Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) dei soggetti debolmente di scattering
February 8th, 2014
Le posizioni tridimensionali di oggetti debolmente scattering possono essere identificati univocamente tramite linea digitale microscopia olografica (DIHM), che comporta una modifica minore ad un microscopio standard. Il nostro software utilizza un semplice euristica di imaging accoppiato con Rayleigh-Sommerfeld back-propagation cedere la posizione tridimensionale e la geometria di un oggetto fase microscopico.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ricostruire la posizione 3D in geometria di una catena di cellule batteriche che nuotano. Ciò si ottiene facendo crescere prima le cellule batteriche alla concentrazione corretta per fornire un campione adatto per l'imaging. In una seconda fase, la sorgente luminosa a LED viene impostata e allineata, consentendo di ottenere immagini olografiche.
Successivamente, il software di ricostruzione viene utilizzato per ottenere le coordinate 3D di una catena di cellule batteriche. I risultati mostrano la capacità di ricostruire la posizione e la configurazione 3D delle cellule batteriche sulla base dell'imaging olografico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia confocale, è che l'imaging volumetrico senza etichetta è possibile a frame rate elevati.
Per iniziare l'inoculazione, 10 millilitri di terreno KTY con cristalli di ghiaccio provenienti da uno stock congelato di streptococco ceppo V 4 0 5 1 1 97 incubano la coltura starter in un agitatore rotante durante la notte a 35 gradi Celsius e 150 giri/min. Una volta cresciuto, inoculare 10 millilitri di terreno KTY fresco con 500 microlitri provenienti dalla coltura starter satura. Incubare per 3,5 ore a 35 gradi Celsius e 150 giri/min fino a quando le cellule raggiungono una densità ottica a una lunghezza d'onda di 600 nanometri da 0,8 a 1,0.
Ciò rappresenta circa cinque volte 10 all'ottavo di cellule per millilitro. Quindi diluire le cellule da una a 400 in terreno fresco per ottenere la concentrazione finale di circa 1 milione di cellule per millilitro. Quindi, riempi una siringa di vaselina e crea un anello di grasso di un millimetro di altezza su un vetrino da microscopio.
Quindi posizionare una goccia della soluzione campione al centro. Posizionare delicatamente un vetro di copertura sul campione e premere leggermente sul vetro per sigillare i bordi, assicurandosi che il liquido sia a contatto sia con il vetrino che con il vetro di copertura. La camera del campione risultante dovrebbe finire fino a 100-200 micrometri di profondità.
Ruotare una lente a immersione in olio 60x in posizione e aggiungere una goccia di olio. Quindi posizionare la camera del campione sul tavolino del microscopio con il vetro di copertura rivolto verso il basso. Assicurarsi che non si formino bolle d'aria tra il vetrino coprioggetto e l'obiettivo.
Concentrarsi sulla superficie inferiore della camera del campione, quindi mettere a fuoco il condensatore. Quindi, spegnere l'illuminazione standard e posizionare la testa LED dietro l'apertura del condensatore del microscopio. Assicurarsi che il condensatore sia impostato sulla modalità campo chiaro e impostare l'alimentazione LED sulla massima potenza.
Quindi chiudere al massimo l'apertura del condensatore e spingere il LED nel suo supporto finché l'illuminazione non è centrata sull'apertura della lente dell'obiettivo. Accendere il computer e quindi reindirizzare il percorso della luce alla porta della fotocamera del microscopio. Regola la frequenza dei fotogrammi a 30 fotogrammi al secondo e la dimensione dell'immagine a cinque 12 x cinque 12 pixel nel software di acquisizione delle immagini.
Controllare un istogramma dell'intensità dell'immagine per assicurarsi che nessuna parte dell'immagine sia satura o sottoesposta. Il tempo di esposizione del fotogramma dovrebbe essere il più breve possibile pur mantenendo un buon contrasto. Se le cellule si raccolgono vicino a un'interfaccia, rifocalizzare il microscopio in modo che le cellule batteriche siano leggermente sfocate.
Le cellule dovrebbero trovarsi a circa 10-30 micron dal piano focale per una ricostruzione ottimale. Dopo la rimessa a fuoco, acquisire una serie di fotogrammi video e salvare come file VI non compresso. Quindi avvia il software DIHM disponibile per il download gratuito per convertire un fotogramma video in una pila di immagini rifocalizzata numericamente.
I fotogrammi di esempio vengono forniti con il software per iniziare la ricostruzione. Inserisci il fotogramma di interesse e il suo sfondo come file immagine separati nelle caselle. L'immagine di sfondo rappresenta in modo equo lo sfondo del video in assenza dell'ologramma e verrà utilizzata per sopprimere qualsiasi rumore di pattern fisso che potrebbe interferire con la localizzazione e l'analisi olografica.
Quindi, inserisci i parametri dello stack di output nelle caselle delle impostazioni globali. Innanzitutto, inserisci la posizione assiale del primo fotogramma in stato attivo iniziale. Quindi inserisci il numero di sezioni nella pila ricostruita in numero di passaggi e, infine, inserisci la distanza effettiva tra ciascuna sezione nella pila in termini di dimensione del passo.
Imposta la dimensione del passo in modo che corrisponda alla spaziatura laterale dei pixel per ricostruire gli oggetti con le proporzioni corrette utilizzando i dati di esempio. Questo valore dovrebbe essere di 0,233 micrometri. Quindi, inserisci l'illuminazione della fotocamera, la lunghezza d'onda, l'indice di rifrazione medio e la frequenza di campionamento laterale.
Nella casella pixel per micron, la frequenza di campionamento laterale della fotocamera può essere trovata dividendo l'ingrandimento dell'obiettivo per la dimensione dei pixel del sensore della fotocamera. Utilizzando i dati di esempio, il numero sarebbe 60 x diviso per 14 micrometri uguale a 4,29 pixel per micron. Quindi, se il centro dell'oggetto è scuro nell'ologramma, premere il pulsante di sfumatura Z capovolgi.
In questo modo verrà applicato un filtro che estrae gli oggetti al di sotto del piano focale nel campione originale. Quindi attiva il filtro passa-banda, che è responsabile della soppressione del contributo di pixel rumorosi all'immagine. Viene applicato a ogni porzione di immagine immediatamente dopo la generazione.
Quindi, controlla lo stato di attivazione dell'interruttore di uscita intermedio e assicurati che siano attivati. Quando questi interruttori sono attivi, verranno creati due video. Il primo output è lo stack di rimessa a fuoco con un nome di file che termina con lo stack a V.Il secondo stack è l'operazione di gradiente vera e propria con un nome di file che termina con un gradiente a VI.Idealmente, questo secondo stack conterrà l'oggetto di interesse evidenziato come un oggetto luminoso su uno sfondo scuro.
Dopo aver impostato tutti i parametri, premere Esegui nella finestra principale per eseguire i comandi. Il fotogramma selezionato apparirà nella casella principale del software. Quindi usa lo strumento lente di ingrandimento che si trova sulla barra degli strumenti a sinistra dell'immagine per ingrandire e rimpicciolire.
Usa lo strumento rettangolo per selezionare un'area di interesse o ROI e acquisire il maggior numero possibile di frange degli ologrammi all'interno del rettangolo per ottimizzare la ricostruzione. Infine, premi il pulsante di processo per generare le due pile di immagini separate. Ispeziona le pile risultanti utilizzando l'immagine J disponibile su questo sito web.
Se l'oggetto di interesse è chiaramente visibile nella pila di immagini sfumate, passare alla sezione di rendering per estrarre le coordinate dell'oggetto. Per avviare il rendering, premere il pulsante di estrazione delle funzioni per abilitare la funzione di localizzazione delle coordinate X, Y, Z. Quindi inserisci un percorso e un'estensione per il file delle coordinate di output, seleziona Stile raggio POV nella casella dello stile delle coordinate di output.
Ciò fa sì che il programma scriva un file oggetto che può essere visualizzato utilizzando il pacchetto software gratuito POV ray tracing, che può essere ottenuto da questo sito Web, rielabora le immagini per estrarre le coordinate degli oggetti. Il programma fornirà una serie di coordinate X, Y, Z nella ROI selezionata scritte nel nome del file nella casella dei cavi di uscita. L'estrazione delle coordinate degli oggetti richiede molto più tempo rispetto alla generazione delle pile.
Assicurarsi che il file di raggi POV di esempio fornito con il codice di ricostruzione sia presente nella stessa cartella del file delle coordinate di output. Modifica il file pov del punto di esempio e sostituisci il nome del file tra virgolette sulla riga. Includi il mio file NC con il nome del file di dati generato dal codice di ricostruzione.
Quindi personalizza la posizione della telecamera, l'illuminazione, la trama e le opzioni di rendering in POV ray. Al termine, fare clic sul pulsante Esegui per eseguire il rendering di un'immagine bitmap. Questa è un'immagine di una catena batterica di streptococco che è stata momentaneamente orientata.
Termina sul piano focale. Gli oggetti in questa configurazione sono difficili da ricostruire e in genere producono un blob vicino al piano focale. Qui è mostrata un'immagine correttamente resa rappresentativa della maggior parte dei fotogrammi di questa serie in cui la catena non è orientata direttamente lungo l'asse ottico.
La forma e la posizione dell'oggetto sono riprodotte fedelmente nel rendering, come si vede nel pannello a destra. Una volta padroneggiata questa tecnica, può essere eseguita in pochi minuti.
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Panoramica
Questo studio dimostra l'uso della microscopia olografica digitale in linea (DIHM) per ricostruire le posizioni tridimensionali e le geometrie delle cellule batteriche in movimento. La tecnica permette l'imaging volumetrico senza etichetta a velocità di fotogramma elevate, offrendo un significativo vantaggio rispetto ai metodi tradizionali.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biofisica
- Tecniche di imaging
Contesto
- La microscopia olografica digitale in linea (DIHM) è una tecnica di microscopia modificata.
- Consente l'identificazione unica di oggetti che disperdono debolmente la luce in tre dimensioni.
- L'imaging olografico può catturare processi dinamici in tempo reale.
- I metodi esistenti come la microscopia confocale spesso richiedono l'etichettatura, che può alterare il comportamento dei campioni biologici.
Obiettivo dello studio
- Ricostruire la posizione 3D e la geometria delle cellule batteriche in movimento.
- Dimostrare l'efficacia della DIHM nel catturare la dinamica delle cellule vive.
- Confrontare i vantaggi della DIHM rispetto ai metodi di imaging tradizionali.
Metodi utilizzati
- Preparazione di colture di cellule batteriche a concentrazioni appropriate.
- Allineamento di una sorgente di luce LED per un'imaging olografico ottimale.
- Utilizzo di software di ricostruzione per ottenere coordinate 3D.
- Analisi delle immagini olografiche risultanti per valutare la configurazione cellulare.
Risultati principali
- Le posizioni 3D delle cellule batteriche sono state ricostruite con successo.
- La tecnica ha dimostrato un'imaging ad alta velocità di fotogramma senza la necessità di etichette.
- I risultati hanno indicato un chiaro vantaggio rispetto alla microscopia confocale in termini di velocità di imaging e integrità del campione.
- L'imaging olografico si è dimostrato efficace per processi biologici dinamici.
Conclusioni
- La DIHM è uno strumento potente per studiare la dinamica delle cellule batteriche vive.
- Il metodo permette un'imaging 3D dettagliato senza alterare il campione.
- Questa tecnica potrebbe essere applicata a varie aree di ricerca biologica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Digital inline holographic microscopy (DIHM) enables label-free volumetric imaging of weakly-scattering biological samples at high frame rates, addressing a key limitation in live-cell imaging where traditional methods require labeling or lack 3D spatial resolution. This capability supports early discovery workflows by providing quantitative, model-free measurements of cellular position and geometry in native conditions, reducing mechanistic ambiguity in target validation and phenotypic screening. The technique’s compatibility with standard imaging hardware and scalable sample volumes positions it as a reusable platform for de-risking therapeutic hypotheses in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables unambiguous, model-free measurement of object location and shape in microscopic samples, supporting therapeutic hypothesis interrogation without exogenous labels.
- Operational Value: Uses standard CMOS/CCD cameras and LED or laser illumination, allowing integration into existing microscopy workflows without specialized reagents.
- Predictive Value: Provides quantitative 3D coordinates of cellular structures, facilitating functional target validation and biological de-risking through direct observation of native dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Captures interference patterns that contain depth information for 3D reconstruction, enabling label-free assessment of cellular responses in complex microenvironments.
- Operational Value: Defines accessible sample volume via camera sensor size and illumination coherence, supporting standardization across platforms with volumes up to 5 mm³ using laser illumination.
- Predictive Value: Employs Rayleigh-Sommerfeld back propagation and Gouy phase anomaly heuristics to generate reproducible, quantitative outputs for assay readiness and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling real-time observation of dynamic biological processes in disease-relevant systems.
- Operational Value: Allows high-frame-rate imaging without sample alteration, preserving native behavior for longitudinal tracking in preclinical models.
- Predictive Value: Delivers mechanistic de-risking by reducing ambiguity in cellular geometry and positioning, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
DIHM fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to lead identification and preclinical validation, particularly where label-free, volumetric, and dynamic imaging are required to compare experimental conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing model-free 3D localization of weakly-scattering objects like bacterial cells or subcellular structures.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative, refocused image stacks that allow comparison of cellular configurations across conditions.
- Analytics: Generates X, Y, Z coordinate outputs via feature extraction, enabling statistical analysis of spatial distributions and motion patterns.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving sample integrity during longitudinal imaging of dynamic processes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging capability rather than a single-use technique, leveraging free reconstruction software and standard hardware.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through label-free, model-free 3D reconstruction of object geometry and position.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via numerical refocusion and fixed-pattern noise suppression using background subtraction.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk through early, high-fidelity observation of native cellular dynamics.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via quantitative spatial data that informs target confidence and lead selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in holographic image acquisition and numerical reconstruction using Rayleigh-Sommerfeld back propagation.
- Needs instrumentation capable of plane-wave illumination and CMOS/CCD image capture at defined frame rates and resolutions.
- Demands cross-team standardization of illumination coherence, step size, and lateral sampling frequency for reproducible 3D reconstruction.
- Requires adaptation of output stack parameters (start focus, number of steps, step size) to match experimental scale and magnification.
- Practical limitation: optimal reconstruction requires objects to lie 10–30 microns from the focal plane, necessitating precise sample preparation and focusing.
