Un metodo sensibile per quantificare le cellule tumorali senescenti
2 agosto 2013
Sia senescenza impedisce o promuove la tumorigenesi rimane controverso. Poiché i farmaci chemioterapici possono indurre le cellule tumorali a senesce, studiando la senescenza è essenziale per proporre nuove terapie. Tuttavia, il dosaggio standard di β-galattosidasi e ampiamente utilizzato presenta gravi inconvenienti. Proponiamo qui un saggio di citometria di flusso basato rapido e sensibile per quantificare senescenza.
L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare la senescenza cellulare in modo rapido e sensibile. Qui dimostriamo l'utilità di questo metodo nella selezione di potenziali farmaci chemioterapici. Prima, indurre la senescenza cellulare.
Il farmaco chemioterapico doxorubicina viene aggiunto alle cellule tumorali. Successivamente Bain A uno viene applicato per neutralizzare il pH acido dei lisosomi cellulari. Quindi il substrato beta galatto permeabile per le cellule C 12 FDG viene aggiunto dopo l'assorbimento cellulare.
Il C 12 FDG viene idrolizzato e fluoresce. Poiché la beta-GCSE è arricchita nei lisosomi delle cellule senescenti, queste diventano più fluorescenti rispetto alle cellule non senescenti. Per quantificare la differenza di fluorescenza, le cellule vengono analizzate mediante citometria a flusso; l'analisi dei dati ottenuti consente di determinare la percentuale di cellule tumorali senescenti in diverse condizioni di trattamento.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il test della beta-galattosidasi, consiste nel facilitare una quantificazione rapida e sensibile delle cellule senescenti. In effetti, abbiamo concepito l'idea per questo metodo quando abbiamo riscontrato difficoltà nella quantificazione delle cellule senescenti utilizzando il comune test della beta-galattosidasi. Sebbene utilizziamo questa tecnica per rilevare la senescenza in cellule tumorali, essa può essere impiegata anche su cellule normali.
Questo metodo può aiutare a rispondere rapidamente a domande nel campo dell'oncologia, ad esempio se un farmaco chemioterapico ha indotto le cellule tumorali a sse, fenomeno che potrebbe favorire la malignità. Pertanto, questa tecnica potrebbe in ultima analisi contribuire a indicare nuovi trattamenti terapeutici per il cancro. In una cappa chimica, sciogliere la polvere di C 12 FDG in DMSO fino a una concentrazione finale di 20 millimolare, suddividere in aliquote da 0,5 millilitri in provette einor e conservare a meno 80 gradi Celsius.
Il DMSO deve essere utilizzato con adeguate condizioni di sicurezza e sciogliere anche il composto CIN A in polvere nel DMSO fino a una concentrazione finale di 0,1 millimolare. Aliquotare la soluzione in provette microcentrifuga da 0,5 millilitri e conservarle a meno 20 gradi Celsius.
Attenzione: il CIN deve essere utilizzato con adeguate precauzioni di sicurezza. Questa procedura può essere eseguita sia con cellule aderenti che non aderenti. Qui la procedura viene dimostrata utilizzando la linea cellulare di mieloma umano RPMI 8 2 2 6.
Queste cellule crescono in sospensione; coltivare le cellule RPMI 8 2 2 6 in un mezzo contenente il 10% di FBS e l'1% di antibiotici a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 24 ore prima di eseguire l'esperimento. Seminare le cellule in piastre a sei pozzetti in modo che si trovino nella fase logaritmica della curva di proliferazione cellulare. Al momento dell'esperimento per determinare la percentuale di cellule senescenti, saranno necessari tre campioni cellulari: cellule non trattate e non colorate con ST, cellule non trattate colorate con C 12 FDG e cellule trattate colorate con C 12 FDG.
Per ogni condizione, sono richieste almeno cinque volte 10 alla quinta cellule per la citometria a flusso indotta da senescenza in cellule tumorali. Aggiungendo il farmaco chemioterapico doxorubicina, la concentrazione del farmaco e la durata del trattamento devono essere adattate al tipo di cellula. Testato per cellule rpmi 8 2 2 6.
La senescenza può essere indotta trattando un decimo delle sei cellule per millilitro con 15 nanomolar doxorubicin per 48 ore. Non dimenticare di includere un campione non trattato come controllo negativo, incubando a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il trattamento con farmaci chemioterapici può portare all'apoptosi cellulare.
Pertanto, dopo due giorni, verificare la vitalità cellulare mediante esclusione del blu di trian utilizzando un emo, citometro e un microscopio. Se la percentuale di vitalità è inferiore al 70%, rimuovere le cellule morte utilizzando un kit appropriato, come il kit per la rimozione delle cellule morte di Milton E, per garantire che le cellule morte non influenzino l'analisi successiva. In caso contrario, rimuovere il mezzo di coltura centrifugando le cellule a 300 ×g per cinque minuti.
Quindi, dopo aver rimosso il soprannatante, aggiungere mezzo di coltura fresco preriscaldato contenente 100 anom o cin, in rapporto di uno a uno, per neutralizzare il pH acido dei lisosomi e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Sciogliere il substrato beta-galacto C12 FDG in mezzo di coltura fresco preriscaldato a una concentrazione finale di due millimolari. Dopo l'incubazione con beil micina.
Aggiungere direttamente C 12 FDG alle cellule e al mezzo fino a una concentrazione finale di 33 micromolari; incubare per due ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, centrifugare le cellule a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione, lavare le cellule due volte con PBS, centrifugando ogni volta come in precedenza ed eliminando il sopranatante dopo il secondo lavaggio. Risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di PBS freddo, quindi eseguire un'etichettatura co-immunologica per caratterizzare ulteriormente la popolazione di cellule senescenti. Se non si ha esperienza con la citometria a flusso, l'aspetto più difficile di questa procedura sarà l'analisi mediante citometria a flusso.
Per garantire il successo, assicurarsi di includere i controlli appropriati e di richiedere assistenza da parte di una persona non esperta, se necessario. Prima di eseguire il primo campione, preparare un grafico a due parametri che mostri il canale di scattering anteriore (FSC) rispetto al canale di scattering laterale (SSC). Quindi eseguire il primo campione contenente cellule non marcate.
Impostare i tubi fotomoltiplicatori o PMT e definire una regione di interesse, escludendo le cellule morte e i detriti cellulari che potrebbero essere comparsi durante la preparazione del campione. Questa regione di interesse in un istogramma ad un parametro mostra la fluorescenza di C 12 FDG come FL uno nella scala logaritmica dell'asse x e il numero di eventi sull'asse y. Il numero totale di eventi rappresenta il numero di cellule analizzate.
Impostare il PMT in modo che le cellule non marcate appaiano nella prima decade della scala logaritmica dell'asse x. Determinare l'autofluorescenza delle cellule, se necessario, eseguendo le cellule non marcate nel flusso. Eseguire al citometro a flusso il secondo campione contenente cellule non trattate sull'istogramma a un parametro che visualizza FL; posizionare il cursore dopo la popolazione debolmente marcata.
Questa soglia consentirà la discriminazione tra cellule non senescenti, che sono debolmente marcate, e cellule senescenti, che sono intensamente marcate. Eseguire il terzo campione contenente le cellule trattate. Le cellule senescenti intensamente marcate appaiono al di sopra della soglia determinata nel passaggio precedente.
Valutare la percentuale di cellule senescenti dividendo il numero di eventi luminosi per il numero totale di eventi, se necessario. L'attività della beta-galattosidasi può essere stimata anche mediante l'intensità media della fluorescenza per valutare la senescenza indotta da una procedura chemioterapica. La linea cellulare commerciale di mieloma multiplo RPMI 8226 è stata trattata per due giorni con doxorubicina, un farmaco chemioterapico, e sottoposta a saggio per la senescenza come descritto in questo video; questi istogrammi mostrano la fluorescenza delle cellule non trattate a sinistra e delle cellule trattate a destra.
Una popolazione di cellule fortemente marcate, rappresentanti cellule senescenti, appare nella regione V. Parallelamente, lo stesso campione cellulare è stato colorato mediante il saggio beta-galactosidasi. In questa immagine rappresentativa, cellule interamente blu e cellule parzialmente blu sono mostrate per illustrare la difficoltà nel distinguere con certezza le cellule senescenti realmente blu. Per illustrare la specificità del C12FDG nella determinazione della percentuale di cellule senescenti, le cellule sono state trattate anche con diverse concentrazioni di doxorubicina.
La percentuale di cellule senescenti è stata determinata dividendo il numero di eventi luminosi per il numero totale di eventi; le percentuali di cellule senescenti sono state rispettivamente dello 0,8%, 15,78% e 26,31% per una dose di 5, 25 e 50 nanomolar di doxorubicina. Ciò dimostra che la marcatura con C 12 FTG è specifica per le cellule senescenti.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare le cellule senescenti in serie o meno mediante citometria a flusso seguendo questo procedimento; metodi come l'etichettatura immunoistochimica possono essere eseguiti per caratterizzare le cellule senescenti. Non dimenticare che lavorare con DMSO o cellule tumorali può essere estremamente pericoloso. Si devono sempre adottare precauzioni durante l'esecuzione di questa procedura.
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Panoramica
Questo studio presenta un saggio rapido e sensibile basato sulla citometria a flusso per quantificare la senescenza cellulare, superando i limiti del saggio standard di β-galattosidasi. Il metodo è dimostrato utilizzando il farmaco chemioterapico doxorubicina per indurre la senescenza in cellule tumorali.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biologia cellulare
- Ricerca sul cancro
- Farmacologia
Sfondo
- Il ruolo della senescenza nella tumorigenesi è dibattuto.
- I farmaci chemioterapici possono indurre la senescenza nelle cellule tumorali.
- Gli attuali saggi per la misurazione della senescenza presentano svantaggi significativi.
- La citometria a flusso offre una possibile soluzione per una quantificazione più accurata.
Scopo dello studio
- Sviluppare un nuovo saggio per la quantificazione della senescenza cellulare.
- Valutare l'efficacia dei farmaci chemioterapici nell'indurre senescenza.
- Fornire un'alternativa più sensibile e rapida ai metodi esistenti.
Metodi Utilizzati
- Induzione della senescenza cellulare mediante doxorubicina.
- Neutralizzazione del pH acido nei lisosomi cellulari con Bain A.
- Utilizzo del substrato beta-galacto C12 FDG per la misurazione dell'assorbimento cellulare.
- Citometria a flusso per la quantificazione della senescenza.
Risultati principali
- Il nuovo saggio quantifica efficacemente la senescenza nelle cellule tumorali.
- La doxorubicina induce con successo la senescenza, come dimostrato nello studio.
- La citometria a flusso fornisce risultati rapidi e sensibili rispetto ai metodi tradizionali.
- Il metodo può essere applicato per analizzare altri possibili agenti chemioterapici.
Conclusioni
- L'assay basato sulla citometria a flusso è uno strumento promettente per lo studio della senescenza.
- Questo metodo potrebbe migliorare lo sviluppo di nuove terapie contro il cancro.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per esplorarne l'applicazione in diversi contesti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La quantificazione delle cellule tumorali senescenti è fondamentale per valutare l'efficacia chemioterapica e comprendere i cambiamenti fenotipici indotti dal trattamento che potrebbero influenzare la progressione del tumore o la resistenza terapeutica. Questo metodo basato sulla citometria a flusso fornisce un'analisi rapida e sensibile utile per la validazione degli bersagli e la riduzione dei rischi meccanicistici nella scoperta di farmaci oncologici. Permettendo una valutazione ad alto rendimento dell'induzione della senescenza, esso orienta le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo e la priorizzazione del portafoglio nelle fasi precliniche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche quantificando la senescenza come parametro funzionale del meccanismo d'azione dei farmaci chemioterapici.
- Valore operativo: Consente il rapido screening di librerie di composti per identificare agenti in grado di indurre senescenza, con maggiore affidabilità predittiva.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico distinguendo la senescenza dall'apoptosi o dalla proliferazione nelle popolazioni cellulari tumorali trattate.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera dati quantitativi di fluorescenza per stabilire relazioni dose-risposta per composti induttori di senescenza.
- Valore operativo: Fornisce misurazioni riproducibili e ad alta sensibilità, compatibili con piattaforme di citometria a flusso per l'implementazione scalabile del saggio.
- Valore scientifico: Permette il multiplexing con immunomarcatura per correlare la senescenza a specifici marcatori cellulari o vie metaboliche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega l'induzione della senescenza in vitro a potenziali risultati terapeutici in vivo, supportando l'allineamento di biomarcatori traslazionali.
- Valore operativo: Facilita il monitoraggio longitudinale della dinamica della senescenza in diversi periodi di trattamento e regimi di somministrazione.
- Valore scientifico: Permette decisioni di avanzamento corrette per il rischio quantificando la proporzione di cellule senescenti in diverse condizioni terapeutiche.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta in oncologia, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto promettente fino alla valutazione dell'efficacia preclinica, fornendo un'analisi quantitativa della senescenza che contribuisce alla comprensione dei meccanismi d'azione e alla selezione dei composti.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi misurando l'induzione della senescenza come effetto secondario dell'esposizione a chemioterapici.
- Screening: Fornisce output quantitativi pronti per saggi, per valutare librerie di composti in un formato standardizzato e sensibile.
- Analisi: Offre letture basate sulla fluorescenza e calcoli percentuali che permettono il confronto statistico tra diverse condizioni di trattamento.
- Ricerca traslazionale: Collega i dati sulla senescenza cellulare a potenziali esiti terapeutici, sostenendo decisioni basate su biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro di citometria a flusso riutilizzabile, applicabile attraverso diversi modelli di cancro e modalità terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità delle risposte fenotipiche al trattamento.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la capacità produttiva rispetto ai tradizionali saggi di β-galattosidasi, accelerando i tempi di screening.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'identificazione precoce di composti induttori di senescenza, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione dei candidati farmaceutici in base a profili quantificabili di induzione della senescenza, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nell'allestimento della citometria a flusso, nella compensazione e nelle strategie di gating per una quantificazione accurata della fluorescenza.
- È subordinato all'accesso a citofluorimetri dotati di canali di rilevamento della fluorescenza adeguati e di software per l'analisi degli istogrammi.
- Necessita di protocolli standardizzati di preparazione e colorazione delle cellule per garantire la coerenza del saggio tra esperimenti e utilizzatori.
- Richiede l'ottimizzazione della concentrazione del farmaco e del tempo di esposizione per l'induzione della senescenza in diverse linee cellulari tumorali.
- Richiede l'inclusione di controlli di vitalità per escludere cellule apoptotiche o necrotiche che potrebbero alterare le misurazioni della senescenza.
