Name: Esame della Drosophila Larvali tracheali Terminal cellule al microscopio ottico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Impara a fissare rapidamente larve di Drosophila intatte per analizzare al microscopio ottico la morfologia delle cellule terminali tracheali marcate con GFP. Questo metodo consente di distinguere fenotipi cellulari wild type e mutanti.

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Ringraziamo Gillian Stanfield per i commenti sul manoscritto. TAJ è sostenuto dalla University of Utah Genetica formazione di Grant T32-GM007464 dal NIH NIGMS.

1. Generazione Mosaico <ol><li> Genetic Croce w FRT 19A vasca: Gal80 FLP 122 / Y; Btl-GAL4, UAS-GFP (maschi) X * FRT 19A / Bal (femmine), dove * rappresenta il mutante da esaminare. Nota: Impostare attraversare almeno un giorno prima dell&#39;esperimento, in quanto ciò permette animali di accoppiarsi in modo appropriato. </li><li> Pre-lay: croce Trasferimento a fiale volare-alimentari con una piccola macchia di pasta di lievito di birra fresco collocato sul supporto. Lasciare posare per 1 ora a 25 ° C. </li><li> Lay: animali trasferimento dal pre-lay fiala per una fiala fresco con una piccola macchia di pasta di lievito fresco. Lasciare posare per 6 ore a 25 ° C. </li><li> Adulti trasferimento al pre-laici fiala per la conservazione e l&#39;uso in esperimenti successivi. Scossa raffreddano immediatamente il flaconcino contenente lay 0-6 hr vecchi embrioni per 45 min a 38 ° C, in un bagno di acqua circolante. Nota: La superficie del cibo dovrebbe essere sotto il livello dell&#39;acqua per verificare tutteembrioni sono opportunamente calore scioccato. </li><li> Incubare calore fiale scioccato a 25 ° C per 4-5 giorni fino al terzo stadio le larve iniziano a vagare. </li></ol> 2. Screen per Mosaico Animali <ol><li> Utilizzando una pinza sottile raccogliere delicatamente errante larve terzo instar dai lati del flaconcino e metterli in refrigerati 100% glicerolo in un piccolo piatto di plastica. </li><li> Esaminare le larve utilizzando un microscopio ad alto ingrandimento-dissezione dotato di ottica a fluorescenza. Identificare le larve con espressione mosaico di cellule tracheali fluorescente. Tipicamente, questo può essere fatto a 10-20X ingrandimenti. </li></ol> 3. Fissazione di calore <ol><li> Utilizzando una pinza sottile accuratamente raccogliere animali mosaico fuori del piatto e posto in una goccia di fresco 100% di glicerolo su un mm bianco vetro vetrino da microscopio 75x25x1. Nota: animali multipli possono essere inseriti nei menu (Figura 1A). Animali possono anche essere posizionate in una goccia di glicerolo direttamente su un vetrino,ma bisogna fare attenzione durante la fissazione (passo 3.2), come gli animali si riscalda molto rapidamente e possono diventare eccessivamente fisso. </li><li> Posto vetrino sul vetro 70 ° C con blocco termico finché gli animali solo fermarsi movimento, non più di 20 sec per una diapositiva, e 10 sec per un vetrino (Figura 1B). Animali volontà guizzo inizialmente ma fermarsi e diventare rigido e allungato una volta morto. Nota: l&#39;esposizione a fonti di calore troppo lungo per evitare di danneggiare rami terminali e lumen, così come rendere il segnale GFP fioca e diffusa. Per un&#39;efficienza ottimale si raccomanda di avere il blocco di calore nella stessa stanza come i microscopi. </li><li> Utilizzando una pinza sottile accuratamente orientare tutte le larve nei menu in una sola direzione, in modo tale che tutte le larve sul vetrino sono orientate parallelamente tra loro (Figura 1C). </li><li> Posizionare delicatamente un micro vetro di copertura 18x18mm su di larve (o invertire il vetrino su un vetrino) ed evitare formazione di bolle (Figura 1D). Nota: coprioggetto non può trovarsi esattamentepiatta su larve, questo non è un problema. </li><li> Larve di immagine entro 30 min. Cellule terminali fissi di calore si degrada e segnale GFP diventerà molto diffuso. </li></ol> 4. Nel Imaging in vivo di cellule terminali tracheali <ol><li> Porre il vetrino sul palco di uno stereomicroscopio composto. Con obiettivo 5X individuare i due tronchi dorsali paralleli da anteriore a posteriore sulla superficie dorsale dell&#39;animale (Figura 1F). Individuare le due cellule terminali dorsali, direttamente tra i due tronchi dorsali. Ciò consente di identificare il segmento appropriato per l&#39;analisi. </li><li> Una volta orientato, ruotare gli animali di immagine cellule terminali desiderati. Per fare questo, spingere con attenzione il vetrino sul bordo con le pinze perpendicolari all&#39;asse lungo delle larve, lentamente rotolare le larve sotto il vetrino (figure 1E e 1G). </li><li> Selezione delle cellule terminali appropriati è fondamentale per ottenere risultati coerentie confronti tra mutanti. (FB) cellule terminali La filiale di grasso corporeo si trovano facilmente adiacente al tronco dorsale, laterale alla linea mediana. Il gruppo G cellule terminali laterali (LG) sono facilmente reperibili e si trovano appena laterale della linea mediana ventrale (Figura 1H). Nota: nelle (TR10) segmenti più anteriore (Tr1) e posteriore la disposizione delle cellule terminale è divergente da altri segmenti. Analizziamo solo cellule terminali in segmenti Tr2-TR9. Cellule terminali dorsali hanno un modello di ramificazione più stereotipati di altre cellule terminali tracheali. Questo può dipendere da ulteriori segnali autonomi non-cellule, e questo dovrebbe essere considerato al momento di decidere se includerli nell&#39;analisi. </li><li> Una volta che una cellula terminale di interesse è stato identificato, acquisire un&#39;immagine utilizzando l&#39;ingrandimento desiderato, in genere 10X o 20X è meglio (Figura 2A). Nota: a causa di modelli di ramificazione variabile, cerca di catturare le immagini che includono come molti rami e suggerimenti filiali possibile. </li><li> Senza spostare il palco, spegnere la fluorescenza e accendere la luce trasmessa per catturare un&#39;immagine brightfield della stessa cella e il piano focale (Figura 2B). Il lume sarà visualizzato come scuro contrastante all&#39;interno dello spazio cellula terminale. Se la pianificazione di quantificare rami terminali cellulari e lumen, raccogliere più immagini in più piani focali di ogni cellula terminale. </li></ol> 5. Analisi e quantificazione dei Terminal cellulare Morfologia Utilizzando ImageJ <ol><li> Aprire le immagini fluorescenti e campo chiaro utilizzando il ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) plug-in NeuronJ ( <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a> ). </li><li> Utilizzando il &quot;Aggiungi tracciati&quot; strumento, tracciare manualmente i rami e lume l&#39;intera cella terminale. </li><li> Utilizzando il &quot;tracciati Label&quot; strumento, cambia titolo e reColor assegnare ogni riga all&#39;interno della traccia di una denominazione specifica. </li><li> Utilizzando il &quot;Set parametri&quot; strumento, regolare la larghezza della linea 6-10 pixel (512x512 per immagini ottenute dalla fotocamera digitale collegata al microscopio composto. Per le telecamere risoluzione maggiore o minore, la larghezza in pixel deve essere ripartita in modo appropriato), utilizzando tutti altre impostazioni predefinite, e scegliere &quot;OK&quot;. Quindi utilizzare il &quot;Make istantanea&quot; strumento per scattare una foto. Scegliere &quot;Disegna traccia&quot; per ottenere una fotografia istantanea della traccia che possono essere visualizzati fianco a fianco con l&#39;originale. </li><li> Selezionare il &quot;tracciati Measure&quot; strumento e selezionare il tipo di tracciamento (cioè che si dirama a misura in base alle designazioni specifiche assegnate in fase 5.3). Quindi, selezionare &quot;Visualizza misurazioni tracing&quot; e &quot;Cancella misurazioni precedenti&quot; quindi fare clic su &quot;Esegui&quot;. Ciò produrrà un foglio elettronico che contiene il nome, etichetta, lunghezza (in pixel), e altri dati per l&#39;immagine. Questi dati possono poi essere salvati come un foglio di calcolo Excel di Microsoft per ulteriori statisticheanalisi. </li></ol>

<ol><li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System%5BTitle%5D)+AND+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li>
<li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li>
<li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li>
<li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Zpr1+%28Zinc+Finger+Protein+1%29+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649(2012).</li>
<li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087(2011).</li>
<li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li>
<li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li>
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<li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li>
<li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+GFP%2F%C3%9F-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li>
<li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila%3A+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario in competizione.

La tecnica di fissazione di calore qui descritto è uno strumento rapido e conveniente per l&#39;imaging Drosophila larvali cellule terminali tracheali. Qui, usiamo questa tecnica per esaminare la ramificazione e lume modello di cellule wild-type. Cellule tracheali esprimono GFP, guidato dal promotore specifico tracheale senza fiato, possono essere facilmente visualizzati attraverso la cuticola larvale dopo la fissazione di calore. Gli specifici modelli di ramificazione di cellule terminali individuali,...

La forma delle cellule è critico per la funzione delle singole celle all&#39;interno di un organismo, così come cellule che funzionano come parte di un tessuto o organo. Usiamo Drosophila cellule terminali tracheali, un componente del sistema respiratorio degli insetti, per indagare i meccanismi molecolari che partecipano al controllo di due tipi conservate della morfologia cellulare: ramificazione e di formazione del tubo (lumenogenesis). Cellule terminali sono situati alle estremità di una rete di tubi ramificati che funziona per fornire ossigeno ai tessuti interni 1 e hanno una morfologia ramificato elaborato che dipende da un FGF via di segnalazione che è controllato da livelli di ossigeno locale all&#39;interno tessuti bersaglio 2. Rami di cellule terminali sono tubi sottili, con piene di gas lume subcellulari che attraversa ogni ramo. Le architetture cellulari distinti di cellule terminali, insieme con la facilità con cui l&#39;analisi genetica può essere eseguita in Drosophila, rendono queste cellule un modello eccellente fo meccanismi di escrescenza cellulare investigare, ramificazione, e formazione del tubo intracellulare. Cellule terminali hanno dimostrato un modello utile per comprendere alcune delle vie di segnalazione che portano alla differenziazione delle cellule ramificate, escrescenza, e la maturazione 2-4. Utilizzando questo sistema imparziale, schermi avanti genetici per mutanti morfogenesi delle cellule sono stati eseguiti, cedendo intuizioni in meccanismi che controllano la forma delle cellule 5,6. Per esempio, questi schermi hanno rivelato che una RabGAP specifica è richiesta per la polarità del citoscheletro e il traffico delle vescicole in formazione di lumen e di posizionamento 7; che l&#39;adesione integrine-mediata è necessario per la stabilità ramo 8, e che le proteine ​​PAR-polarità epiteliali regolare il traffico di membrana polarizzata richiesto sia per ramificazione e formazione lumen 9. Altri studi in cellule terminali hanno dimostrato che è necessaria l&#39;accumulo di actina asimmetrico e organizzazione dei microtubuli per l&#39;allungamento delle cellule e lumenogenesis <sup&gt; 10. Così, diversi meccanismi biologici, conservati cellule contribuiscono alla morfogenesi cellulare terminale. Qui, descriviamo un metodo per risolvere rapidamente intatto terzo instar larve di Drosophila per l&#39;analisi del terminale cellulare ramificazione e la formazione di lumen. Questo protocollo può anche essere eseguita su entrambi i primi e secondi animali instar. Chiave di questa tecnica è la capacità di visualizzare cellule terminali che sono geneticamente etichettati mediante espressione proteina fluorescente direttamente attraverso la cuticola larvale degli animali intatti. Dal momento che questa procedura non richiede manipolazioni post-fissazione, come colorazione degli anticorpi, di osservare le cellule, che ben si adatta ad analisi ad alta velocità, tra cui lo screening genetico o di droga. Espressione della proteina fluorescente rivela la struttura dei rami cytoplasmically-riempite. Formazione del tubo può essere monitorato in parallelo utilizzando microscopia brightfield per identificare il lume pieno di gas, che contrasta con il fluido circostante-fillndr tessuti. Incluso in questo protocollo è il metodo per la generazione di mosaici genetici basati sul sistema MARCM 11, per la produzione di cellule terminali mutanti omozigoti marcati con proteine ​​fluorescenti in animali altrimenti non etichettati. Ciò è necessario, poiché cellule terminali elaborano solo le loro strutture complesse relativamente tardi nello sviluppo; mosaici genetici consentono di bypass delle esigenze del gene in altri tessuti precedenti in sviluppo. . Per generare cloni marcm, trachea sono etichettati con il driver tracheale specifico fiato (btl) 12 qui descritto è il protocollo per il cromosoma X di Drosophila, per altri cromosomi, una procedura simile può essere utilizzato, con i reagenti genetica appropriata al cromosoma essere esaminato. Qui, trachea sono etichettati da espressione di una GFP cytoplasmically localizzata, ma la procedura funziona ugualmente bene con espressione di altre proteine ​​fluorescenti, quali DsRed. Inoltre, abbiamo incluso un metodo per quantificare modelli di ramificazione e la formazione di lumen in cellule terminali, sulla base di metodi sviluppati per la caratterizzazione di modelli neuronali 13 filiali. Questo tipo di dati quantitativi può essere critica nel discernere il ruolo preciso dei geni nel processo di ramificazione o lumenogenesis, oltre a permettere un confronto diretto tra diversi mutanti 9.

<table><tbody><tr><td>Studente Dumont #5 pinze</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ16 Microscopio da dissezione (o equivalente)</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>AxioImager M1 microscopio composto (o equivalente)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Dotato di AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, set di filtri 38HE</td></tr><tr><td>100% glicerolo</td><td>BioExpress</td><td>M152-4L</td><td></td></tr><tr><td>Genotipo</td><td></td><td></td><td>: w FRT19A tuba: GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A</td></tr><tr><td>Genotipo</td><td></td><td></td><td>: y w FRT19A</td></tr></tbody></table>

esame della<em&gt; drosophila</em&gt; larvali tracheali terminal cellule al microscopio ottico

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

La forma delle cellule è fondamentale per la funzione delle cellule. Tuttavia, nonostante l&#39;importanza della morfologia cellulare, poco si sa su come le singole cellule generano forme specifiche. Cellule terminali tracheali Drosophila sono diventati un potente modello genetico per individuare e chiarire i ruoli dei geni necessari per la generazione di morfologie cellulari. Cellule terminali sono una componente di una rete tubolare ramificata, il sistema tracheale che funziona per fornire ossigeno ai tessuti interni. Cellule terminali sono un ottimo modello per studiare questioni di forma delle cellule in quanto in possesso due architetture cellulari distinti. In primo luogo, cellule terminali hanno una morfologia ramificata elaborata, simile ai neuroni complessi, in secondo luogo, i rami terminali cellulari sono formate da tubi sottili e contengono un lume intracellulare di membrana. Analisi quantitativa di terminale numero ramo cella, organizzazione ramo e forma singola branca, può essere utilizzato per fornire informazioni sul ruolo di specifici meccanismi geneticocanismi nella realizzazione di una cella ramificata. Analisi di formazione del tubo in queste cellule può rivelare meccanismi conservate della tubulogenesi comuni ad altre reti tubolari, quali la vascolarizzazione vertebrato. Qui si descrivono le tecniche che possono essere utilizzate per risolvere rapidamente, immagine e analizzare sia i modelli di ramificazione e la formazione del tubo in cellule terminali all&#39;interno di larve di Drosophila. Queste tecniche possono essere utilizzate per analizzare cellule terminali in animali wild-type e mutanti, o mosaici genetici. A causa della elevata efficienza di questo protocollo, è anche adatto per la genetica, la base di RNAi, o schermi di droga nel sistema tracheale Drosophila.

Risultati sono mostrati in Figura 2. Un singolo gruppo laterale (LG) cellula terminale indica vasta subcellulare ramificazione (visualizzata da GFP, A) e un gas piene lume subcellulari che attraversa ciascuno dei rami (visualizzato mediante microscopia brightfield; B). Queste immagini sono state raccolte da un mosaico L3 larva, generato usando il sistema MARCM descritto nelle sezioni 1 e 2, e di calore fisse e ripreso, come descritti ai punti 3 e 4. Pannelli C e D mostrano una traccia NeuronJ generato, ...

Qui, presentiamo un metodo per l&#39;analisi al microscopio ottico di cellule terminali in tracheali<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve. Questo metodo permette di rapido esame di ramo e lume morfologia in animali interi e sarebbe utile per l&#39;analisi dei singoli mutanti o schermi per mutazioni che interessano lo sviluppo delle cellule del terminale.

Esame della<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvali tracheali Terminal cellule al microscopio ottico

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

L'obiettivo generale di questa procedura è fissare rapidamente larve di drosophila intatte al fine di visualizzare la morfologia di rami e tubi nelle cellule terminali tracheali. Ciò si ottiene innanzitutto generando cellule terminali etichettate con proteine fluorescenti omozigoti in animali genetici mosaic. Il secondo passaggio della procedura consiste nel raccogliere larve mosaic e fissarle mediante riscaldamento.Il terzo passaggio consiste nell'acquisizione di immagini di cellule terminali marcate in animali fissati, utilizzando l'espressione di GFP per osservare i rami e la microscopia in campo chiaro per osservare i tubi. L'ultimo passaggio prevede la quantificazione delle morfologie delle cellule terminali. In definitiva, i risultati possono essere utilizzati per distinguere e classificare le diverse morfologie cellulari di cellule terminali di tipo selvatico e mutanti.L'unico vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come la fissazione chimica, è che questa tecnica è estremamente rapida, quindi può essere utilizzata per l'analisi ad alto rendimento delle cellule terminali tracheali. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché selezionare i larvi di stadio L3 e fissarli rapidamente per preservarne la morfologia richiede attenzione e cura. Per ottenere mosche mosaic.Utilizzare la tecnica Mark M con femmine portatrici della mutazione da esaminare. Impostare gli incroci in provette pre-ovodeposizione con una striscia di pasta di lievito fresca, e lasciare che le mosche depongano le uova per un'ora a 25 gradi Celsius. Successivamente, trasferire le mosche dalla provetta pre-ovodeposizione a una provetta fresca con pasta di lievito fresca e permettere loro di deporre per sei ore a 25 gradi Celsius.Dopo sei ore, trasferire gli adulti nei vialini pre-ovodeposizione per la conservazione e utilizzarli immediatamente in esperimenti successivi. Sottoporre i vialini raccolti con le uova a shock termico in un bagno d'acqua circolante per 45 minuti a 38 gradi Celsius, assicurandosi che la superficie del mezzo di coltura sia al di sotto del livello dell'acqua per garantire che tutti gli embrioni ricevano adeguatamente lo shock termico. Incubare quindi i vialini sottoposti a shock termico a 25 gradi Celsius per quattro-cinque giorni, fino allo stadio di larve di terzo stadio.Iniziare a cercare utilizzando pinzette fini. Prelevare delicatamente le larve di terzo stadio in movimento dai lati del flacone e posizionarle in glicerolo al 100% raffreddato in una piccola piastra di plastica. Esaminare le larve utilizzando un microscopio stereoscopico con ottica fluorescente a elevato ingrandimento (10x o 20x).Identificare le larve con espressione a mosaico di cellule tracheali marcate con fluorescenza. Quindi, utilizzando pinzette fini, prelevare con attenzione questi animali e posizionarli in una goccia di glicerolo fresco al 100% su un vetrino bianco per microscopio. È possibile posizionare più animali nella stessa goccia nello stesso ambiente del microscopio.Posizionare il vetrino su un blocco riscaldante a 70 gradi Celsius fino a quando gli animali smettono appena di muoversi, il che avviene entro 20 secondi. Inizialmente, gli animali si dimenano, ma diventano rigidi ed allungati. Una volta morti, un'esposizione prolungata provoca danni termici alle ramificazioni terminali, nonché danni ai lumi.Il segnale GFP diventa debole e diffuso. Il momento della fissazione termica è cruciale perché un'eccessiva fissazione può danneggiare le cellule, portando a un'analisi fuorviante o difficoltosa. Pertanto, i campioni devono essere posizionati sul blocco riscaldante e fissati fino a quando smettono appena di muoversi, ma non oltre.Ora, utilizzando pinzette fini, orientare con attenzione tutte le larve fissate in modo parallelo tra loro. Quindi posizionare delicatamente un coprioggetto microscopico sopra le larve, evitando la formazione di bolle d'aria. È possibile che il coprioggetto non risulti perfettamente piano, ma ciò non costituisce un problema.Entro i successivi 30 minuti, acquisire le immagini delle larve. Poiché il fissativo termico degrada rapidamente le cellule terminali e i segnali GFP diventano molto diffusi. Successivamente, posizionare il vetrino sul portapreparati di un microscopio stereo composto.Utilizzando un obiettivo 5x, individuare i due tronchi dorsali paralleli che si estendono dall'anteriore al posteriore sulla superficie dorsale dell'animale. Successivamente, individuare le due cellule terminali dorsali direttamente tra i due tronchi dorsali. Questo aiuta a identificare il segmento appropriato per l'analisi.Orientati una volta, ruotare gli animali per osservare le cellule terminali desiderate spingendo delicatamente il bordo del vetrino con le pinzette. Eseguire questa operazione perpendicolarmente all'asse longitudinale dell'animale, facendo ruotare lentamente le larve. La selezione delle cellule terminali appropriate è fondamentale per ottenere risultati costanti e confrontabili tra mutanti.Le cellule terminali del ramo del corpo adiposo si trovano facilmente adiacenti al tronco dorsale, lateralmente rispetto alla linea mediana. Le cellule terminali del gruppo laterale G sono facilmente individuabili e si trovano appena al di fuori della linea mediana ventrale nei segmenti più anteriori e posteriori. L'organizzazione delle cellule terminali è diversa rispetto agli altri segmenti.Questi segmenti non devono essere esaminati, ma l'attenzione deve invece concentrarsi sulle cellule e sui segmenti. Le cellule terminali dorsali TR da due a nove presentano un modello di ramificazione più stereotipato rispetto ad altre cellule terminali tracheali. Ciò potrebbe dipendere da segnali aggiuntivi non autonomi a livello cellulare, e questo aspetto deve essere preso in considerazione quando si decide se includerle nell'analisi.Una volta identificata una cellula terminale di interesse, acquisire un'immagine utilizzando un'ingrandimento di 10 x o 20 x a causa dei modelli variabili di ramificazione. Cercare di acquisire immagini che includano il maggior numero possibile di rami ed estremità dei rami senza spostare il palchetto. Spegnere la fluorescenza e accendere la luce trasmessa.Per acquisire un'immagine in campo chiaro della stessa cellula e dello stesso piano focale, la lume sarà fortemente contrastata all'interno dello spazio della cellula terminale. Per quantificare i rami e i lumi delle cellule terminali, acquisire più immagini in diversi piani focali per ciascuna cellula terminale. Alcune cellule richiedono una singola immagine per raccogliere dati sufficienti, mentre altre possono necessitare fino a tre immagini singole in diversi piani focali.Per acquisire tutti i rami, aprire le immagini in campo chiaro dell'estremità fluorescente in ImageJ con il plugin NeuronJ installato. Utilizzando lo strumento aggiungi tracciamenti, tracciare manualmente i rami e il lume dell'intera cellula terminale; quindi, con lo strumento etichetta tracciamenti, rinominare e ricolorare ogni tracciato assegnando a ciascuna linea una specifica denominazione per cinque immagini di dimensioni 12 × 12 pixel. Usare lo strumento imposta parametri per regolare la larghezza della linea da sei a dieci pixel.Regolare proporzionalmente immagini con risoluzione più alta o più bassa. Lasciare le altre impostazioni ai valori predefiniti e premere ok. Quindi utilizzare lo strumento di acquisizione dell'istantanea.Per acquisire un'immagine, scegliere disegna Traccia per ottenere un'istantanea della traccia che può essere mostrata affiancata all'immagine originale. Selezionare lo strumento misura tracciamenti e scegliere il tracciamento. Digitare i rami da misurare in base alle specifiche denominazioni.Successivamente, selezionare la visualizzazione delle misurazioni del tracciamento. Poi cancellare le misurazioni precedenti e fare clic su esegui. Verrà generato un foglio di calcolo contenente il nome, l'etichetta, la lunghezza in pixel e altri dati dell'immagine da salvare per l'analisi statistica.Il protocollo descritto è stato seguito per analizzare le cellule tracheali mutate in larve Mosaic L tre visualizzate mediante GFP. Il singolo gruppo laterale di cellule terminali etichettato LG presenta un esteso ramificazione subcellulare in campo chiaro; un lume subcellulare riempito di gas che attraversa ciascun ramo è evidente utilizzando Neuron J. È stata eseguita una tracciatura dei rami, così come una tracciatura del lume. In questo animale non mosaic, la cellula terminale del corpo grasso FB viene identificata.Si noti che la GFP è espressa in tutto il sistema tracheale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come fissare rapidamente le immagini ed eseguire analisi quantitative sulle cellule terminali tracheali in animali integri dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori del software per utilizzare le cellule terminali tracheali come modello fondamentale per comprendere aspetti della morfogenesi cellulare impiegando le cellule terminali tracheali.

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