Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) dei soggetti debolmente di scattering
8 febbraio 2014
Le posizioni tridimensionali di oggetti debolmente scattering possono essere identificati univocamente tramite linea digitale microscopia olografica (DIHM), che comporta una modifica minore ad un microscopio standard. Il nostro software utilizza un semplice euristica di imaging accoppiato con Rayleigh-Sommerfeld back-propagation cedere la posizione tridimensionale e la geometria di un oggetto fase microscopico.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ricostruire la posizione 3D in geometria di una catena di cellule batteriche che nuotano. Ciò si ottiene facendo crescere prima le cellule batteriche alla concentrazione corretta per fornire un campione adatto per l'imaging. In una seconda fase, la sorgente luminosa a LED viene impostata e allineata, consentendo di ottenere immagini olografiche.
Successivamente, il software di ricostruzione viene utilizzato per ottenere le coordinate 3D di una catena di cellule batteriche. I risultati mostrano la capacità di ricostruire la posizione e la configurazione 3D delle cellule batteriche sulla base dell'imaging olografico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia confocale, è che l'imaging volumetrico senza etichetta è possibile a frame rate elevati.
Per iniziare l'inoculazione, 10 millilitri di terreno KTY con cristalli di ghiaccio provenienti da uno stock congelato di streptococco ceppo V 4 0 5 1 1 97 incubano la coltura starter in un agitatore rotante durante la notte a 35 gradi Celsius e 150 giri/min. Una volta cresciuto, inoculare 10 millilitri di terreno KTY fresco con 500 microlitri provenienti dalla coltura starter satura. Incubare per 3,5 ore a 35 gradi Celsius e 150 giri/min fino a quando le cellule raggiungono una densità ottica a una lunghezza d'onda di 600 nanometri da 0,8 a 1,0.
Ciò rappresenta circa cinque volte 10 all'ottavo di cellule per millilitro. Quindi diluire le cellule da una a 400 in terreno fresco per ottenere la concentrazione finale di circa 1 milione di cellule per millilitro. Quindi, riempi una siringa di vaselina e crea un anello di grasso di un millimetro di altezza su un vetrino da microscopio.
Quindi posizionare una goccia della soluzione campione al centro. Posizionare delicatamente un vetro di copertura sul campione e premere leggermente sul vetro per sigillare i bordi, assicurandosi che il liquido sia a contatto sia con il vetrino che con il vetro di copertura. La camera del campione risultante dovrebbe finire fino a 100-200 micrometri di profondità.
Ruotare una lente a immersione in olio 60x in posizione e aggiungere una goccia di olio. Quindi posizionare la camera del campione sul tavolino del microscopio con il vetro di copertura rivolto verso il basso. Assicurarsi che non si formino bolle d'aria tra il vetrino coprioggetto e l'obiettivo.
Concentrarsi sulla superficie inferiore della camera del campione, quindi mettere a fuoco il condensatore. Quindi, spegnere l'illuminazione standard e posizionare la testa LED dietro l'apertura del condensatore del microscopio. Assicurarsi che il condensatore sia impostato sulla modalità campo chiaro e impostare l'alimentazione LED sulla massima potenza.
Quindi chiudere al massimo l'apertura del condensatore e spingere il LED nel suo supporto finché l'illuminazione non è centrata sull'apertura della lente dell'obiettivo. Accendere il computer e quindi reindirizzare il percorso della luce alla porta della fotocamera del microscopio. Regola la frequenza dei fotogrammi a 30 fotogrammi al secondo e la dimensione dell'immagine a cinque 12 x cinque 12 pixel nel software di acquisizione delle immagini.
Controllare un istogramma dell'intensità dell'immagine per assicurarsi che nessuna parte dell'immagine sia satura o sottoesposta. Il tempo di esposizione del fotogramma dovrebbe essere il più breve possibile pur mantenendo un buon contrasto. Se le cellule si raccolgono vicino a un'interfaccia, rifocalizzare il microscopio in modo che le cellule batteriche siano leggermente sfocate.
Le cellule dovrebbero trovarsi a circa 10-30 micron dal piano focale per una ricostruzione ottimale. Dopo la rimessa a fuoco, acquisire una serie di fotogrammi video e salvare come file VI non compresso. Quindi avvia il software DIHM disponibile per il download gratuito per convertire un fotogramma video in una pila di immagini rifocalizzata numericamente.
I fotogrammi di esempio vengono forniti con il software per iniziare la ricostruzione. Inserisci il fotogramma di interesse e il suo sfondo come file immagine separati nelle caselle. L'immagine di sfondo rappresenta in modo equo lo sfondo del video in assenza dell'ologramma e verrà utilizzata per sopprimere qualsiasi rumore di pattern fisso che potrebbe interferire con la localizzazione e l'analisi olografica.
Quindi, inserisci i parametri dello stack di output nelle caselle delle impostazioni globali. Innanzitutto, inserisci la posizione assiale del primo fotogramma in stato attivo iniziale. Quindi inserisci il numero di sezioni nella pila ricostruita in numero di passaggi e, infine, inserisci la distanza effettiva tra ciascuna sezione nella pila in termini di dimensione del passo.
Imposta la dimensione del passo in modo che corrisponda alla spaziatura laterale dei pixel per ricostruire gli oggetti con le proporzioni corrette utilizzando i dati di esempio. Questo valore dovrebbe essere di 0,233 micrometri. Quindi, inserisci l'illuminazione della fotocamera, la lunghezza d'onda, l'indice di rifrazione medio e la frequenza di campionamento laterale.
Nella casella pixel per micron, la frequenza di campionamento laterale della fotocamera può essere trovata dividendo l'ingrandimento dell'obiettivo per la dimensione dei pixel del sensore della fotocamera. Utilizzando i dati di esempio, il numero sarebbe 60 x diviso per 14 micrometri uguale a 4,29 pixel per micron. Quindi, se il centro dell'oggetto è scuro nell'ologramma, premere il pulsante di sfumatura Z capovolgi.
In questo modo verrà applicato un filtro che estrae gli oggetti al di sotto del piano focale nel campione originale. Quindi attiva il filtro passa-banda, che è responsabile della soppressione del contributo di pixel rumorosi all'immagine. Viene applicato a ogni porzione di immagine immediatamente dopo la generazione.
Quindi, controlla lo stato di attivazione dell'interruttore di uscita intermedio e assicurati che siano attivati. Quando questi interruttori sono attivi, verranno creati due video. Il primo output è lo stack di rimessa a fuoco con un nome di file che termina con lo stack a V.Il secondo stack è l'operazione di gradiente vera e propria con un nome di file che termina con un gradiente a VI.Idealmente, questo secondo stack conterrà l'oggetto di interesse evidenziato come un oggetto luminoso su uno sfondo scuro.
Dopo aver impostato tutti i parametri, premere Esegui nella finestra principale per eseguire i comandi. Il fotogramma selezionato apparirà nella casella principale del software. Quindi usa lo strumento lente di ingrandimento che si trova sulla barra degli strumenti a sinistra dell'immagine per ingrandire e rimpicciolire.
Usa lo strumento rettangolo per selezionare un'area di interesse o ROI e acquisire il maggior numero possibile di frange degli ologrammi all'interno del rettangolo per ottimizzare la ricostruzione. Infine, premi il pulsante di processo per generare le due pile di immagini separate. Ispeziona le pile risultanti utilizzando l'immagine J disponibile su questo sito web.
Se l'oggetto di interesse è chiaramente visibile nella pila di immagini sfumate, passare alla sezione di rendering per estrarre le coordinate dell'oggetto. Per avviare il rendering, premere il pulsante di estrazione delle funzioni per abilitare la funzione di localizzazione delle coordinate X, Y, Z. Quindi inserisci un percorso e un'estensione per il file delle coordinate di output, seleziona Stile raggio POV nella casella dello stile delle coordinate di output.
Ciò fa sì che il programma scriva un file oggetto che può essere visualizzato utilizzando il pacchetto software gratuito POV ray tracing, che può essere ottenuto da questo sito Web, rielabora le immagini per estrarre le coordinate degli oggetti. Il programma fornirà una serie di coordinate X, Y, Z nella ROI selezionata scritte nel nome del file nella casella dei cavi di uscita. L'estrazione delle coordinate degli oggetti richiede molto più tempo rispetto alla generazione delle pile.
Assicurarsi che il file di raggi POV di esempio fornito con il codice di ricostruzione sia presente nella stessa cartella del file delle coordinate di output. Modifica il file pov del punto di esempio e sostituisci il nome del file tra virgolette sulla riga. Includi il mio file NC con il nome del file di dati generato dal codice di ricostruzione.
Quindi personalizza la posizione della telecamera, l'illuminazione, la trama e le opzioni di rendering in POV ray. Al termine, fare clic sul pulsante Esegui per eseguire il rendering di un'immagine bitmap. Questa è un'immagine di una catena batterica di streptococco che è stata momentaneamente orientata.
Termina sul piano focale. Gli oggetti in questa configurazione sono difficili da ricostruire e in genere producono un blob vicino al piano focale. Qui è mostrata un'immagine correttamente resa rappresentativa della maggior parte dei fotogrammi di questa serie in cui la catena non è orientata direttamente lungo l'asse ottico.
La forma e la posizione dell'oggetto sono riprodotte fedelmente nel rendering, come si vede nel pannello a destra. Una volta padroneggiata questa tecnica, può essere eseguita in pochi minuti.
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Panoramica
Questo studio dimostra l'uso della microscopia olografica digitale in linea (DIHM) per ricostruire le posizioni tridimensionali e le geometrie di cellule batteriche in nuoto. La tecnica consente un'immagine volumetrica senza marcatura a elevate frequenze di acquisizione, offrendo un vantaggio significativo rispetto ai metodi tradizionali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biophysica
- Tecniche di Imaging
Sfondo
- La microscopia olografica digitale in linea (DIHM) è una tecnica microscopica modificata.
- Consente l'identificazione univoca di oggetti debolmente diffusivi in tre dimensioni.
- L'imaging olografico può catturare processi dinamici in tempo reale.
- Metodi esistenti come la microscopia confocale spesso richiedono etichettature, che possono alterare il comportamento dei campioni biologici.
Scopo dello studio
- Ricostruire la posizione e la geometria tridimensionali di cellule batteriche in movimento.
- Dimostrare l'efficacia della DIHM nel catturare la dinamica di cellule vive.
- Confrontare i vantaggi della DIHM rispetto ai metodi di imaging tradizionali.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di colture cellulari batteriche a concentrazioni appropriate.
- Allineamento di una sorgente luminosa a LED per un'ottimale imaging olografico.
- Utilizzo di software di ricostruzione per ottenere coordinate tridimensionali.
- Analisi delle immagini olografiche risultanti per valutare la configurazione cellulare.
Risultati principali
- Le posizioni 3D delle cellule batteriche sono state ricostruite con successo.
- La tecnica ha dimostrato un'alta velocità di acquisizione delle immagini senza necessità di marcatori.
- I risultati hanno indicato un chiaro vantaggio rispetto alla microscopia confocale in termini di velocità di imaging e integrità del campione.
- L'imaging olografico si è rivelato efficace per i processi biologici dinamici.
Conclusioni
- La DIHM è uno strumento potente per lo studio della dinamica delle cellule batteriche vive.
- Il metodo consente un'analisi dettagliata in 3D senza alterare il campione.
- Questa tecnica potrebbe essere applicata a diverse aree della ricerca biologica.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La microscopia olografica digitale in linea (DIHM) consente l'acquisizione volumetrica senza marcatura di campioni biologici debolmente diffusivi ad alte frequenze di acquisizione, superando una limitazione fondamentale nell'immagine di cellule vive in cui i metodi tradizionali richiedono marcatura o presentano scarsa risoluzione spaziale 3D. Questa capacità supporta i flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo misurazioni quantitative e indipendenti da modelli della posizione e geometria cellulare in condizioni native, riducendo l'ambiguità meccanicistica nella validazione di bersagli e nei test fenotipici. La compatibilità della tecnica con hardware di imaging standard e volumi di campione scalabili la posiziona come piattaforma riutilizzabile per ridurre i rischi associati a ipotesi terapeutiche nella biologia della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente una misurazione univoca e indipendente da modelli della posizione e della forma di oggetti in campioni microscopici, supportando l'analisi di ipotesi terapeutiche senza l'uso di marcatori esogeni.
- Valore operativo: Utilizza telecamere CMOS/CCD standard e illuminazione LED o laser, permettendo l'integrazione nei flussi di lavoro di microscopia esistenti senza reagenti specializzati.
- Valore predittivo: Fornisce coordinate quantitative tridimensionali delle strutture cellulari, facilitando la validazione di bersagli funzionali e la riduzione dei rischi biologici attraverso l'osservazione diretta della dinamica nativa.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Cattura modelli di interferenza che contengono informazioni sulla profondità per la ricostruzione 3D, consentendo una valutazione senza marcatori delle risposte cellulari in microambienti complessi.
- Valore operativo: Definisce il volume del campione accessibile in base alle dimensioni del sensore della telecamera e alla coerenza dell'illuminazione, supportando la standardizzazione tra piattaforme con volumi fino a 5 mm³ mediante illuminazione laser.
- Valore predittivo: Utilizza la retropropagazione di Rayleigh-Sommerfeld e le euristiche dell'anomalia di fase di Gouy per generare output riproducibili e quantitativi relativi alla prontezza e scalabilità del saggio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, consentendo l'osservazione in tempo reale di processi biologici dinamici in sistemi pertinenti alla malattia.
- Valore operativo: Permette l'acquisizione di immagini ad alta frequenza di fotogrammi senza alterare il campione, preservandone il comportamento naturale per un monitoraggio longitudinale in modelli preclinici.
- Valore predittivo: Fornisce una riduzione del rischio meccanicistica riducendo l'ambiguità nella geometria e nel posizionamento cellulare, informando decisioni di avanzamento proporzionate al rischio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il DIHM si inserisce nel percorso della scoperta, che va dal test delle ipotesi nella biologia iniziale all'identificazione del composto promettente e alla validazione preclinica, in particolare quando sono necessarie immagini volumetriche, dinamiche e senza marcatura per confrontare le condizioni sperimentali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi fornendo una localizzazione 3D indipendente da modelli di oggetti debolmente diffusivi come cellule batteriche o strutture subcellulari.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso pile di immagini quantificate e rimesse a fuoco, che consentono il confronto delle configurazioni cellulari in diverse condizioni.
- Analisi: Genera output di coordinate X, Y, Z mediante estrazione di caratteristiche, abilitando l'analisi statistica delle distribuzioni spaziali e dei modelli di movimento.
- Ricerca traslazionale: Garantisce continuità preclinica preservando l'integrità del campione durante l'imaging longitudinale di processi dinamici.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità di imaging riutilizzabile piuttosto che come tecnica monouso, sfruttando software di ricostruzione gratuito e hardware standard.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva grazie alla ricostruzione tridimensionale, priva di etichette e indipendente da modelli, della geometria e della posizione dell'oggetto.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante il rimescolamento numerico e la soppressione del rumore a schema fisso attraverso la sottrazione dello sfondo.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui, riducendo i rischi biologici in fase avanzata grazie a un'osservazione precoce e ad alta fedeltà della dinamica cellulare nativa.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta per il rischio grazie a dati spaziali quantitativi che informano sulla sicurezza del bersaglio e sulla selezione dei candidati promettenti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'acquisizione di immagini olografiche e nella ricostruzione numerica mediante retropropagazione di Rayleigh-Sommerfeld.
- Necessita di strumentazione in grado di fornire un'illuminazione a onda piana e di acquisire immagini con sensori CMOS/CCD a frequenze di acquisizione e risoluzioni definite.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda la coerenza dell'illuminazione, l'incremento di passo e la frequenza di campionamento laterale, al fine di ottenere ricostruzioni 3D riproducibili.
- Richiede l'adattamento dei parametri dello stack in uscita (punto di fuoco iniziale, numero di passi, dimensione del passo) in base alla scala sperimentale e all'ingrandimento.
- Limite pratico: per una ricostruzione ottimale è necessario che gli oggetti si trovino a una distanza compresa tra 10 e 30 micron dal piano focale, il che richiede una preparazione del campione e una messa a fuoco estremamente precise.
