Name: Un metodo sensibile per quantificare le cellule tumorali senescenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Scopri un metodo rapido e sensibile per quantificare le cellule tumorali senescenti mediante citometria a flusso, utilizzando la doxorubicina come agente chemioterapico. Questa tecnica supera i limiti del saggio β-galattosidasi standard.

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Ringraziamo il SF 4206 ICORE (Université de Caen) per l&#39;utilizzo della struttura di citometria. JC ha ricevuto borse di studio post-dottorato dal Conseil de Radioprotezione d&#39;EDF e Conseil Régional della Bassa Normandia. Tali dati erano parte di progetti finanziati dalla Ligue Nationale contre le Cancer - Comités de l&#39;Orne et du Calvados.

1. Preparazione di C12FDG, bafilomicina A1, e Cell Culture <ol><li> Sciogliere la polvere C 12 FDG in dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione finale di 20 mM. Aliquota e conservare a -20 ° C. DMSO deve essere usato con adeguate condizioni di sicurezza. </li><li> Sciogliere la bafilomicina A1 polvere in DMSO ad una concentrazione finale di 0,1 mM. Aliquota e conservare a - 20 ° C. Bafilomicina deve essere usato con adeguate condizioni di sicurezza. </li><li> Coltivare RPMI 8226 linea cellulare, o altre linee cellulari aderenti o meno, in terreni contenenti 10% di siero fetale bovino e antibiotici 1%, a 37 ° C, 5% di CO 2. Stimare il numero di cellule necessarie per l&#39;esperimento. Per registrare un numero sufficiente di eventi durante l&#39;analisi di citometria di flusso, sono richiesti 5 x 10 5 cellule. Per determinare la percentuale di cellule senescenti, sono necessari tre campioni di cellule: campione senza etichetta, cellule non trattate colorate con C 12 FDG, cellule trattate colorate conC 12 FDG. </li><li> Il seme cellule 24 ore prima eseguendo l&#39;esperimento in modo che le cellule sono nel log-fase della curva di proliferazione cellulare. </li></ol> 2. L&#39;induzione di senescenza <ol><li> Indurre la senescenza delle cellule tumorali con l&#39;aggiunta di un farmaco chemioterapico. Concentrazione del farmaco e la durata del trattamento devono essere adattate al tipo di cellula testato. Iniziare con un trattamento di 48 ore alla concentrazione finale di 50 nM doxorubicina per una concentrazione di cellule a circa 10 6 cellule / ml. Non dimenticare di includere campione non trattato (controllo negativo). </li></ol> 3. Bafilomicina A1 Trattamento <ol><li> Controllare vitalità cellulare dalle cellule mescolando con trypan blue (v / v), come il farmaco chemioterapico utilizzato nel passaggio precedente potrebbe portare ad apoptosi. Riempire in una camera di Malassez e contare il numero di cellule blu (cellule morte) e di cellule bianche (cellule viventi). Se la percentuale di vitalità è inferiore al 70%, le cellule morte potrebbero essere removed utilizzando un kit appropriato per garantire che le cellule morte non sarà di preferenza la successiva analisi. </li><li> Rimuovere i terreni di coltura e di sostituire dai terreni di coltura fresca preriscaldata. Trattare le cellule con una concentrazione finale di 100 nM di bafilomicina A1. Bafilomicina A1 è usata per neutralizzare il pH acido dei lisosomi. Incubare per 1 ora a 37 ° C, 5% di CO 2. </li></ol> 4. C 12 FDG colorazione <ol><li> Sciogliere C 12 FDG preriscaldata in terreni di coltura fresco ad una concentrazione finale di 2 mm. </li><li> Aggiungere il composto di cellule ad una concentrazione finale di 33 mM e incubare 2 ore a 37 ° C, 5% di CO 2. Se utilizza cellule non aderenti, centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C (la velocità potrebbe dover essere adattato al tipo cellulare utilizzato), lavare 2x con PBS. Risospendere il pellet di cellule in 500 microlitri di PBS freddo. Se si utilizza cellule aderenti, rimuovere il supporto e lavare 2x con PBS. Raccogliere le cellule aderenti utilizzando una soluzione di tripsina e centrifugarecellule a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C (la velocità potrebbe dover essere adattato al tipo cellulare utilizzato). Risospendere il pellet di cellule in 500 microlitri di PBS freddo. In entrambi i casi, la concentrazione cellulare dovrebbe essere di circa 10 6 cellule / ml. </li><li> Eseguire un co-immunomarcatura per caratterizzare ulteriormente la popolazione di cellule senescenti. </li></ol> 5. Citometria a Flusso Analisi <ol><li> Calibrare il citofluorimetro utilizzando le sfere di controllo raccomandate dal produttore del citometro a flusso. Per tutti i passi, almeno 10 4 eventi devono essere registrati. </li><li> Eseguire il primo campione contenente cellule senza etichetta. Preparare una a due parametri grafico visualizzazione Canale Forward Scatter (FSC) rispetto a canale laterale Scatter (SSC). Impostare i tubi fotomoltiplicatori (PMT) e definire una regione di interesse escludendo le cellule morte e detriti cellulari che potrebbero apparsi durante la preparazione del campione. Cancello questa regione di interesse in un istogramma a un parametro visualizza FL1 sulla scala logaritmicadella asse x ed il numero di eventi nel y. Il numero totale di eventi rappresenta il numero di cellule analizzate. Impostare il PMT in modo che le cellule senza etichetta compaiono nella prima decade su scala log del l&#39;asse x. Determinare l&#39;autofluorescenza delle celle, se necessario. </li><li> Eseguire il secondo campione contenente cellule non trattate. Sul istogramma a un parametro visualizzazione FL1 (fluorescenza di C 12 FDG), posizionare il cursore dopo la popolazione scarsamente etichettati. Questa soglia consente la discriminazione tra cellule non senescenti (cellule scarsamente etichettati) e le cellule senescenti (cellule brillantemente etichettati). </li><li> Esegui il terzo campione contenente cellule trattate. Brillantemente etichettato cellule, cioè le cellule senescenti appaiono sopra la soglia determinata nel passaggio precedente. Valutare la percentuale di cellule senescenti dividendo il numero di eventi luminosi per il numero totale di eventi. Se necessario, l&#39;attività della β-galattosidasi può anche essere stimata utilizzando la fluorescenza mediaintensità. </li></ol>

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+when+bad+things+happen+to+good+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: when bad things happen to good cells.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).</li>
<li>Shay, J. W., Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+senescence+in+carcinogenesis+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy.</a> Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).</li>
<li>Bartkova, J., Rezaei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene-induced+senescence+is+part+of+the+tumorigenesis+barrier+imposed+by+DNA+damage+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints.</a> Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).</li>
<li>Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+and+inflammatory+signaling+limit+the+MLL-ENL-induced+leukemogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo.</a> Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).</li>
<li>Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+fibroblasts+promote+epithelial+cell+growth+and+tumorigenesis%3A+a+link+between+cancer+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).</li>
<li>Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).</li>
<li>Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+senescence+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor cell senescence in cancer treatment.</a> Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).</li>
<li>Dimri, G. P., Lee, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).</li>
<li>Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+%28beta%29-galactosidase+reflects+an+increase+in+lysosomal+mass+during+replicative+ageing+of+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells.</a> Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotype+favors+the+emergence+of+cancer+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells.</a> Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446(2012).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo presentato qui un metodo di citometria a base di flusso per quantificare la senescenza cellulare in cellule tumorali dal vivo. Questo metodo si basa sull&#39;uso del composto membrana permeabile, il C 12 FDG, e può quindi essere utilizzato in qualsiasi tipi cellulari e dopo vari trattamenti finché il composto viene assorbito dalle cellule. Dopo l&#39;assorbimento cellulare, il C 12 FDG viene idrolizzato dalla β-galattosidasi, arricchito nei lisosomi delle cellule senescenti. Dopo eccitazion...

Poiché primi anni Sessanta e la sua scoperta da Hayflick e Moorhead, senescenza rimane una curiosità cellulare 1. Le cellule umane non proliferano indefinitamente e, da senescenza, Hayflick e Moorhead coniato il processo di invecchiamento cellulare. Senescenza è un arresto del ciclo cellulare stabile in cui le cellule rimangono metabolicamente attive in contrapposizione alla morte cellulare. Ad oggi, quattro meccanismi cellulari hanno mostrato di indurre senescenza: telomeri, danno al DNA, cromatina perturbazione, e anormale espressione di oncogeni mitogenico 2. Ciò indica che non solo le cellule normali, ma anche le cellule tumorali sono in grado di sottoporsi a senescenza 3. È un dato di fatto, le cellule di cancro sottoposti senescenza hanno mostrato di costituire una barriera ulteriore progressione tumorale 4-5. Tuttavia, diversi studi hanno ormai evidenziato che, in determinate circostanze, la senescenza cellulare può anche promuovere malignità 6-7. Studiare la senescenza di cancro celLS sta per diventare uno stimolo nella ricerca sul cancro come attualmente utilizzati farmaci chemioterapici possono portare alla senescenza delle cellule tumorali non solo in vitro ma anche in vivo 8. Il saggio maestro di indagare per la presenza di cellule senescenti è il saggio β-galattosidasi a pH acido. Questo saggio istochimico riflette l&#39;aumento nella biogenesi lisosomiale che si verificano nella maggior parte delle cellule senescenti. Brevemente, esogeno X-gal, applicato alle celle, è tagliata da β-galattosidasi arricchito in lisosomi delle cellule senescenti, dando origine ad un colore blu 9. Le cellule senescenti blu possono quindi essere quantificati al microscopio in campo chiaro. Anche se molto popolare, il saggio di β-galattosidasi presenta grossi inconvenienti. Prima, questa prova viene eseguita su cellule fissate. Secondo, è molto tempo perché implica per quantificare il grado di senescenza contando un significativamente elevato numero di cellule senescenti al microscopio. Terzo, questo dosaggionon è sensibile come la discriminazione tra cellule senescenti e non senescenti si basa interamente sul osservatore. Discutiamo qui un, analisi di citometria a base di veloce, sensibile e non sfruttato per valutare la presenza di cellule senescenti dal vivo. Questo saggio è basato sulla idrolisi di una membrana permeabile molecola, il 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galattopiranoside (C 12 FDG), da β-galattosidasi arricchita in cellule senescenti. Dopo idrolisi e eccitazione laser, il C 12 FDG emette fluorescenza verde e può quindi essere rilevata mediante citometria di flusso 10, 11. Il rilevamento di cellule senescenti tramite citofluorimetria offre il grande vantaggio di essere rapido e sensibile. Inoltre, la rilevazione di cellule senescenti mediante citometria di flusso può essere accoppiato con il rilevamento di altri marcatori cellulari. Questo test può essere utilizzato per rilevare le cellule senescenti all&#39;interno di una popolazione di cellule cancerose trattati con chemioterapia e può essere impostato routinariamentesu su sezioni di tessuto, dopo la dissociazione cellulare, in clinica.

<table><tbody><tr><td>5-dodecanoylaminofluorescein di-&#946;-D-galattopiranoside </td><td>Invitrogen</td><td>D-2893</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido </td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomicina A1</td><td>Sigma</td><td>B1793</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicina</td><td>Sandoz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 terreno di coltura cellulare</td><td>Lonza</td><td>BE12-702</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>PAA Laboratories GmBH</td><td>A15 101</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotici</td><td>Gibco</td><td>5290-018</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso</td><td>Gallios Beckman Coulter</td><td>A94291</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo sensibile per quantificare le cellule tumorali senescenti

A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

Le cellule umane non proliferano indefinitamente. Su indicazioni esterne e / o intrinseca, le cellule potrebbero morire o entrare in un arresto del ciclo cellulare stabile chiamato senescenza. Diversi meccanismi cellulari, come accorciamento dei telomeri e anormale espressione di oncogeni mitogeni, hanno dimostrato di causare senescenza. La senescenza non è limitato alle cellule normali, sono state riportate anche le cellule tumorali a senesce. Farmaci chemioterapici hanno dimostrato di indurre la senescenza nelle cellule tumorali. Tuttavia, resta controverso se la senescenza impedisce o promuove la tumorigenesi. Come potrebbe eventualmente essere paziente-specifico, sarà presto necessario un metodo rapido e sensibile per valutare senescenza in cellule di cancro. A tal fine, il saggio β-galattosidasi standard, il metodo attualmente utilizzato, presenta notevoli svantaggi: è tempo e non è sensibile. Proponiamo qui un saggio di citometria a base di flusso per studiare senescenza su Live cellule. Questo saggio offre il vantaggio di essere rapida, sensibile, e può essere accoppiato al immunomarcatura dei diversi marcatori cellulari.

Mieloma multiplo, un tumore ematologico, è stato utilizzato per valutare la senescenza indotta da una procedura di chemioterapici. Per fare così un linea cellulare MM commercialmente disponibile (RPMI 8226) è stato trattato per 2 giorni con doxorubicina, un farmaco chemioterapico. Le cellule sono state poi sottoposte a trattamento bafilomicina A1 e ulteriormente incubati con C 12 FDG. Le cellule sono state analizzate mediante citometria di flusso. Figura 1 illustra le diverse fasi e mostra ch...

Sia senescenza impedisce o promuove la tumorigenesi rimane controverso. Poiché i farmaci chemioterapici possono indurre le cellule tumorali a senesce, studiando la senescenza è essenziale per proporre nuove terapie. Tuttavia, il dosaggio standard di β-galattosidasi e ampiamente utilizzato presenta gravi inconvenienti. Proponiamo qui un saggio di citometria di flusso basato rapido e sensibile per quantificare senescenza.

Un metodo sensibile per quantificare le cellule tumorali senescenti

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic  cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare la senescenza cellulare in modo rapido e sensibile. Qui dimostriamo l'utilità di questo metodo nella selezione di potenziali farmaci chemioterapici. Prima, indurre la senescenza cellulare.Il farmaco chemioterapico doxorubicina viene aggiunto alle cellule tumorali. Successivamente Bain A uno viene applicato per neutralizzare il pH acido dei lisosomi cellulari. Quindi il substrato beta galatto permeabile per le cellule C 12 FDG viene aggiunto dopo l'assorbimento cellulare.Il C 12 FDG viene idrolizzato e fluoresce. Poiché la beta-GCSE è arricchita nei lisosomi delle cellule senescenti, queste diventano più fluorescenti rispetto alle cellule non senescenti. Per quantificare la differenza di fluorescenza, le cellule vengono analizzate mediante citometria a flusso; l'analisi dei dati ottenuti consente di determinare la percentuale di cellule tumorali senescenti in diverse condizioni di trattamento.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il test della beta-galattosidasi, consiste nel facilitare una quantificazione rapida e sensibile delle cellule senescenti. In effetti, abbiamo concepito l'idea pe

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Questo video illustra un test basato sulla citometria a flusso per quantificare le cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia con doppi marcatori di senescenza. La rilevazione e la quantificazione delle cellule senescenti comportano l'utilizzo di un substrato β-galattosidasi. Il substrato viene scisso dalla β-galattosidasi lisosomiale attiva all'interno delle cellule senescenti, producendo un prodotto fluorescente che, in combinazione con granuli di lipofuscina autofluorescenti, marcare...

Quantificazione basata sulla citometria a flusso di cellule tumorali senescenti indotte da terapia

senescenza cellulare, lo stato irreversibile di arresto del ciclo cellulare, può essere indotta da vari stress cellulari. Qui, descriviamo i protocolli per indurre la senescenza e metodi per valutare cellulare marcatori di senescenza.

Le tecniche per indurre e Quantificare cellulare senescenza

Andremo a discutere una serie di protocolli per l'induzione e la convalida della senescenza cellulare in cellule coltivate. Ci concentriamo sui diversi stimoli che inducono la senescenza e descrivere la quantificazione degli indicatori comuni di senescenza-collegata. Forniamo dettagli tecnici usando i fibroblasti come un modello, ma i protocolli possono essere adattati a vari modelli di cellulari.

Induzione e convalida della senescenza cellulare in cellule umane primarie

ROS intracellulari è stato indicato per svolgere un ruolo importante nell'induzione della senescenza cellulare. Qui, descriviamo un test sensibile per quantificare i livelli di ROS durante la senescenza cellulare. Forniamo anche i protocolli per la valutazione del fenotipo secretivo senescenza-collegata, che secondo come riferito contribuisce a varie disfunzioni relative all'età.

Una misura quantitativa di specie reattive dell'ossigeno e senescenza-collegata di fenotipo secretivo in fibroblasti umani normali durante la senescenza indotta da Oncogene

La senescenza cellulare è il fattore chiave nello sviluppo di patologie croniche legate all'età. L'identificazione delle terapie che colpisce le cellule senescenti è promettente per estendere l'invecchiamento sano. Qui, presentiamo un nuovo saggio da vagliare per l'identificazione delle senoterapie sulla base della misurazione dell'attività di senescenza associata a z-Galactosidase in singole cellule.

Saggio di screening basato su SA-Galactosidase per l'identificazione dei farmaci senoterapici

Questo protocollo descrive il flusso di lavoro per l'etichettatura metabolica di cellule senescenti e non in divisione con SILAC pulsato, analisi di spettrometria di massa non mirata e un calcolo semplificato delle emivite proteiche.

Misurazione dei tassi di turnover proteico in cellule coltivate senescenti e non in divisione con etichettatura metabolica e spettrometria di massa

Qui presentiamo un metodo basato sulla citometria a flusso per la visualizzazione e la quantificazione di più marcatori associati alla senescenza in singole cellule.

Imaging simultaneo e rilevamento basato sulla citometria a flusso di marcatori di senescenza fluorescenti multipli in cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia

Viene presentato un protocollo per la quantificazione fluorescente citometrica a flusso di cellule tumorali senescenti indotte da farmaci chemioterapici in colture cellulari o in modelli tumorali murini. Le procedure opzionali includono la co-immunocolorazione, la fissazione del campione per facilitare l'analisi di grandi lotti o punti temporali e l'arricchimento di cellule senescenti vitali mediante selezione citometrica a flusso.

Sonda β-galattosidasi associata alla senescenza fluorescente Far-Red per l'identificazione e l'arricchimento delle cellule tumorali senescenti mediante citometria a flusso

Questo studio valuta gli effetti proliferativi dei fattori del fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP) delle cellule HeLa senescenti su cellule HeLa non senescenti utilizzando tre modelli in vitro con monitoraggio in tempo reale. I vantaggi e i limiti di ciascun metodo sono stati sistematicamente confrontati per comprendere meglio le interazioni cellula-cellula nel cancro.

Valutazione dell'effetto dei fattori SASP sulla proliferazione delle cellule tumorali utilizzando un'analisi comparativa di tre metodologie distinte

Questo protocollo presenta una microscopia confocale a luce riflessa per la rilevazione oggettiva e monocellulare dell'attività beta-galactosidasi associata alla senescenza (SA-β-gal) nella frazione stromale vascolare isolata dal tessuto adiposo umano. Il metodo è compatibile con l'immunocitochimica, incorpora controlli del pH per la valutazione quantitativa e offre inoltre un'alternativa più sensibile e meno soggettiva rispetto alla colorazione convenzionale SA-β-gal.

Rilevamento della senescenza utilizzando luce riflessa nella frazione vascolare stromale adiposa

Questo articolo presenta un protocollo LysoTracker per cellule vive per misurare il rimodellamento lisosomico durante la senescenza nei fibroblasti umani IMR-90.

Profilazione lisosomica con LysoTracker per la valutazione quantitativa della senescenza cellulare nei fibroblasti umani

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Un metodo sensibile per quantificare le cellule tumorali senescenti

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