Un metodo sensibile per quantificare le cellule tumorali senescenti

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare la senescenza cellulare in modo rapido e sensibile. Qui dimostriamo l'utilità di questo metodo nello screening di potenziali farmaci chemioterapici. Primo a indurre la senescenza cellulare.

Il farmaco chemioterapico doxorubicina viene aggiunto alle cellule tumorali. Successivamente, viene applicato il Bain A per neutralizzare il pH acido dei lisosomi cellulari. Quindi il substrato C 12 FDG del permeato cellulare viene aggiunto al momento dell'assorbimento cellulare.

Il C 12 FDG è idrolizzato e fluorescente. Poiché i beta GCSE sono arricchiti nei lisosomi delle cellule senescenti, diventano più fluorescenti delle cellule non senescenti. Per quantificare la differenza di fluorescenza, le cellule vengono analizzate con un citometro a flusso L'analisi dei dati risultanti consente di quantificare la percentuale di cellule tumorali senescenti in diverse condizioni di trattamento.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il beta galattosio, ad esempio, è che facilita la quantificazione rapida e sensibile delle cellule senescenti. In effetti, aggiungiamo per la prima volta l'idea di questo metodo quando incontriamo difficoltà con la quantificazione delle cellule senescenti utilizzando il saggio beta galattosio comunemente usato. Sebbene utilizziamo questa tecnica per rilevare la senescenza sulle cellule tumorali, può essere utilizzata anche sulle cellule normali.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande rapide nel campo del cancro, come ad esempio se un farmaco chemioterapico ha indotto le cellule tumorali a sse, che potrebbero promuovere la malignità. Pertanto, questa tecnica potrebbe in ultima analisi aiutare a notificare nuovi trattamenti terapeutici per il cancro. Lavorando in una cappa chimica, la polvere di C 12 FDG è stata disciolta in DMSO fino a una concentrazione finale di 20 millimolari di aliquota in tubi einor da 0,5 millilitri e conservata a meno 80 gradi Celsius.

Il DMSO deve essere utilizzato con condizioni di sicurezza adeguate, anche dissolversi. CIN A una polvere in DMSO ad una concentrazione finale di 0,1. Millimolare Eloqua la soluzione in provette da microcentrifuga da 0,5 millilitri e conservarle a meno 20 gradi Celsius.

Si noti che il CIN deve essere utilizzato con le opportune precauzioni di sicurezza. Questa procedura può essere eseguita utilizzando cellule aderenti o non aderenti. Qui la procedura è dimostrata utilizzando la linea cellulare di mieloma umano RPMI 8 2 2 6.

Queste cellule crescono in sospensione, coltivano RPMI 8, 2, 2, 6 cellule in terreno contenente il 10% di FBS e l'1% di antibiotici a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica 24 ore prima di eseguire l'esperimento, seminano le cellule in piastre a sei pozzetti in modo che si trovino nella fase logaritmica della curva di proliferazione cellulare. Al momento dell'esperimento per determinare la percentuale di cellule senescenti, saranno necessari tre campioni di cellule. Cellule non trattate e non colorate con ST, cellule non trattate colorate con C 12 FDG e cellule trattate colorate con C 12 FTG.

Per ogni condizione, sono necessarie almeno cinque volte 10 alla quinta cellula per la senescenza indotta dalla citometria a flusso delle cellule tumorali. Aggiungendo il farmaco chemioterapico doxorubicina, la concentrazione del farmaco e la durata del trattamento devono essere adattate al tipo di cellula. Testato per rpmi 8 2 2 6 celle.

La senescenza può essere indotta trattando il decimo delle sei cellule per millilitro con 15 nanomolari di doxorubicina per 48 ore. Non dimenticare di includere il campione non trattato come controllo negativo, incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il trattamento con farmaci chemioterapici può portare all'apoptosi cellulare.

Pertanto, dopo due giorni, verificare la vitalità cellulare mediante esclusione del trian blue utilizzando un emometro, un citometro e un microscopio. Se la percentuale di vitalità è inferiore al 70%, rimuovere le cellule morte utilizzando un kit appropriato come il kit di rimozione delle cellule morte di Milton E per garantire che le cellule morte non distorcano l'analisi successiva. In caso contrario, rimuovere il terreno di coltura facendo girare le cellule a 300 GS per cinque minuti.

Quindi, dopo aver rimosso il surnatante al terreno di coltura fresco preriscaldato contenente 100 anom o cin, uno per neutralizzare il pH acido dei lisosomi incubare per un'ora a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica dissolvere il beta galacto un substrato C 12 FDG in coltura fresca prebellica. Concentrazione da media a finale di due millimolari. Dopo l'incubazione con beil micina.

Aggiungere C 12 FDG direttamente alle cellule e al terreno fino a una concentrazione finale di 33. Incubare i micromolari per due ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule a 300 Gs per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifuga, lavare le cellule due volte con PBS che gira verso il basso ogni volta come prima e rimuove il surnatante dopo il secondo lavaggio. Resus sospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di PBS freddo, quindi eseguire una marcatura co immuno per caratterizzare ulteriormente la popolazione di cellule senescenti. Se non hai esperienza con la citometria a flusso, l'aspetto più difficile di questa procedura sarà eseguire l'analisi della citometria a flusso.

Per garantire il successo, assicurati di includere i controlli appropriati e chiedi assistenza a una persona inesperta, se necessario. Prima di eseguire il primo campione, preparare un grafico a due parametri che mostri il canale di dispersione diretto o FSC rispetto al canale di dispersione laterale SSC. Quindi eseguire il primo campione contenente celle non etichettate.

Impostate i tubi fotomoltiplicatori o PMT e definite una regione di interesse, escludendo le cellule morte e i detriti cellulari che potrebbero essere comparsi durante il cancello di preparazione del campione. Questa regione di interesse è un istogramma a un parametro che mostra la fluorescenza di C 12 FDG come FL uno sulla scala logaritmica dell'asse x e il numero di eventi sull'asse Y. Il numero totale di eventi rappresenta il numero di celle analizzate.

Impostare il PMT in modo che le celle non etichettate appaiano nella prima decade sulla scala logaritmica dell'asse x. Determinare l'autofluorescenza delle cellule, se necessario, facendo scorrere le cellule non marcate nel flusso. Il citometro esegue il secondo campione contenente cellule non trattate sull'istogramma a un parametro che mostra FL e posiziona il cursore dopo la popolazione debolmente etichettata.

Questa soglia consentirà la discriminazione tra le cellule non senescenti, che sono debolmente etichettate, e le cellule senescenti, che sono marcate in modo brillante. Eseguire il terzo campione contenente le cellule trattate. Le cellule senescenti etichettate in modo brillante compaiono al di sopra della soglia determinata nel passaggio precedente.

Valutare la percentuale di cellule senescenti dividendo il numero di eventi luminosi per il numero totale di eventi, se necessario. L'attività della beta galattotasi può anche essere stimata utilizzando l'intensità media della fluorescenza per valutare la senescenza indotta da una procedura chemioterapica. La linea cellulare di mieloma multiplo disponibile in commercio R RRP I 8 2 2 6 è stata trattata per due giorni con doxorubicina, un farmaco chemioterapico e test per la senescenza Come descritto in questo video, questi istogrammi mostrano la fluorescenza delle cellule non trattate a sinistra e delle cellule trattate a destra.

Una popolazione di cellule marcate in modo brillante che rappresentano cellule senescenti appare nella regione V.In parallelamente, lo stesso campione di cellule è stato colorato utilizzando il saggio beta galacto sase. In questa immagine rappresentativa vengono mostrate cellule interamente blu e cellule parzialmente blu per illustrare la difficoltà di distinguere le cellule senescenti veramente blu. Per illustrare la specificità del C 12 FDG nella determinazione della percentuale di cellule senescenti, le cellule sono state trattate anche con varie concentrazioni di doxorubicina.

La percentuale di cellule senescenti è stata determinata dividendo il numero di eventi luminosi. Per il numero totale di eventi, le percentuali di cellule senescenti sono state dello 0,8%, 15,78% e 26,31% per una dose di 5, 25 e 50 doxorubicina nanomolare, rispettivamente. Ciò dimostra che la marcatura C 12 FTG è specifica per le cellule senescenti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare le cellule senescenti possono essere serializzate o meno mediante citometria a flusso seguendo questa procedura di metodi come l'immuno marcatura essere eseguita per caratterizzare le cellule senescenti. Non dimenticare che lavorare con il DMSO o con le cellule tumorali può essere estremamente pericoloso. È necessario prendere sempre precauzioni durante l'esecuzione di questa procedura.