. Come secondo passaggio, le cellule progenitrici neurali vengono coltivate in presenza di supplementi di differenziamento e fattori di crescita neurotrofici in piastre rivestite con fattori di adesione.

Successivamente, viene eseguita una colorazione immunofluorescente per marcatori neuronali al fine di determinare il destino delle cellule progenitrici neurali differenziate. Infine, viene effettuata la microdissezione laser con cattura di neuroni coltivati su vetrini con membrana PEN per facilitare l'analisi dell'espressione genica specifica per i neuroni. I risultati ottenuti mostrano che le cellule progenitrici neurali differenziate sono prevalentemente di natura neuronale.

In base alla colorazione immunofluorescente e al recupero di neuroni. Mediante microdissezione laser, le cellule progenitrici neurali umane possono essere espanse e differenziate in colture ricche di neuroni. Per studi in vitro, poiché queste colture contengono alcuni gal cells, possiamo utilizzare la microdissezione laser per isolare una popolazione pura di neuroni.

Le procedure saranno dimostrate da Ron Bouchard, un ricercatore senior del nostro laboratorio centrale di microscopia. Per iniziare questa procedura, scongelare rapidamente una provetta congelata di cellule progenitrici neurali umane isolate dal cervello fetale riscaldandole a 37 gradi Celsius, quindi aggiungerle a un flacone T75 contenente 15 millilitri di mezzo neurobasale preriscaldato, integrato con 10 nanogrammi per millilitro di EGF e FGF. Dopo aver coltivato le cellule per tre giorni, trasferire le neurosfere in un tubo da 15 millilitri e raccoglierle in pellet mediante centrifugazione a 1000 giri al minuto per cinque minuti; al termine della centrifugazione, eliminare il soprannatante lasciando circa 100 microlitri di mezzo, quindi trasferire il pellet cellulare in un tubo eppendorf.

Un pellet di cellule di 100 microlitri è sufficiente per essere suddiviso in due fiasche T 75. Se la quantità è inferiore, ridurre il numero di fiasche poiché le cellule progenitrici neurali non riescono a proliferare. Se la suddivisione è scarsa, frammentare accuratamente le neurosfere in una sospensione monocellulare pipettando su e giù 50 volte, mantenendo la punta da 200 microlitri contro il fondo del tubo.

Verificare visivamente l'avanzamento utilizzando un microscopio per assicurare la dissociazione delle neurosfere. Successivamente, dividere in parti uguali la sospensione cellulare e aggiungerla a due fiaschi T 75: uno per la prosecuzione dell'espansione e l'altro per la differenziazione.

Quindi incubare i flaconi. Cambiare il mezzo delle cellule progenitrici neurali nel flacone contrassegnato per l'espansione mediante centrifugazione. Successivamente, eliminare il vecchio mezzo e aggiungere mezzo fresco.

Cambiare il mezzo ogni quattro-cinque giorni fino a quando le neurosfere raggiungono la dimensione originale di 300-500 micrometri. Per iniziare la differenziazione delle cellule progenitrici neurali in una coltura ricca di neuroni, posizionare un singolo cover slip in ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e ricoprirlo aggiungendo 500 microlitri di poli-L-lisina 100 microgrammi per millilitro in ciascun pozzetto. Incubare le piastre per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare la soluzione di poli-L-lisina.

Risciacquare la piastra con acqua sterile deionizzata ed aspirare nuovamente. Successivamente, ricoprire i pozzetti della piastra con 500 microlitri di laminina murina a cinque microgrammi per millilitro e incubare per 30 minuti; al termine dell'incubazione, lavare i pozzetti con PBS, aspirare di nuovo e lasciarli asciugare nell'incubatrice per colture cellulari. Quattro giorni dopo la suddivisione delle cellule, trasferire i neurosfere piccole dal flacone etichettato per la differenziazione nella piastra da 24 pozzetti precedentemente ricoperta.

Aggiungere una densità di circa 500 neurosfere per pozzetto dopo un'incubazione di sei ore; quando le neurosfere si sono attaccate alla piastra, rimuovere il mezzo di proliferazione e aggiungere il mezzo di differenziazione, costituito da mezzo neurobasale, supplemento B27, NGF, BDNF, dbcAMP e acido retinoico. Reintrodurre la piastra nell'incubatore; dopo aver coltivato le cellule progenitrici neurali nel mezzo di differenziazione neuronale per due settimane, si ottiene una coltura ricca di neuroni.

Risciacquare i neuroni una volta con PBS e quindi fissarli con paraformaldeide al 4% per 30 minuti. Dopo la fissazione, risciacquare le cellule tre volte con PBS. Successivamente, preparare le cellule per la colorazione immunoistochimica incubandole con un buffer permeabilizzante a temperatura ambiente per 60 minuti.

Successivamente, aggiungere anticorpi policlonali e monoclonali in PBS con 3% BSA nei pozzetti. Aggiungere una coppia diversa di anticorpi in ciascun pozzetto e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius in un agitatore; il mattino seguente, lavare le lamelle tre volte con PBS, quindi incubarle con anticorpi secondari anti-coniglio P SI tre e anti-US fitzy a temperatura ambiente al buio per 90 minuti dopo l'incubazione.

Lavare le lamelle tre volte con PBS. Quindi applicare 10 microlitri di mezzo di montaggio su un vetrino. Estrarre la lamella dalla piastra di coltura e posizionarla al contrario sul mezzo di montaggio.

Rimuovere delicatamente l'eccesso di mezzo di montaggio e sigillare i bordi con smalto per unghie. Per preparare le cellule alla microdissezione, differenziare prima le cellule progenitrici neurali in una coltura ricca di neuroni su membrana PEN. Vetrini rivestiti con poli-L-lisina e laminina.

Eseguire tutti i passaggi successivi in condizioni prive di RNA. Successivamente, colorare le colture utilizzando la colorazione istogenetica per visualizzare le cellule: la colorazione istogenetica tinge i nuclei di viola e il citoplasma di un rosa chiaro, rendendo facile differenziare i neuroni e le cellule gliali in base alle loro morfologie distinte. Immergere il vetrino nel 75% di etanolo e in acqua sterile deionizzata per 30 secondi.

Quindi posizionare il vetrino su un fazzoletto Kim. Aggiungere 200 microlitri di istogeno e attendere 20 secondi. Successivamente, immergere il vetrino in sequenza per 30 secondi ciascuno in acqua sterile deionizzata, etanolo al 75%, etanolo al 95% ed etanolo al 100%.

Quindi immergere in xilene per cinque minuti e asciugare su un fazzoletto Kim per cinque minuti. Successivamente, posizionare una lamella con membrana PEN su una lametta normale e inserire entrambe nel sistema di microdissezione con laser Veritas o LCM utilizzando il software. Acquisire un'immagine di riferimento per individuare le aree con popolazioni neuronali pure prive di astrociti.

Contrassegnare questi neuroni utilizzando gli strumenti di disegno. Successivamente, eseguire il catturamento laser di queste aree mediante precisione e automazione controllate dal computer in un processo in due fasi. Innanzitutto, si invia un raggio IR in più punti con un'impostazione di potenza del laser di 70 milliwatt e un impulso di 2.500 microsecondi per attaccare la membrana al cappuccio.

Successivamente, l'area marcata viene escissa utilizzando uno strumento di taglio a raggi UV con un'impostazione bassa di 10 millivolt. La combinazione di questi processi consente di catturare selettivamente le aree marcate sui tappi macro LCM per la cattura. Quando sono stati catturati almeno 100 neuroni, utilizzare un microscopio per rimuovere la membrana dal tappo e posizionarla su un tubo.

Isolare l'RNA totale dai campioni di LCM utilizzando un kit di isolamento RNA P OPU e trattare con DNAsi. Successivamente, amplificare l'RNA isolato utilizzando un kit di amplificazione RNA ribo amp seguendo le istruzioni fornite dal kit. Infine, eseguire l'analisi di R-T-P-C-R in tempo reale utilizzando sonde TAC MAN per rilevare la catena pesante del neurofilamento umano.

Una coltura ricca di neuroni si ottiene differenziando neurosfere di quattro giorni su superfici rivestite con poli-L-lisina e laminina, in combinazione con fattori di crescita specifici per la differenziazione. Dopo due settimane, si ottiene una coltura ricca di neuroni, come mostrato in quest'area a bassa densità. Le cellule possono differenziarsi in astrociti, come quelli visibili qui.

La differenziazione degli astrociti può essere indotta anche mediante l'utilizzo del fattore di crescita CNTF, invece di quelli impiegati per la differenziazione neuronale. La differenziazione neuronale può essere identificata utilizzando anticorpi diretti contro specifici marcatori neuronali, come new N e sinapsina, acetilcolinesterasi e sinaptofisina, nonché BDNF e GAP-43. Una colorazione positiva costituisce evidenza che le cellule differenziate possiedono caratteristiche di neuroni primari. Inoltre, gli astrociti possono essere identificati mediante colorazione immunoistochimica positiva per stat three e GAP.

La microdissezione mediante laser di neuroni viene eseguita su cellule che sono state differenziate su vetrini rivestiti con poli-L-lisina e laminina. Qui sono mostrati vetrini con membrana PEN contenenti neuroni colorati con colorante istologico. Per visualizzare le cellule, le cellule di interesse possono quindi essere delimitate mediante un laser, che fonde la membrana PEN, inducendola ad aderire al cappuccio di raccolta posizionato al di sopra. Alla fine, numerose cellule possono essere delimitate e raccolte sullo stesso cappuccio per analisi di DNA o RNA.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i neuroni utilizzando la microdissezione laser assistita da cattura.