Name: Lutilità della fase-specifici medio-tardiva Drosophila Follicolo isolamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-02T20:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Impara a isolare follicoli di Drosophila a stadio medio-tardivo per analisi molecolari, imaging in vivo e saggi di sviluppo in vitro. Questo metodo consente di studiare l'oogenesi e la biologia dello sviluppo.

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Vorremmo ringraziare Thomas Lecuit (SQH-Utrophin :: linea GFP), l&#39;Bloomington Stock Center, e il Developmental Studies Ibridoma Banca dei reagenti. Abbiamo inoltre Ringraziamo tutti i membri del Tootle Lab per utili discussioni e critiche del manoscritto. Finanziamento dal National Science Foundation MCB-1158527, e fondi di start-up del Dipartimento di Anatomia e Biologia Cellulare, Università di Iowa sostenuto questo lavoro. National Institutes of Health Predoctoral formazione di Grant in Scienze Farmacologiche T32GM067795 supportato AJS. Supporto di memorizzazione dei dati sono state fornite dal ICTS, che è finanziato attraverso il CTSA sostenuto dal Centro Nazionale per le Risorse della Ricerca e il Centro Nazionale per l&#39;Avanzamento delle Scienze traslazionale, National Institutes of Health, attraverso di Grant UL1RR024979.

1. Preparazione Drosophila Prima di stage isolamento <ol><li> Rendere lievito in pasta umida combinando 50 g di lievito secco con 90 ml di acqua distillata. Mescolare con una spatola per unire. Lasciare riposare l&#39;impasto per ~ 30 minuti prima di valutare la coerenza. La consistenza dovrebbe essere abbastanza spesso per aderire al lato di un flaconcino mosca ma non correre lungo il lato. Per ottenere la consistenza desiderata può essere necessario aggiungere fino a 10 ml di acqua aggiuntiva o una piccola quantità di lievito secco. Conservare in un contenitore coperto a 4 ° C. Il lievito memorizzate possono essere utilizzate per ~ 1-2 settimane. </li><li> Raccogliere &lt;24 hr vecchie mosche adulti (maschi e femmine) dei genotipi desiderate e metterli in un flaconcino con la mosca oltre al cibo umido lievito in pasta spalmato sul lato del flaconcino. La temperatura alla quale linea sono mantenuti varierà secondo l&#39;esperimento. Per gli esperimenti di routine, mosche sono mantenute a temperatura ambiente. Considerando esperimenti in cui un gene èessendo iperespresso utilizzando il sistema UAS/GAL4 15 maggio richiedere mantenendo linea a 25 ° C o più, a seconda dei casi. </li><li> Fornire linea con striscio di lievito in pasta giornaliero per 2 giorni. NOTA: Dato che lo sviluppo del follicolo è strettamente regolata dallo stato nutrizionale della mosca femminile, è essenziale per fornire al volo con la sostanza nutritiva ricca lievito in pasta per almeno 36 ore prima della dissezione. </li></ol> 2. Isolamento di Mid-fine Staged Drosophila follicoli <ol><li> Lasciare i media a temperatura ambiente (~ 30 min). Se i follicoli in scena stanno per essere utilizzati per test di sviluppo in vitro, fresco preparare IVEM supporto (supporti di Grace insetti, calore inattivato siero fetale bovino al 10%, e 1x penicillina / streptomicina). Se i follicoli in scena stanno per essere utilizzati per mRNA o isolamento delle proteine ​​utilizzano o insetti di Grace o IVEM media. IMPORTANTE: la temperatura media è fondamentale. Se il supporto è freddo si alterasia il citoscheletro actina e microtubuli e sviluppo blocco. </li><li> Anestetizzare le mosche in flaconcino yeasted iniettando gas CO 2 e collocare 3-5 mosche di sesso femminile su un pad mosca sotto CO 2. IMPORTANTE: Non lasciare più femmine che può essere sezionato in un periodo di tempo di 10 min sul ​​pad volo come l&#39;esposizione estesa a CO 2 può causare la sterilità e morte. </li><li> Riempire un pozzetto di una piastra 9 posto con i media e posizionarlo sulla cima di una superficie scura (un pezzo di plexiglass nero funziona bene). Focalizzare l&#39;ambito dissezione sul fondo del pozzo. </li><li> Uso # 5 pinze Dumont raccogliere una donna sola con una sola mano (questo è meglio farlo con la mano dominante). Spesso è più facile prendere il femminile dalle ali, gambe e torace per la transizione addome. Immergere la femmina nei media riempite bene. Regolare la messa a fuoco del microscopio, se necessario. </li><li> Utilizzo di una seconda coppia di pinze tenuto in mano non dominante, afferrare la femmina alla fine anteriore dell&#39;addomein modo che l&#39;estremità posteriore è posizionata verso la mano dominante (Figura 2A). Assicurarsi di mantenere la mosca sommersa nei media. </li><li> Con la mano dominante, utilizzare la pinza per afferrare la cuticola al segmento pigmentata più posteriore secondo e strappare via dal resto dell&#39;addome (Figure 2B-C). </li><li> Utilizzando la pinza in mano dominante, premere delicatamente l&#39;estremità anteriore dell&#39;addome fino a quando le ovaie emergono (figure 2D-E). Se necessario, posizionare la pinza tra le due ovaie e tirarli fuori dalla carcassa. </li><li> O spostare le ovaie a un nuovo pozzo con mezzi freschi (Figura 2F) o rimuovere la carcassa di un tovagliolo Kimwipe o carta. Questo è particolarmente importante se follicoli sono stati isolati per lo sviluppo in vitro. </li><li> Ripetere l&#39;operazione finché non sono stati isolati 3-5 paia di ovaie. NOTA: Ogni ovaio è composta da ~ 16 ovarioli o catene di sequenza maturazione follicoli. Ogni ovarioleè contenuta all&#39;interno di una guaina muscolare. </li><li> Utilizzando morse pin e gli aghi in dotazione con loro, tirare delicatamente a parte l&#39;ovaio eseguendo gli aghi tra i ovarioli (Figura 2G). Ciò a volte sbloccare i singoli follicoli pure. </li><li> Ovarioli individuali e le fasi morfologiche facilmente distinguibili di sviluppo del follicolo dovrebbero essere visibili (Figura 2G, preso in giro a parte dell&#39;ovaio). Fare riferimento alle figure 1 e 2H per differenze morfologiche che possono essere utilizzati per distinguere le diverse fasi. Per isolare follicoli che sono all&#39;interno ovarioli intatti e ancora contenuti in una guaina muscolare, utilizzare un ago per tagliare tutti i ovariole al anteriore del follicolo precedente e al posteriore del follicolo immediatamente successivo follicolo di interesse. Questo romperà la guaina muscolare e follicolo di interesse distanza può essere tagliato via dai follicoli limitrofi senza danneggiarlo. </li&gt; <li> Come singoli stadi sono separati, spostare i follicoli di interesse, utilizzando una pipetta di vetro, di un nuovo pozzo con mezzi freschi. Ciò è particolarmente importante quando isolando follicoli per lo sviluppo in vitro. NOTA: È importante schiacciare il bulbo della pipetta prima di entrare media per evitare le bolle d&#39;aria dalla ridistribuzione dei follicoli di interesse in tutto il pozzetto. Inoltre, se i follicoli stanno attaccando la pipetta di vetro, la pipetta può essere una fase solida con 3% albumina di siero bovino (BSA) pipettando la soluzione BSA su e giù diverse volte e risciacquare con i media dissezione. </li><li> Una volta abbastanza follicoli sono stati isolati, procedere con esperimenti successivi. </li></ol> 3. In vitro per lo sviluppo di follicoli S10B <ol><li> Isolare follicoli S10B utilizzando il protocollo di isolamento fase (fase 2) in mezzi IVEM. Assicurarsi che i follicoli sono rapidamente allontanati dai detriti. Poiché questi follicoli continueranno a maturare, è imponella documentazione, che S10Bs sono raccolti per 30-60 min e poi inserito nel supporto maturazione di scelta. NOTA: S10B devono essere accuratamente distinto dai follicoli S10A (Figura 1C rispetto al 1B), in quanto i follicoli S10A non matureranno nella cultura dei media IVEM. In entrambi S10A e S10B follicoli, metà della lunghezza è composto da cellule infermiere e l&#39;altra metà è l&#39;ovocita, ma in S10B la lunghezza del follicolo è uguale a quella dei follicoli S14. </li><li> Usando una pipetta di vetro, spostare ~ 30 follicoli S10B in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. NOTA: Assicurarsi di verificare che tutti i follicoli in fase di trasferimento sono S10B e non hanno maturato alla S11. </li><li> Preparare 1 ml di media stagionatura per bene, cioè supporti IVEM più reattivi farmacologici. </li><li> Usando una pipetta di vetro tirato *, rimuovere il più supporti dal pozzo (passo 3.2) come possibile, e rapidamente aggiungi maturazione di supporto desiderato. NOTA: è indispensabile utilizzare un pip di vetro tiratoette come follicoli in scena può essere facilmente assimilato sia con pipette in vetro o punte di pipette con Pipetman. * Per fare pipette tirato: 1) riscaldare la parte sottile di lunghi, pipette di vetro nella fiamma di un becco Bunsen solo fino a quando il vetro comincia ad ammorbidirsi, 2) spostare immediatamente la pipetta dalla fiamma e tirare orizzontalmente per disegnare la pipetta in un tubo sottile, 3) rompere per generare un punto di fine. ATTENZIONE: Usare protezioni per gli occhi come frammenti di vetro possono volare via. </li><li> Ripetere i passaggi 3,1-3,4 per il numero di pozzi come l&#39;esperimento richiede. </li><li> Consentire follicoli di sviluppare per&gt; 10 ore e segnare la progressione evolutiva in un ambito di dissezione. NOTA: Gli esperimenti sono in genere segnati il ​​giorno successivo per consentire un tempo sufficiente per i follicoli a sviluppare. S10B è ~ 5 ore, S11 è ~ 30 minuti, S12 è ~ 2 ore, e la S13 è ~ 1 ora di durata a 25 ° C 1 e sviluppo a temperatura ambiente prenderà leggermente più lungo. Esperimenti simili a quello descritto per i follicoli S10B possono essereeseguita utilizzando follicoli S11-S13. </li></ol> 4. Isolamento palco per Live Imaging <ol><li> Isolare follicoli fase tardiva (S10B-14) che esprime il marcatore fluorescente di scelta utilizzando il protocollo di isolamento fase (fase 2) in mezzi IVEM, muovendosi rapidamente i follicoli lontano dai detriti. </li><li> Spostare follicoli di interesse in nuovi media e poi il trasferimento da pipetta di vetro per una Petri piastra inferiore vetrino. Abbiate cura di aggiungere supporti in modo che bolle nella zona inferiore vetrino, ma non trabocchi. </li><li> Per lunghi film intervallati, a volte è necessario mantenere l&#39;umidità all&#39;interno della piastra Petri aggiungendo un arrotolata Kimwipe inumidito con acqua, al bordo interno della piastra Petri. Mettere il coperchio sulla parte superiore. </li><li> Immagine su un microscopio invertito. Risoluzione dettagliata richiederà microscopia confocale. È necessario bilanciare frequenza di immagini, la forza di illuminazione, e la lunghezza di immagini; questo dovrà essere lavorato in modo indipendente per ogni lstrumento Abeling e processo di sviluppo. </li></ol> 5. Isolamento Palco per mRNA Preparazione <ol><li> Isolare i singoli follicoli stadio utilizzando il protocollo di isolamento fase (fase 2) sia con i media di Grace o IVEM. </li><li> Usando una pipetta di vetro, spostare le singole fasi di interesse in nuovi pozzetti con media; è possibile raccogliere più fasi contemporaneamente. </li><li> Mantenere tempi di recupero in 1 ora. Spostare i follicoli, utilizzando una pipetta di vetro, provette da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Centrifugare brevemente la provetta in un mini-microcentrifuga per far sedimentare tutti i follicoli. Usando una pipetta di vetro tirato (vedi punto 3.4), rimuovere con attenzione tutti i mezzi di comunicazione. NOTA: Se si utilizza una microcentrifuga full size, centrifugare i follicoli a bassa velocità. </li><li> Aggiungere 100 ml di Trizol e macinare a mano per ~ 20 secondi usando un pestello in plastica. Spin giù a tutta velocità in una microcentrifuga e passare Trizol in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga facendo attenzione a non disturbare alcun d pellettatoebris. Conservare a -80 ° C. </li><li> Ripetere i passaggi 5,1-5,5 fino a quando sono stati ottenuti abbastanza follicoli per l&#39;esperimento. Ordinariamente, ~ 75 S10B, ~ 75 S12 e S14 ~ 100 follicoli cedere ~ 10 mg di RNA. </li><li> Scongelare i campioni sul ghiaccio. Combina campioni, a seconda dei casi, in una provetta per microcentrifuga e portare il volume Trizol fino a 800 ml. Procedere con isolamento di RNA come indicato dal costruttore. IMPORTANTE: Ricordarsi di DNasi trattare l&#39;RNA isolato con RNasi libero DNasi. </li></ol> 6. Isolamento Palco per Western Blotting <ol><li> Preriscaldare un blocco di calore a 100 ° C. </li><li> Isolare i singoli follicoli stadio utilizzando il protocollo di isolamento fase (fase 2) sia con i media di Grace o IVEM. NOTA: È necessario determinare empiricamente quanti di un particolare follicolo fase sono necessarie per osservare ogni specifica proteina. Per le proteine ​​altamente espresse 1-3 S10B follicoli / e è sufficiente per vedere un segnale forte su una macchia occidentale. Tuttavia, è importante fare unacampione rappresentativo, tenendo follicoli da più femmine. Così, 15-20 follicoli di una fase particolare sono di solito raccolti. </li><li> Spostare follicoli, usando una pipetta di vetro, una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Spin brevemente in un mini-microcentrifuga per far sedimentare i follicoli (vedi punto 5.4). Rimuovere con attenzione tutti i media utilizzando una pipetta di vetro tirato (vedi punto 3.4) e aggiungere 50 ml di PBS 1x e 50 ml di tampone 2x Laemmli. </li><li> Macinare a mano per ~ 20 sec con un pestello in plastica. NOTA: pestelli di plastica possono essere riutilizzati per la macinazione di campioni occidentali con il lavaggio e la sterilizzazione in autoclave. </li><li> Bollire i campioni per 10 minuti nel blocco termico. </li><li> Raffreddare brevemente su ghiaccio e far girare a piena velocità per 15 secondi in una microcentrifuga. O caricare immediatamente su un gel SDS-PAGE o conservare a -20 ° C. NOTA: Se vengono memorizzati i campioni, ricordatevi di reboil i campioni prima di caricare sul gel. </li><li> Eseguire l&#39;analisi Western Blot seguenti protocolli standard. </li></ol>

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</ol>

Non c&#39;è nulla da rivelare.

Il follicolo Drosophila è composto da un piccolo numero di tipi cellulari, rendendolo ideale sia morfologica e analisi molecolari. Inoltre, a causa della struttura dell&#39;ovaio, è relativamente facile ottenere un gran numero di stadi specifici dello sviluppo del follicolo con un ambito dissezione comune e una formazione minima. Come ogni tappa rappresenta una breve finestra temporale, isolamento stadio può offrire notevoli spunti molecolari nei processi di sviluppo che si verificano durante tale fase. Ad esem...

Ogni ovaio Drosophila è composto di ~ 16 ovarioli, o catene di sequenza maturazione camere di uova o follicoli. Ogni follicolo è costituito da un unico ovocita, derivate cellule nutrici o di sostegno 15 della linea germinale, e ~ 650 cellule somatiche chiamati cellule follicolari (Figura 1A). Drosophila oogenesi è diviso in 14 tappe morfologicamente definiti di sviluppo 1. Ogni stadio di sviluppo follicolare è osservato più volte all&#39;interno di una singola mosca, rendendo relativamente facile isolare un consistente numero di follicoli stadio-specifica. Medio-tardiva Le tappe di dell&#39;ovogenesi (Tappe 10B-14) sono particolarmente adatti per l&#39;isolamento stadio (Figura 1). Nella Fase 10B (S10B), il follicolo è completamente allungata (cioè la sua lunghezza è pari a quella di uno Stage 14 (S14) follicolo, vedi Figura 1 e Figura 2H) e metà della lunghezza del follicolo è composto da cellule infermierementre l&#39;altra metà è l&#39;ovocita (Figura 1C). In questa fase le cellule nutrici subiscono drammatico rimodellamento actina, il rafforzamento del actina corticale e la generazione di fasci paralleli di filamenti di actina 2. Allo stesso tempo, una popolazione di cellule del follicolo, chiamato cellule centripete, migrare tra le cellule infermiere e l&#39;ovocita, e due gruppi di cellule follicolari dorsali diventa specificato sottoporsi migrazione per formare le appendici dorsali, apparecchi respiratori tubolari per l&#39;embrione 3 . Le cellule nutrici poi contrattuali (S11), spremere il loro contenuto citoplasmatico nell&#39;ovocita in un processo chiamato cella di infermiere dumping, che fornisce l&#39;ovocita con i fattori necessari per poter completare l&#39;embriogenesi (Figura 1D). Le cellule vengono poi sottoposte infermiere morte cellulare (S12-S13) 4, e le cellule follicolari secernono e modello del guscio 5 (Figure 1E-G). Così, alla fine dell&#39;oogenesi è ricca di un importante sviluppod processi morfogenetici. Isolato follicoli medio-fase recente (S10B-S14) possono essere utilizzati per una varietà di scopi, comprese le analisi molecolari. Ad esempio, mRNA da follicoli in scena può essere isolato per RT-PCR, microarray, o analisi RNA-seq. Questo permette di guardare l&#39;espressione genica in un breve lasso di sviluppo, con solo pochi tipi di cellule presenti, e determinare come l&#39;espressione genica è cambiato da perturbazioni sia farmacologici o genetici. Isolamento fase può anche essere usato per guardare proteine ​​mediante western blotting. Tale analisi è importante perché permette di quantificare il livello di espressione della proteina in wild-type contro mutanti nelle fasi specifiche. Sebbene si possa usare immunofluorescenza analisi per ottenere risultati simili, quantificazione della fluorescenza è meno robusta a causa dei requisiti rigorosi che tutti i pixel essere compresa nell&#39;intervallo lineare di rilevamento 6. Inoltre, l&#39;analisi western blot può fornire altre informazioni, ad uns se la proteina viene posttranslationally modificato o è espressa da una specifica isoforma di splicing. Isolato fasi possono anche essere usati per ulteriore purificazione della proteina, compreso frazionamento subcellulare o coimmunoprecipitation. Specifica fase di isolamento follicolo può essere utilizzato anche per saggi in vitro per lo sviluppo 7 e dal vivo-imaging 8. Isolato follicoli S10B-S13 continuerà a sviluppare per S14 in semplice terreni di coltura (vedi sotto). È importante notare che i follicoli S10A non progredire attraverso cella infermiera scarico utilizzando le condizioni di coltura discusse in questo manoscritto. Abbiamo usato S10B vitro di sviluppo nel definire il ruolo delle prostaglandine, sia farmacologicamente e geneticamente, nella regolazione actina rimodellamento utilizzando cellule infermiere dumping e di sviluppo che il read-out 7,9. Analogamente, le successive fasi di sviluppo possono essere isolati per determinare gli effetti dei trattamenti farmacologici o uomo geneticaipulations su particolari processi come la migrazione centripeta delle cellule, la migrazione appendice dorsale / 10 la formazione, e la morte cellulare infermiere. Tali saggi possono essere utilizzati per eseguire le schermate di interazione dominanti o saggi, ad esempio, mentre eterozigosi per mutazioni nel pxt o fascina da soli non hanno alcun effetto sulla S10B sviluppo in vitro, follicoli dei doppi eterozigoti cella infermiera mostra il dumping difetti e un blocco nello sviluppo 9. Inoltre, poiché S10B-13 può svilupparsi nella cultura, tutti i processi che si verificano durante questo periodo può essere osservato da live-imaging. Tale rappresentazione può essere eseguita semplicemente utilizzando luce trasmessa (se si è interessati solo a cambiamenti lordi in morfologia) o con la microscopia confocale utilizzando mosche transgeniche esprimenti sonde fluorescenti o follicoli colorati con coloranti di imaging dal vivo. L&#39;imaging dal vivo viene utilizzato per far avanzare notevolmente la nostra comprensione dei processi di sviluppo. Infatti, vivere imaging di follicoli in fase avanzata ha ampliato la conoscenza della migrazione appendice dorsale, un esempio di tubulogenesi 10. Ci aspettiamo che l&#39;imaging dal vivo di ulteriori processi tardivamente, comprese le dinamiche di actina durante la cella infermiere di dumping, fornirà nuove intuizioni in questi eventi evolutivi. E &#39;importante notare che mentre S10A e prime fasi di sviluppo del follicolo non continueranno a svilupparsi in un S14 in cultura, live-imaging di eventi che si verificano durante queste fasi di sviluppo è possibile utilizzando condizioni di coltura alternativi 11-14 (vedi la discussione per ulteriori informazioni). Qui forniamo protocolli dettagliati per isolare i follicoli in fase avanzata sia per lo sviluppo in vitro e viviamo-imaging, o analisi molecolari (mRNA e isolamento proteine).

<table><tbody><tr><td>Lievito secco attivo</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td>Qualsiasi fonte di lievito secco attivo va bene</td></tr><tr><td>Grace' s Insect Media</td><td>Lonza</td><td>04-457F</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino inattivato al calore</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050H</td><td>Qualsiasi FBS inattivato al calore dovrebbe funzionare</td></tr><tr><td>10x Pen/Strep</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pin Morse e aghi</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13561-10</td><td></td></tr><tr><td>Piastra spot, Nine Well</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>#5 Pinze Dumont</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>24 piastre multipozzetto</td><td>Becton Dickinson</td><td>35 3226</td><td>Qualsiasi piatto per coltura tissutale a 24 pozzetti dovrebbe funzionare</td></tr><tr><td>Piatti inferiori per vetrino coprioggetti (35 mm)</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td>Lo spessore del vetrino coprioggetti dipenderà dal microscopio/ Pipette</td></tr> in <tr><td>vetro</td><td>Corning</td><td>7095B-5x (per il trasferimento dei follicoli)</td><td></td></tr><tr><td>Pipette in vetro - lunghe</td><td>Corning</td><td>7095B-9 (per la produzione di pipette estratte)</td><td></td></tr><tr><td>Pestello per campioni (1,5 &mu; l; Senza RNasi/DNasi)</td><td>Research Products International</td><td>199228</td><td>Qualsiasi pestello di plastica che si adatta a 1,5 &mu; l si possono utilizzare tubi microfuge</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;utilità della fase-specifici medio-tardiva<em&gt; drosophila</em&gt; follicolo isolamento

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila oogenesi o lo sviluppo del follicolo è stato ampiamente utilizzato per far progredire la comprensione dei complessi processi biologici di sviluppo e cellulari. Questo documento descrive i metodi come isolare medio-tardiva follicoli fase (fase 10B-14) e di utilizzarle per fornire nuove intuizioni gli eventi molecolari e morfologiche che si verificano durante le finestre strette di tempo di sviluppo. Isolato follicoli possono essere utilizzati per una varietà di tecniche sperimentali, inclusi vitro nello sviluppo, l&#39;imaging dal vivo, analisi di espressione di mRNA e analisi western blot di proteine. Follicoli dello Stage 10B (S10B) o poi completare lo sviluppo in coltura, questo permette di coniugare perturbazioni genetiche o farmacologiche con lo sviluppo in vitro per definire gli effetti di tali manipolazioni sui processi che si verificano durante periodi specifici dello sviluppo. Inoltre, poiché questi follicoli si sviluppano nella cultura, sono l&#39;ideale per gli studi di imaging dal vivo, Che spesso rivelare nuovi meccanismi che mediano eventi morfologici. Isolato follicoli possono essere utilizzati anche per analisi molecolari. Per esempio, cambiamenti nell&#39;espressione genica che derivano da perturbazioni genetiche possono essere definiti per specifiche finestre di sviluppo. Inoltre, livello di proteine, stabilità, e / o stato modificazione post-traslazionale durante una particolare fase di sviluppo del follicolo possono essere esaminati mediante analisi Western blot. Pertanto, l&#39;isolamento specifico stadio di follicoli Drosophila fornisce una ricca fonte di informazioni in processi ampiamente conservate di sviluppo e morfogenesi.

Quando si isola specifici stadi di sviluppo del follicolo Drosophila è essenziale essere in grado di distinguere con precisione le diverse fasi morfologiche. Questo è piuttosto impegnativa per S10A e S10B, come le cellule infermiere e l&#39;ovocita ognuna metà della lunghezza del follicolo in queste fasi (Figura 1B rispetto a 1C). Tuttavia, follicoli S10A sono più corta follicoli S10B, come i follicoli S10B sono completamente allungati e quindi di lunghezza pari ad un follicolo...

Stadio-specifica isolamento di medio-tardiva follicoli Drosophila è utile per una varietà di scopi. Tali follicoli si sviluppano nella cultura, che permette di manipolazioni genetiche e / o farmacologici per essere accoppiato con saggi in vitro di sviluppo e immagini dal vivo. Inoltre, follicoli possono essere usate per studi molecolari, come isolare mRNA e proteine.

L&#39;utilità della fase-specifici medio-tardiva<em&gt; Drosophila</em&gt; Follicolo isolamento

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare stadi specifici dei follicoli da maturi a tardi di oph per una varietà di esperimenti, inclusi analisi molecolari, imaging in tempo reale e saggi di sviluppo in vitro. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando le ovaie e successivamente separando le ovaie in ols. Una volta isolati i follicoli di stadio specifico, questi possono essere utilizzati per analisi molecolari, imaging in tempo reale o sviluppo in vitro.In definitiva, i risultati possono mostrare quali aspetti dell'ovogenesi tardiva nei drosophila sono regolati da specifici fattori attraverso manipolazioni farmacologiche e genetiche combinate a questi saggi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nei campi dello sviluppo e della biologia cellulare, come l'actina, la dinamica del citoscheletro, i processi morfologici, la genesi tubulare e la secrezione e il patterning della matrice extracellulare. Per questo protocollo, raccogliere moscerini adulti giovani ben nutriti di entrambi i sessi due giorni prima dell'isolamento dei follicoli.Se i follicoli in stadio verranno utilizzati per lo sviluppo in vitro, avere a disposizione saggio media di Ivan

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Drosophila melanogaster testicoli possono essere rapidamente ed efficacemente isolato da maschi adulti con aghi dissezione. Con la pratica, si può facilmente isolare in uno o due giorni una quantità di testicoli sufficiente per l'analisi del DNA o RNA mediante sequenziamento throughput elevato o più tradizionali metodi di biologia molecolare o di proteine ​​per i test degli anticorpi-o a base di enzimi.

Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli

Questo video descrive un metodo per rimuovere meccanicamente le membrane corion e vitellina da ovociti maturi di Drosophila precedentemente fissati. Il protocollo presentato mostra una dimostrazione dettagliata della procedura che produce ovociti compatibili con i saggi di ibridazione fluorescente in situ.

Rimozione meccanica della membrana di Corion e Vitellina: un metodo per preparare gli ovociti di Drosophila per l'osservazione diretta

Tessuti Drosophila spesso contengono una miscela eterogenea di tipi cellulari. Per esaminare l'espressione genica in specifici tipi cellulari da un particolare tessuto, i nuclei possono essere geneticamente marcato e successivamente isolate utilizzando un approccio basato affinità. Isolato nuclei possono essere utilizzate per applicazioni a valle come l'analisi dell'espressione genica e della cromatina.

L&#39;isolamento a base di affinità di Tagged Nuclei di<em&gt; Drosophila</em&gt; tessuti per Gene Expression Analysis

L'immunocolorazione è una tecnica efficace per visualizzare specifici tipi di cellule e proteine all'interno dei tessuti. Utilizzando la sonicazione, il protocollo qui descritto allevia la necessità di sezionare i tessuti di Drosophila melanogaster da embrioni e larve in fase avanzata prima dell'immunocolorazione. Forniamo una metodologia efficiente per l'immunocolorazione di larve intere di montatura fissate con formaldeide.

Sonicazione-facilitato immunofluorescenza colorazione di ritardo-fase embrionale e larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Tessuti<em&gt; In Situ</em

Questo protocollo descrive la dissezione e la coltivazione di testicoli intatti e cisti germinali da pupe di Drosophila melanogaster. Questo metodo consente l'osservazione microscopica della spermatogenesi ex vivo. Inoltre, descriviamo un saggio farmacologico dell'effetto degli inibitori su specifici stadi dello sviluppo delle cellule germinali nei testicoli delle pupe.

Ex vivo Cultura della Drosophila pupa testicolo e singolo maschio cisti germinale: Dissezione, Imaging, e trattamento farmacologico

Il metodo di imaging verticale descritto in questo protocollo consente la visualizzazione dettagliata dei poli di un uovo di Drosophila melanogaster in via di sviluppo.  Questa visione finale fornisce una nuova prospettiva sulle disposizioni e le morfologie di più tipi di cellule nell'epitelio follicolare.

Imaging Upright di<em&gt; Drosophila</em&gt; Chambers Egg

Presentiamo protocolli per la raccolta, la preparazione e l'imaging di ovociti maturi di Drosophila. Questi metodi consentono la visualizzazione del comportamento cromosomico e dell'assemblaggio e della funzione del fuso durante la meiosi.

Tecniche di Imaging Prometafase e metafase della meiosi I nel fisso<em&gt; Drosophila</em&gt; ovociti

L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un approccio semplice e poco costoso per la raccolta di embrioni di Drosophila a media scala (0,5-1 g) e la preparazione di estratti proteici che possono essere utilizzati nelle applicazioni proteomiche a valle, come la spettrometria di massa di purificazione-affinità (AP-MS ).

Preparazione su media scala di<em&gt; Drosophila</em&gt; Estratti di embrioni per esperimenti proteomici

Qui, presentiamo un protocollo per dissociare e ordinare una popolazione cellulare specifica dalle ghiandole accessorie maschili della Drosophila (cellule secondarie) per il sequenziamento dell'RNA e RT-qPCR. L'isolamento cellulare si realizza attraverso la purificazione FACS delle cellule secondarie che esprime GFP dopo un processo di dissociazione multifase che richiede dissezione, proteasi di gestione e dispersione meccanica.

Un protocollo basato su FACS per isolare l'RNA dalle cellule secondarie delle ghiandole accessorie maschili della Drosophila

Qui, forniamo un protocollo di dissezione necessario per l'immagine dal vivo della gonade maschio drosophila embrionale tardiva . Questo protocollo consentirà l'osservazione di processi cellulari dinamici in condizioni normali o dopo manipolazione transgenica o farmacologica.

Dissezione e Live-Imaging della Drosophila Gonad embrionale tardiva

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per eseguire l'imaging dal vivo della divisione asimmetrica delle cellule staminali germinali (GSC) nella nicchia ovarica di Drosophila. Utilizziamo una linea transgenica che esprime ubiquitariamente una fusione di proteina fluorescente verde (GFP) della proteina spettrosoma Par-1.

Imaging dal vivo esteso di nicchie di cellule staminali germinali femmina di Drosophila melanogaster

Impara a isolare follicoli di Drosophila a stadio medio-tardivo per analisi molecolari, imaging in vivo e saggi di sviluppo in vitro. Questo metodo consente di studiare l'oogenesi e la biologia dello sviluppo.

L'utilità della fase-specifici medio-tardiva

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