Determinazione degli acidi grassi tollerabile e Concentrazioni tossina colerica Uso Umano cellule epiteliali intestinali e BALB / c macrofagi del mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare le concentrazioni tollerabili di acidi grassi e di colesterolo toin che non influenzino negativamente la sopravvivenza cellulare. Ciò si ottiene coltivando prima il tipo appropriato di cellule. Il secondo passo consiste nell'incubare le cellule con concentrazioni variabili dei tre acidi grassi da testare o con la tossina del colera.

Dopo 24 ore, la sopravvivenza cellulare viene valutata utilizzando un test MTT. In definitiva, i dati spettrometrici del test MTT mostrano concentrazioni ottimali di acidi grassi e tossina del colera con cui le cellule possono essere trattate senza una significativa riduzione della sopravvivenza. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla prevenzione delle infezioni da colera perché le vaccinazioni non sempre hanno successo.

I macrofagi di Moose musculus provenienti da topi C intestinali saranno utilizzati per tutte le determinazioni della tossina di co e per la determinazione della concentrazione su larga scala degli acidi grassi, le cellule vengono propagate in uno dei due mezzi, DMEM con L-glutammina completato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di antimicotico antibiotico o il terreno di base RPMI 1640 completato con il 10% di siero fetale bovino, 5% di L-glutammina e 1% di antibiotico. Antimicotico per questo protocollo, far crescere le cellule C intestinali in fiasche Corning quadrate di 75 centimetri con tappi ventilati a 37 gradi Celsius, 95% di aria e 5% di anidride carbonica per una scala fine. La determinazione della concentrazione di acidi grassi utilizza cellule epiteliali intestinali umane propagate in fiasche Corning quadrate di 75 centimetri con tappi ventilati in terreni per ipercura completati con il 10% di FPS e 30 nanogrammi per millilitro.

L'EGF umano non utilizza reagenti antimicotici antibiotici secondo le istruzioni del produttore incuba a 37 gradi Celsius, 95% di aria e 5% di anidride carbonica, tutte le cellule da uno a tre a circa il 70% di fluenza, a seconda del tipo di cellule cellulari, sono in genere in subcoltura ogni due o cinque giorni prima del trattamento con acidi grassi. Preparare prima gli acidi grassi trasferire gli acidi oleico, linoleico e linoleico dalle fiale di vetro fornite dall'azienda a fiale di vetro sterilizzate. Quindi, trasferire ciascun acido grasso in una provetta sterilizzata separata.

Sciogliere ciascun acido grasso in etanolo al 100% a una diluizione da uno a sei, seguito dall'edizione di RPMI 1640. Terreni incompleti fino a una concentrazione finale di 10 microgrammi per microlitro. Agitare ogni soluzione e trasferirla in fiale di vetro per la conservazione nella piastra del congelatore a meno 20 gradi Celsius.

Cellule epiteliali intestinali umane a 2.500 cellule per pozzetto in 96. Le piastre per colture tissutali a pozzetti aggiungono il terreno completo appropriato per portare il volume totale di ciascun pozzetto a 200 microlitri. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius, 95% di aria e 5% di anidride carbonica per 24 ore.

Dopo il periodo di proliferazione di 24 ore, rimuovere il supporto. Aggiungere le concentrazioni appropriate di ciascun acido grasso da testare ai pozzetti come controllo positivo. Incubare le cellule con il terreno completo come controllo negativo, incubare le cellule con il 70% di etanolo.

Successivamente, aggiungere un terreno completo per portare il volume totale di ciascun pozzetto a 200 microlitri. Incubare le piastre trattate per 24 ore prima di iniziare il test MTT per preparare la tossina del colera per i trattamenti cellulari. Sciogliere la tossina del colera in PBS ad una concentrazione di un milligrammo per millilitro.

Aliquotare la soluzione in fiale criogeniche e conservarla a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius prima dei trattamenti cellulari. Diluire la tossina da uno a cento in PBS sterilizzato o DMEM incompleto per una concentrazione di lavoro finale di un nanogrammo per piastra da microlitro. Macrofagi a 2.500 cellule per pozzetto in 96.

Le piastre di coltura tissutale a pozzetto incubano a 37 gradi Celsius, 95% di aria e 5% di anidride carbonica per 24 ore. Dopo il periodo di proliferazione di 24 ore, rimuovere il terreno e aggiungere le concentrazioni di test appropriate di colera ai pozzetti. Analogamente ai trattamenti con acidi grassi, incubare le cellule con un terreno completo come controllo positivo ed etanolo al 70% come controllo negativo per tutti i campioni e i trattamenti.

Utilizzare un minimo di tre repliche con più repliche per i controlli positivi. Aggiungere un terreno completo per portare il volume totale di ciascun pozzetto a 200 microlitri. Incubare le piastre trattate con la tossina del colera per 24 ore prima di iniziare il test MTT.

24 ore dopo che le cellule sono state trattate con acidi grassi o colorato, la vitalità delle cellule è determinata dal test MTT. Rimuovere la soluzione in ogni pozzetto della piastra da 96 pozzetti da testare e sostituirla con 200 microlitri. Una nuova soluzione completa per i supporti.

Aggiungere a ciascuno 10 microlitri di una soluzione MTT da 2,5 milligrammi per millilitro preparata al momento. Incubare bene la piastra a 37 gradi Celsius per tre o quattro ore. Dopo tre o quattro ore, scartare la soluzione del terreno e aggiungere 100 microlitri di acido cloridrico molare 0,04 in isopropanolo a ciascuno.

Incubare bene la piastra a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, trasferire la soluzione da ciascun pozzetto in una centrifuga a provette da centrifuga a 20.000 GS per un minuto o fino a quando non si forma un pellet. Trasferire tra 20 e 40 microlitri di ciascun campione in un lettore di micropiastre e leggere l'assorbanza a 570 nanometri utilizzando uno spettrofotometro.

Questa figura mostra la sopravvivenza della maggior parte dei macrofagi raffigurati in funzione del controllo positivo per i trattamenti che utilizzano concentrazioni crescenti di acido oleico, acido linoleico e acido linoleico. È evidente che le cellule non tollerano concentrazioni superiori a 100 nanogrammi per microlitro per nessuno degli acidi grassi. L'esperimento è stato ripetuto utilizzando cellule epiteliali umane per concentrazioni inferiori a 100 nanogrammi per microlitro con incrementi di 10 nanogrammi per microlitro, fino a 70 nanogrammi per microlitro.

Questo grafico mostra la sopravvivenza cellulare per ogni concentrazione di acido oleico. In un modo Inova ha indicato che una o più delle medie erano statisticamente diverse. Tuttavia, sono solo i trattamenti a concentrazioni più elevate che hanno reso i mezzi statisticamente diversi da quelli del controllo positivo.

È interessante notare che le differenze osservate erano dovute a un aumento della vitalità cellulare con maggiore variabilità. Risultati simili sono stati ottenuti per gli acidi linoleico e linoleico. Senso unico.

Inova ha indicato che nessuno dei mezzi di trattamento era statisticamente diverso dalla media del controllo positivo, ma la variabilità sembra aumentare per alcune delle concentrazioni più elevate, come 60 nanogrammi per microlitro di acido linoleico o acido linoleico da questi risultati. Le concentrazioni ottimali di acidi grassi quando si utilizzano cellule epiteliali intestinali umane sembrano essere comprese tra uno e cinque nanogrammi per microlitro. Gli effetti di concentrazioni variabili di tossina del collare sulla maggior parte della sopravvivenza dei macrofagi sono stati testati anche con trattamenti per i livelli di tossina con incrementi relativamente grandi.

È stata osservata una tendenza alla diminuzione della vitalità per la sopravvivenza cellulare, poiché la vitalità cellulare attesa variava notevolmente per ciascun trattamento. L'ampia variabilità della vitalità non ha comportato alcuna differenza significativa tra la media del controllo positivo con uno qualsiasi dei trattamenti, il che ha portato a ulteriori test di livelli di tossine di 100 nanogrammi o inferiori. Questo grafico mostra la vitalità cellulare per i trattamenti con livelli di tossine più piccoli.

La vitalità cellulare è molto variabile per quasi tutte le concentrazioni di tossine, anche se sono stati osservati lievi aumenti della vitalità a seguito dei trattamenti. Questi aumenti non sono statisticamente significativi per nessuno dei trattamenti rispetto alla media del controllo positivo. Sulla base di questi risultati.

La concentrazione raccomandata di tossina colorante è inferiore a 30 nanogrammi per trattamento quando si utilizzano macrofagi di topo C intestinali dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del colore o della ricerca per esplorare se gli acidi grassi possono migliorare l'immunità contro l'infezione da vio colera.