Gli In ovo CAM-saggio come Xenograftmodel per Sarcoma

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un test della membrana toica del pollo o CAM per studiare il sarcoma, la cellula o il comportamento dell'innesto. Ciò si ottiene creando prima una finestra nel guscio di un uovo il terzo giorno di incubazione. Nella seconda fase, il nono giorno di incubazione, viene preparato il materiale tumorale.

Quindi, dopo aver rimosso lo strato epiteliale, il tumore viene aggiunto alla CAM Durante la fase finale del 16° giorno di incubazione, la CAM viene fotografata, raccolta e fissata in formalina per la valutazione istologica. In definitiva, l'istologia h e d classica e l'immunoistochimica sono utilizzate per dimostrare il sarcoma, la proliferazione e la vascolarizzazione dell'invasione cellulare e le reazioni dell'ospite. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la maggior parte dei modelli di xenotrapianto, è che è semplice da imparare e relativamente economica.

Permette inoltre di studiare una miriade di attività associate alle metastasi in un periodo di tempo molto breve e non richiede un comitato etico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul sarcoma, come l'effetto delle interazioni tumore-ospite sulla sopravvivenza del tumore, la ricostituzione del microambiente tumorale e il reclutamento delle cellule stromali. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia personalizzata per il sarcoma poiché il materiale del paziente può essere studiato.

Tutte queste nuove tecniche possono fornirci nuove intuizioni sulla neurogenesi SAR. È anche molto applicabile ad altri sistemi come l'oncogenesi in generale. Inizia usando un bisturi sterile per tagliare il campione tumorale in piccoli pezzi, non più grandi di un millimetro cubo, rimuovendo tutte le aree calcificate.

Quindi pesare il campione e trasferire da due a quattro grammi di tessuto in una provetta dissociatrice. Digerire il tessuto in 2,5 millilitri di collagenasi due e 2,5 millilitri di soluzioni di DN a. Dopo aver processato il tessuto, secondo il protocollo tumorale di dissociazione H, filtrare la sospensione risultante attraverso un colino cellulare da 150 micron.

Ora centrifugare la sospensione a una forza centrifuga appropriata, ad esempio da 100 a 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso accuratamente il surnatante con una pipetta, incubare il pellet in 10 millilitri di lisi eritrocitaria, tamponare a temperatura ambiente con tazione occasionale. Dopo 10 minuti, aggiungere 25 millilitri di terreno di coltura per fermare la reazione dopo aver fatto girare nuovamente la sospensione, il pellet dovrebbe essere bianco, scartare il surnatante e aggiungere cinque millilitri di terreno alle cellule, quindi filtrare la sospensione attraverso un colino cellulare da 70 micron.

Utilizzare un contatore automatico di cellule per determinare il numero di cellule vive per millilitro durante lo sviluppo. Terzo giorno, inserire un ago calibro 18 nella punta dell'uovo e rimuovere due millilitri di albumina per abbassare il livello della membrana ovo-corica o cam. Ora applica una pellicola adesiva semipermeabile sul lato superiore contrassegnato del guscio per evitare la fuoriuscita di particelle di guscio sulla camma durante il taglio della finestra.

Quindi fai un foro di introduzione con un piccolo tutto sulla superficie dell'uovo. Non danneggiare la camma durante l'apertura del guscio è la parte più delicata della procedura. Usiamo delle forbici affilate tenendoli orizzontalmente in una mano mentre teniamo l'uovo nell'altra mano.

Ora, usa un paio di forbici chirurgiche sterili e appuntite per tagliare una finestra quadrata di un centimetro nel guscio. Il cuore pulsante e i vasi adiacenti dell'embrione dovrebbero ora essere visibili sulla superficie del tuorlo d'uovo. Rimuovere eventuali ovuli non fecondati o embrioni morti.

Quindi sigillare la finestra con una pellicola adesiva più semipermeabile. Dopo aver fatto girare nuovamente la sospensione tumorale, risospendere il pellet in gel di matrice extracellulare raffreddato una volta da 10 a sei cellule per 100 microlitri di gel. Conserva questa soluzione sul ghiaccio che si scioglie.

Successivamente, sotto flusso laminare, utilizzare un paio di forbici chirurgiche sterili per asportare parte della pellicola adesiva semipermeabile. Rimuovere lo strato di cellule epiteliali toccando leggermente la camma con un'asta di vetro sterile. Quindi aggiungere 4 gocce da 25 microlitri della sospensione di gel ECM cellulare alla camma, consentendo al gel ECM di polimerizzare tra un'applicazione e l'altra.

In questo modo si crea una placca aderente contenente le cellule tumorali. Quindi sigillare nuovamente la finestra a guscio con una pellicola adesiva semipermeabile. Dopo l'opportuno periodo di incubazione sperimentale, utilizzare un paio di forbici chirurgiche per allargare la finestra del guscio, facendo attenzione a non tagliare troppo in basso.

Successivamente, utilizzare una pipetta per aggiungere da 300 a 500 microlitri di PBS sulla sezione CAM contenente il materiale inoculato. Quindi fotografa la cam attraverso un microscopio a stereofluorescenza. Successivamente, utilizzare un paio di forbici sterili per tagliare la membrana sul bordo che giace contro il guscio e posizionare la camma raccolta in una capsula di Petri sterile riempita con PBS o formaldeide tamponata.

Fotografare quindi sia il lato superiore che quello inferiore della camma, sia con che senza filtro come visto. In questa prima figura, gli innesti tumorali diventano aderenti alla camma. Qui, in queste due immagini, si può osservare una sospensione di una singola cellula dal materiale del paziente che mostra una placca secca e leggermente sollevata.

Viene mostrata la marcata increspatura della membrana che si verifica dopo l'escissione della camma. La linea SAO a due linee forma una placca che si diffonde sopra il CAM con un netto aumento della superficie a partire dal settimo giorno. Dopo l'inoculazione, il segnale GFP rimane forte, indicando cellule vitali.

Queste placche contenenti SW 1 3 53 cellule mostrano una diminuzione della superficie e tendono ad avere una camma contratta, che si traduce in una membrana rugosa. Dopo la raccolta dal settimo giorno, si osserva frequentemente sanguinamento. Il segnale DSR diminuisce man mano che la sonda fluorescente si diluisce dopo molte divisioni cellulari, nonché se si verifica un sanguinamento.

Nella maggior parte dei casi, la reazione vascolare della CAM si osserva quando nuovi vasi tortuosi entrano nel campione. Ad esempio, la ramificazione come indicato dalle punte di freccia e l'anastomosi come indicato dagli asterischi in questo sanguinamento puntiforme come indicato dalle frecce, possono essere osservate anche in tutta la placca. Si noti la migrazione delle due celle SAO parallele ai vasi della camma.

Questa reazione vascolare può essere visualizzata dopo l'escissione della camma nella vista inferiore, mostrando vasi tortuosi che circondano l'innesto o la placca. La reazione vascolare del CAM si osserva nel gruppo di trapianto tumorale e nel gruppo di sospensione a singola cellula. L'evidenza istologica mostra che le due cellule SAO mantengono un aspetto a cellula singola per tutto il volume del gel della matrice extracellulare, causando un aumento dello spessore e del diametro della placca.

Le cellule tumorali invadono lo strato mesodermico della camma come indicato qui dalla freccia, allargando così la distanza tra gli strati endodermici e dermici della camma come una cerniera di apertura. Come indicato dalla doppia freccia, il modello di crescita delle cellule SW 1 3 5 3 e di una sospensione di una singola cellula del sarcoma cosciente di un paziente è più raggruppato con isole di cellule in una distesa del gel della matrice extracellulare. Come indicato dalla freccia, nonostante il loro sito ectopico di crescita, abbiamo scoperto che le caratteristiche essenziali e le caratteristiche immunoistochimiche dei tumori originali del sarcoma erano mantenute nella cam.

Inoltre, gli innesti tumorali sono diventati rivascolarizzati, come evidenziato dalla comparsa degli eritrociti di pollo nucleati di colore rosa scuro blu, come indicato dalle punte di freccia e trovati nei vasi, il conteggio delle cellule KI 67 positive e KI 67 negative mostra un aumento costante del numero totale di cellule dal quarto giorno per entrambe le linee cellulari. Dopo questo giorno, il numero totale di cellule rimane stabile sette giorni dopo l'inoculazione, il numero di cellule KI 67 positive e il numero totale di cellule iniziano a diminuire. Una percentuale maggiore di cellule KI 67 positive si osserva vicino alla camma e una percentuale maggiore di cellule KI 67 negative sulla superficie della placca.

Una volta padroneggiata, la tecnica cam SA può essere utilizzata per analizzare 50 volte in 14 ore distribuite su tre giorni se eseguita correttamente. Ulteriori colorazioni h ed e e valutazione possono essere eseguite e richiedono tre ore ogni 10 condizioni Seguendo questa procedura. È possibile eseguire metodi aggiuntivi come l'imaging dello stile di vita per affrontare ulteriori problemi come lo stravaso o l'izzazione delle cellule tumorali marcate con l'influenza.

Quindi, con lo sviluppo di questa nuova tecnica, consente ai ricercatori nel campo dei test preclinici di esplorare nuovi fattori prognostici e terapeutici nei pazienti con sarcoma. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare il materiale tumorale nel cmaa e di come tradurre le tue osservazioni microscopiche e microscopiche verso una migliore comprensione delle interazioni tumorali con l'ospite.