Metodi per l'esecuzione di Croci nel Setaria viridis, Un nuovo sistema Modello per le Erbe

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come eseguire incroci per cter verus un nuovo sistema modello per le erbe. Ciò si ottiene selezionando, tagliando ed etichettando prima il pinnacolo. Il secondo passo consiste nell'evirare la pannocchia tagliata immergendola in un bagno d'acqua a 48 gradi Celsius.

Successivamente, il pinnacolo tagliato viene utilizzato come femmina per l'impollinazione da un pinnacolo che sparge polline. Il passaggio finale consiste nella raccolta dei semi due settimane dopo l'impollinazione incrociata. In definitiva, la colorazione Gus dei semi ibridi putativi viene utilizzata per dimostrare l'efficacia della tecnica.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'evirazione fisica, è che è meno invasiva e relativamente facile da stabilire in laboratorio. Questo metodo contribuirà ad accelerare l'adozione del cter verus come modello genetico, facilitando l'esecuzione degli incroci. Per iniziare, rimuovere una cella per l'irrigazione e poi riempire un vassoio con quattro celle per nove con metro Mix 360.

Quindi nebulizza leggermente le celle e semina i semi sulla superficie del terreno, un seme per cellula. Quindi coprire i semi con uno strato di terra, una nebbia spessa 0,5 centimetri sulla superficie del terreno per inumidirli, quindi innaffiare le piatte dal fondo. Continua ad annaffiare le celle dal basso una o due volte al giorno dopo la semina, facendo attenzione a non esagerare con l'acqua.

Imposta le condizioni della camera di crescita a 31 gradi Celsius durante il giorno e 22 gradi Celsius di notte con un trattamento preda di 15 gradi Celsius dalle 8:30 alle 9:00. Mantenere anche un programma di 12 ore di buio chiaro e impostare l'umidità relativa al 50% in queste condizioni. Satter verus a 10.1 fiorirà da 21 a 22 giorni dalla semina. Idealmente, l'evirazione viene eseguita nel pomeriggio o la sera.

Seleziona il pentacolo primario su ogni pianta che ha da uno a cinque fiori in fiore. Quindi taglia la punta del pentacolo e rimuovi tutti i fiori nella sezione inferiore delle sezioni centrali e di base prossimali usando una pinza fine. Se a ha solo un 10 ° a un quinto di fiori in fiore.

Per mantenere la sezione inferiore del distale, il medio e la parte superiore del centro prossimale per un'ulteriore potatura, tagliare la punta e tagliare i fiori dalla base della pannocchia. Se una pannocchia ha da un quarto alla metà dei fiori in fiore, mantieni la sezione centrale prossimale per un'ulteriore potatura e taglia la sezione centrale distale. Una volta che il pentacolo è stato tagliato, usa le forbici chirurgiche per tagliare leggermente le setole.

Fare attenzione a trattenere le setole nella regione che verrà impollinata in modo da proteggere le cimette da possibili danni da calore. Per ogni spighetta, conserva il fiore maturo più in alto. Il fiore più in alto avrà una maggiore probabilità di antesi al momento dell'impollinazione.

Quindi rimuovi tutti i fiori che sono sbocciati e tutti i fiori immaturi lasciando circa 20-30 fiori per pinnacolo che sono distribuiti uniformemente. Quindi, segna un lato di ogni fiore con un pennarello indelebile rosso. E registra il numero di fiori sul pinnacolo contrassegna il pinnacolo con le seguenti informazioni, la data di evirazione, la durata e la temperatura alla quale viene eseguita l'evirazione.

Una volta tagliata la pannocchia, rimuovere tutte le frese di ogni pianta per garantire la riallocazione di più risorse allo sviluppo del pinnacolo principale. Un'ora prima dell'evirazione, impostare un bagnomaria a 48 gradi Celsius per il trattamento termico. Una volta preriscaldati, piegare delicatamente i pentacoli tagliati e immergerli tre o quattro alla volta in acqua tiepida per tre-sei minuti.

Prestare attenzione a non rompere il gambo del pentacolo. La foglia a bandiera, che sottotende il pentacolo, non deve entrare in contatto con l'acqua calda. Questo per prevenire danni da calore al tessuto fogliare.

Una volta eseguita l'evirazione per la durata desiderata, rimuovere le pannocchie dal bagnomaria e scuotere delicatamente l'acqua dalla pannocchia. Quindi coprire completamente la pannocchia evirata con un sacchetto per il pane microforato personalizzato e fissarla con una fascetta. I sacchetti per il pane microforati possono essere personalizzati in base alle dimensioni della pannocchia.

Infine, rimetti le piante nella camera di crescita fino al giorno successivo. Alle 9:00 del secondo e del terzo giorno, sposta le femmine evirate e i genitori maschi non evirati dalla camera di crescita al laboratorio per eseguire incroci, osservare e aggiungere un altro rosso. ai fiori che sono sbocciati o stanno sbocciando.

Utilizzando un pennarello indelebile rosso, registra il numero totale di fiori sbocciati per pannocchia. Quindi registra la data di impollinazione e il nome del genitore maschio sull'etichetta per tenere traccia di quali incroci sono stati eseguiti. Osservare il picco di antitesi nei genitori maschi nelle nostre condizioni di laboratorio, i fiori sui pentacoli del genitore maschile iniziano l'apertura sincrona intorno alle 10:10 Una volta aperti, lo sforzo completo dell'antera e il rilascio di polline si verificheranno dopo 20 minuti.

Iniziare immediatamente l'impollinazione quando è giallastro. Le antere bianche sono visibili sui fiori del genitore maschio. L'impollinazione viene eseguita il secondo e il terzo giorno utilizzando l'impollinazione a pannocchia o l'antera all'impollinazione dello stigma.

Usando una pannocchia staccata mentre il maschio strofina delicatamente la pannocchia insieme alla pannocchia evirata per facilitare l'impollinazione e scartare la pannocchia maschio per evitare la contaminazione, ripetere il processo di impollinazione fino a quando ogni pinnacolo evirato non è stato impollinato da due o tre pentacoli. Il metodo più efficace è l'impollinazione dello stigma con il forcipe. Scegli un fiore che sta sbocciando con antere bianche giallastre o raccogli antere e tocca fisicamente lo stigma del fiore sul genitore femminile.

Usa un fiore del genitore maschio per impollinare un fiore sulla pannocchia evirata tra le impollinazioni di diversi genitori maschi. Immergere la pinza in etanolo al 95%, quindi strofinare con le salviette Kim per evitare la contaminazione dovuta al trascinamento del polline tra le diverse croci. Una volta eseguita l'impollinazione, coprire la pannocchia della genitrice con un sacchetto per il pane microforato personalizzato e fissarlo alla base utilizzando una fascetta.

Dopo l'impollinazione fino alla raccolta dei semi, raccogli i semi da 14 a 16 giorni dopo il giorno dell'impollinazione e posiziona l'etichetta nella stessa busta dei semi. I semi con macchie rosse su entrambi i lati rappresentano i semi che sono il risultato dell'incrocio genetico controllato. Scartare tutti i semi senza segni rossi in quanto rappresentano i semi che derivano da fiori di nuova concezione.

Dopo l'evirazione, i semi con macchie rosse, solo su un lato rappresenteranno probabilmente i semi risultanti dall'autoimpollinazione. Infine, essiccare i semi a 30 gradi Celsius per due giorni. Conserva i semi essiccati in laboratorio o, idealmente, in una camera di semi.

Quando si è pronti per ulteriori analisi, rimuovere le fisi se necessario. I metodi descritti in questo video sono il risultato di numerosi studi che utilizzano diverse temperature e tempi di trattamento per ottimizzare il processo di evirazione. Il successo di questo processo è stato misurato dal numero di semi ibridi che sono stati ottenuti.

Sei semi da uno degli incroci di prova in cui il genitore maschio portava un giornalista. I geni che codificano per la beta glucuronidasi sono mostrati qui. Il gene reporter fa sì che il seme diventi blu quando viene colorato, rendendo il numero di semi ibridi facile da contare Una volta padroneggiato, è possibile incrociare fino a 15 pentacoli al giorno se la procedura viene eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire le croci in Aria verus.