Tripsina Digest protocollo per analizzare la vascolarizzazione della retina di un modello murino

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare la rete vascolare retinica. Ciò si ottiene eseguendo prima una serie di lavaggi con acqua sulla retina isolata. Nella seconda fase, la retina viene digerita in tripsina a 37 gradi Celsius per circa un'ora o un'ora e mezza, a seconda delle dimensioni della retina.

Successivamente, il sistema vascolare viene isolato tramite ulteriori lavaggi con acqua e dissezione al microscopio. In definitiva, è possibile visualizzare i cambiamenti vascolari patologici come i micro aneurismi, la degenerazione capillare e il rapporto anomalo tra cellule endoteliali e parassiti. Quindi il vantaggio principale di try and digest rispetto ai metodi esistenti come la preparazione di montature piatte retiniche è che l'intera rete vascolare può essere evidenziata con grande chiarezza.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è tecnicamente impegnativo e difficile da eseguire in modo coerente. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di isolamento vascolare sono difficili da apprendere con le sole parole. Questo è uno strumento molto prezioso in qualsiasi laboratorio che sta eseguendo studi di biologia vascolare retinica come alcune malattie come la retinopatia diabetica, a dimostrare questa tecnica sarà Jonathan Chow, un talentuoso studente di medicina del mio laboratorio.

Dopo aver fissato l'occhio di topo enucleato e la formina tamponata neutra al 10% per 24 ore, mettere l'occhio in una capsula di Petri e coprirlo con una piccola quantità di acqua. Inizia la dissezione usando un paio di forbici da dissezione per eseguire con cura un taglio iniziale nella cornea. Quindi, tenendo l'area tagliata con una pinza dritta, usa un paio di forbici per tagliare lungo il bordo della cornea e la sclera rimuovendo la cornea.

Quindi, usa una pinza fine, curva e diritta. Staccare lentamente e con attenzione la sclera e la coroide dalla retina verso il nervo ottico. Quindi rimuovere il cristallino e l'iride e i detriti in eccesso dalla retina per aiutare a separare gli strati neurali della retina dai vasi sanguigni.

A circa 500 microlitri di acqua filtrata da 45 micrometri in una piastra a 24 pozzetti e posizionare la retina in un pozzetto, quindi agitare delicatamente per quattro o cinque ore a temperatura ambiente, cambiando l'acqua ogni 30-60 minuti. Continuare a lavare la retina in acqua durante la notte agitando delicatamente A temperatura ambiente il giorno seguente, rimuovere l'acqua e al 3% di tripsina, controllare al microscopio per assicurarsi che non si trovino detriti nel pozzo. Per evitare che il sistema vascolare aderisca ad esso, incubare il tessuto a 37 gradi Celsius con agitazione delicata o assente per un'ora o un'ora e mezza.

Quando il tessuto inizia a mostrare segni di disgregazione, posizionare la piastra sul tavolino del microscopio e poi evitare la retina. Rimuovere con cautela la tripsina per separare il sistema vascolare. Innanzitutto, aggiungi acqua filtrata alla retina usando una pinza.

Staccare la membrana limitante interna, che appare come uno strato sottile e trasparente. Agitare la piastra con una leggera agitazione. Dopo cinque minuti, posizionare nuovamente la piastra sul tavolino del microscopio e sostituire con cura l'acqua, evitando danni alla retina per aiutare a liberare la rete di vasi dal tessuto retinico aderente.

Lavare la retina come appena dimostrato fino a quando non rimangono pochi o nessun residuo nell'acqua dopo l'ultimo lavaggio. Quindi, in genere, la rimozione di tutto il tessuto non vascolare è la parte più difficile della procedura. Le seguenti tecniche possono essere utilizzate in sequenza o singolarmente Per facilitare l'isolamento della rete vascolare, un consiglio importante è quello di immergere tutti gli strumenti e la tripsina prima di manipolare la retina.

Questo può aiutare a evitare che un tessuto aderisca all'apparecchiatura. Rivestire un puntale per micropipetta da 200 microlitri con tripsina riservata, quindi pipettare con cura l'acqua su e giù, adiacente e soffiando verso i vasi retinici, provocando una leggera agitazione. Se il tessuto non vascolare è ancora resistente al centro, una micro pipetta rivestita di tripsina punta sul nervo ottico e pipettare accuratamente l'intera rete vascolare su e giù per aiutare a rompere il tessuto non vascolare.

Finalmente, va bene. Le pinze possono essere utilizzate per sollevare delicatamente il sistema vascolare fuori dall'acqua per rimuovere eventuali componenti non vascolari di aderenza. Il risultato finale dovrebbe essere una rete vascolare retinica intatta e priva di detriti

Per visualizzare la vascolarizzazione, posizionare prima una goccia d'acqua su un vetrino pulito. Quindi trasferire i recipienti digeriti in acqua sotto un controllo dell'endoscopio. Se il supporto a ribalta VA è piegato o aperto, i recipienti piegati portano a una scarsa visibilità.

Una volta macchiato, se il fazzoletto è piegato, aggiungere altra acqua e scuotere delicatamente il vetrino per facilitare l'apertura. Quindi utilizzare una micropipetta per rimuovere lentamente l'acqua in eccesso. Il prodotto finale di una procedura di successo è un montaggio piatto dell'intera rete del sistema vascolare retinico del topo con l'architettura mantenuta e colorata con emat, toin ed eoin.

Come mostrato qui, come si vede in questa immagine, nella retina si può osservare una chiara differenziazione tra le cellule endoteliali e i periciti. I nuclei delle cellule endoteliali, come indicato dalla freccia bianca, sono ovali o allungati e giacciono interamente all'interno della parete del vaso. I nuclei del parassita sono piccoli, sferici si colorano densamente e generalmente hanno una posizione protuberante lungo la parete del capillare.

La tripsina e il digestato sono una procedura comune utilizzata per analizzare la patologia vascolare nei modelli animali diabetici. Questa immagine mostra un esempio di degenerazione capillare come indicato dalla freccia bianca osservata in un topo DB DB, un modello per il diabete di tipo due. Sebbene questa procedura sia stata ottimizzata per le retine di topo, risultati simili possono essere ottenuti anche nelle retine di ratto.

È importante notare che le retine di ratto, come mostrato in queste immagini, sono più grandi delle retine di topo e richiedono 12 anziché 24 mentre le piastre. La rete vascolare della retina del ratto è anche meno fragile della sua controparte topina. È estremamente importante rimuovere la maggior parte possibile del tessuto non vascolare.

Eventuali residui porteranno a una colorazione aspecifica e porteranno a una scarsa visualizzazione del sistema vascolare. In questa immagine, ad esempio, si può osservare una rimozione non riuscita dell'intero tessuto non vascolare. Allo stesso modo, è anche importante che la retina sia aperta durante il montaggio in modo da migliorare la visualizzazione del sistema vascolare.

Questa immagine mostra un dispiegamento non riuscito della montatura piatta vascolare. Dopo aver padroneggiato questa procedura tecnicamente difficile. I trip e i digest possono essere un metodo estremamente prezioso che consente una visualizzazione dettagliata dell'intera rete vascolare.

Migliorando questa tecnica nell'occhio del topo, i ricercatori possono sfruttare i topi geneticamente manipolati per studiare vari percorsi che possono prendere il controllo della vascolarizzazione retinica e permetterci di comprendere la fisiopatologia di varie malattie della retina. Di conseguenza, possiamo migliorare la nostra comprensione di patologie come la retinopatia diabetica. Studiando modelli di topi come il topo DVDB, questo può in definitiva consentire l'opportunità di trovare nuovi potenziali interventi terapeutici mirati al sistema vascolare retinico.