Optogenetic Perturbazione di attività neurale con illuminazione laser in semi-intatte
4 luglio 2013
Qui si descrive un protocollo per optogenetic manipolazione delle attività dei motoneuroni, mentre il monitoraggio dei cambiamenti in uscita del motore (contrazione muscolare) in semi-intatte Drosophila Larve utilizzando laser all'interno di un microscopio confocale convenzionale. Questa tecnica consente ai ricercatori di ottenere perturbazione locale dell'attività neurale in pochi neuromeres per chiarire la dinamica di circuiti motore.
In questo protocollo, si inizia nutrendo la larva di genotipo appropriato con cibo a base di E contenente tutto il trans A TR. Ogni laboratorio viene fissato e dissezionato in soluzione salina normale, sostituendo quindi la soluzione salina normale con soluzione Ringer al calcio al due milli e posizionando il preparato LABA sullo stage del microscopio. Il movimento del LABA dissezionato viene registrato in video mediante una telecamera CCD. Illuminando localmente il sistema nervoso, è possibile perturbare l'attività neuronale di un sottoinsieme di neuroni in un momento specifico, monitorando al contempo il movimento dello stesso preparato inattivo.
Ciao, sono Tega nel laboratorio del dottor A. Ciao, sono Hi Kosaka, anch'io nel laboratorio del dottor A, livello Oph.
La locomozione è un sistema modello utile per lo studio dei circuiti motori. Grazie alle tecniche genetiche altamente sviluppate in questo protocollo, procederemo a una manipolazione optogenetica dei neuroni motori monitorando nel contempo il movimento del livello. Utilizzando laser nel microscopio confocale, è possibile stimolare un sottoinsieme di neuroni e analizzare le risposte motorie alla perturbazione spaziotemporale dei neuroni.
Quindi iniziamo. Mantenere linee di moscerini di K six G four US CHR two, o K six G four US NPHR in contenitori di plastica contenenti cibo vivo standard. Aggiungere una soluzione TL al lievito alle concentrazioni appropriate e mescolare bene. Distribuire il lievito su un agar di succo di mela.
Prelevare la seconda o la terza colonia in SLA dalle provette. Posizionare la colonia sulla piastra con spazio per lievito contenente un TR. Coprire la piastra con pellicola di alluminio per mantenere il TR al buio. Far crescere la colonia a 25 gradi C per un periodo di tempo appropriato.
Questa è una telecamera CCD per la visualizzazione dello stesso laboratorio intatto. Collegare la telecamera CCD a un microscopio confocale convenzionale dotato di distacco SEMA. Prelevare l'atrio A TRA e risciacquarlo con acqua.
Per rimuovere i residui di cibo dal corpo, posizionare la lava sul lato dorsale del piatto freddo con protezione C staccata. Fissare con puntine da insetto la testa e la coda. Aggiungere soluzione salina normale priva di calcio.
Praticare un piccolo taglio vicino alla coda con forbici microchirurgiche; da questa incisione, eseguire un taglio longitudinale lungo la linea mediana dorsale. Prestare attenzione a non danneggiare il midollo spinale ventrale e i nervi periferici.
Eseguire una piccola incisione laterale del pinzetta sulla testa in corrispondenza di ogni angolo della parete corporea dissezionata. Rimuovere gli organi interni, lasciando solo il cervello e il cordone nervoso ventrale. Sostituire la soluzione salina normale con una soluzione ringer al calcio modello da 2 milioni.
Montare un obiettivo secco a potenza massima sul microscopio confocale e posizionare il preparato sul portacampioni del microscopio. Ottenere un'immagine in trasmissione del preparato dissezionato mediante un laser rosso per localizzare il cordone nervoso ventrale tramite microscopio confocale. Definire l'area di interesse sull'immagine in trasmissione; l'ingrandimento dell'immagine può essere utile per determinare con precisione l'area di interesse specifica.
Modificare il set di filtri del microscopio per illuminare con luce di 488 nanometri o 559 nanometri. Visualizzare la parete corporea illuminando il preparato con la lampada alogena. Monitorare il preparato mediante una telecamera CCD collegata al microscopio confocale.
Ricordare il movimento della parete corporea e commutare il fascio laser solo temporaneamente per manipolare l'attività neuronale, mentre si monitora il movimento peristaltico; lo stesso preparato integro viene osservato e registrato mediante una telecamera CCD. Questo laboratorio esprime CHL due nei neuroni moderni. L'illuminazione di uno o due segmenti del cordone nervoso ventrale attiva i neuroni moderni nei segmenti, inducendo a loro volta la contrazione muscolare nei corrispondenti segmenti della parete corporea, stimolando altri segmenti nel cordone nervoso ventrale.
Il freddo induce la contrazione di altri segmenti corporei. NPHL è stato espresso nei neuroni motori quando alcuni segmenti del cordone nervoso ventrale sono stati stimolati con un laser giallo. L'onda di propagazione è stata arrestata nel corrispondente segmento della parete corporea.
L'onda è quindi ripartita dal segmento arrestato quando è stata disattivata l'eliminazione con laser. Questo protocollo chiarisce la procedura per eseguire una perturbazione optogenetica dell'attività neuronale mediante laser, nello stesso livello circolare in movimento. Il cordone nervoso ventrale e il nervo periferico non devono essere danneggiati durante questa dissezione per ottenere una stimolazione sufficiente.
L'intensità dell'illuminazione deve essere regolata modificando la potenza del laser, la velocità di scansione o il numero di ripetizioni nel microscopio confocale. Questo è l'intero protocollo. Grazie per aver guardato e buona fortuna nei vostri esperimenti.
Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo per la manipolazione optogenetica dell'attività dei motoneuroni in larve di Drosophila semi-intatte. Utilizzando laser all'interno di un microscopio confocale, i ricercatori possono monitorare le contrazioni muscolari e chiarire la dinamica dei circuiti motori.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Optogenetica
- Circuiti motori
Sfondo
- La optogenetica permette un controllo preciso dell'attività neuronale.
- I larvi di Drosophila costituiscono un modello per lo studio dei circuiti motori.
- Comprendere l'output motorio è fondamentale per ottenere informazioni sulle dinamiche neurali.
- Questa tecnica utilizza la microscopia confocale per il monitoraggio in tempo reale.
Scopo dello studio
- Manipolare l'attività dei motoneuroni mediante optogenetica.
- Osservare i cambiamenti nella contrazione muscolare in risposta a perturbazioni neurali.
- Analizzare la dinamica dei circuiti motori in un preparato semi-integro.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di larve di Drosophila con modifiche genetiche specifiche.
- Dissezione e montaggio delle larve su un palco del microscopio.
- Utilizzo di laser per stimolare neuroni specifici durante il monitoraggio delle contrazioni muscolari.
- Registrazione delle risposte motorie mediante una telecamera CCD.
Risultati principali
- L'illuminazione locale del cordone nervoso ventrale ha indotto contrazioni muscolari.
- La perturbazione dell'attività neurale ha portato a cambiamenti osservabili nella locomozione.
- Le risposte variavano in base al momento e alla posizione della stimolazione.
- Il protocollo ha permesso con successo di chiarire la dinamica dei circuiti motori.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un quadro per lo studio dei circuiti motori in Drosophila.
- La manipolazione optogenetica è efficace per analizzare la dinamica neuronale.
- Studi futuri potranno basarsi su questo metodo per esplorare interazioni neurali più complesse.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La perturbazione optogenetica precisa in larve di Drosophila semi-intatte consente una mappatura ad alta risoluzione della funzione dei circuiti neurali durante il comportamento attivo. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi isolando l'impatto causale di specifici gruppi neuronali sull'output motorio. Il metodo supporta una riduzione del rischio di natura meccanicistica nella fase iniziale della scoperta, orientando le decisioni di portafoglio nello sviluppo di composti neuroattivi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi spazialmente e temporalmente risolta della funzione dei circuiti neurali in un sistema geneticamente modificabile.
- Consente la validazione funzionale di bersagli neuronali candidati collegando l'attività a output motori quantificabili.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico isolando gli effetti di specifici sottoinsiemi di neuroni sul comportamento.
- Migliora la fiducia predittiva nella selezione e nel triage dei bersagli successivi.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce una piattaforma validata e riproducibile per la quantificazione delle risposte motorie alle perturbazioni neurali.
- Permette la standardizzazione dei parametri di stimolazione optogenetica per lo sviluppo di saggi.
- Fornisce letture quantitative basate su video, adatte per analisi comparative tra diverse condizioni sperimentali.
- Consente una valutazione affidabile di composti neuroattivi in un sistema controllato e semi-integro.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la manipolazione dei circuiti neurali ai fenotipi motori rilevanti per la malattia, quando applicabile.
- Consente una continuità dalla scoperta genetica alla validazione preclinica funzionale in un organismo modello.
- Supporta l'avanzamento mirato dei bersagli neurobiologici basato sui dati di output funzionale.
- Fornisce informazioni meccanicistiche che guidano le strategie di biomarcatori traslazionali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo optogenetico si integra nel percorso di scoperta, dalla verifica iniziale delle ipotesi fino all'identificazione dei composti promettenti e alla validazione preclinica per bersagli neuroattivi.
- Biologia della scoperta: Supporta test basati su ipotesi della funzione neuronale e la mappatura dei percorsi in un sistema vivo e in movimento.
- Screening: Fornisce dati quantitativi riproducibili sull'output motorio per la standardizzazione dei saggi e lo screening di composti.
- Analisi: Permette il confronto statistico delle risposte motorie in seguito a perturbazioni neurali definite.
- Ricerca traslazionale: Collega la manipolazione genetica alla fenotipizzazione funzionale rilevante per modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile per la validazione iterativa di bersagli e studi meccanicistici in diversi programmi di neurobiologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione dei bersagli neurali.
- Valore operativo: Standardizza le perturbazioni optogenetiche e le letture comportamentali quantitative per flussi di lavoro scalabili.
- Valore strategico: Informa le decisioni di avanzamento o interruzione e migliora l'efficienza del capitale riducendo i rischi associati a bersagli neurobiologici nelle fasi iniziali.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione di programmi di scoperta di agenti neuroattivi con un adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in optogenetica, genetica di Drosophila e microscopia confocale.
- Necessita dell'accesso a una microscopia confocale dotata di illuminazione laser e acquisizione video ad alta risoluzione.
- Richiede una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per quanto riguarda i protocolli di dissezione, illuminazione e registrazione.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diverse popolazioni neuronali o paradigmi comportamentali.
- Dipende da un controllo preciso dei parametri di illuminazione e da un'accurata manipolazione del tessuto per evitare effetti confondenti.
