Name: Vivere Imaging test per la valutazione dei ruoli di Ca 2 + E sfingomielinasi nella riparazione di Pore-formano ferite Tossina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 25 s
Description: Impara a utilizzare il colorante lipofilo FM1-43 per l'imaging di cellule vive e misurare la cinetica di rimozione delle tossine porogene dalla membrana plasmatica. Questo metodo consente di valutare il ruolo del calcio e della sfingomielinasi nella riparazione membranale.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH R37 AI34867 e R01 GM064625 a NWA Ringraziamo il Dott. R. Tweten dalla University of Oklahoma per l&#39;espressione plasmide SLO.

1. Trascrizionale silenziamento di ASM <ol><li> Seme 1,5 x 10 5 cellule HeLa in 2 ml di DMEM mezzi di crescita (alto glucosio DMEM con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutammina, 1% Penn-Strep) su piastre inferiori 35 millimetri di vetro (MatTek) e incubare una notte a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. </li><li> Il giorno seguente, aspirato fuori i terreni di crescita e sostituirlo con 2 ml di DMEM ridotta mezzo siero (DMEM con 4% FBS), almeno 1 ora prima di aggiungere la miscela di trasfezione siRNA. </li><li> Preparare 4 tubi per la miscela di oligo trasfezione di siRNA. In provette A e C, aggiungere 250 microlitri OptiMEM ridotta siero e 4 microlitri Lipofectamine RNAiMax, per 35 millimetri piatto da transfettate. In tubo B, aggiungere 250 ml di OptiMEM ridotti siero e 8 microlitri (160 pmoli), del controllo del contenuto GC medio oligo (Control siRNA), per 35 millimetri piatto da transfettate. In tubo D, aggiungere 250 ml di OptiMEM ridotti siero e 8 microlitri (160 pmoli) di SMPD1 oligo (smo), per 35 millimetri piatto to essere transfettate. Incubare le provette a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Unire i tubi A e B per formare il complesso trasfezione per il controllo siRNA e tubi C e D per la ASM siRNA. Incubare le reazioni a temperatura ambiente per 20 min. </li><li> Aggiungere miscele di reazione trasfezione controllo siRNA e ASM siRNA lentamente, goccia a goccia, nei rispettivi piatti peggiori 35 mm vetro e incubare a 37 ° C / 5% di CO 2. A 24 ore dopo la trasfezione, delicatamente aspirare fuori dei media e sostituirlo con fresco terreni di coltura DMEM. Per efficiente knockdown ASM, i piatti dovrebbero essere ulteriormente incubate a 37 ° C / 5% di CO 2 per circa 31 ore (totale 55 ore) prima di imaging in tempo reale. </li></ol> 2. Preparazione dei reagenti per Live Microscopia <ol><li> Preparare una soluzione di formazione di pori ricombinante tossina Streptolisina O (SLO) ad una concentrazione di 100 ng / ml in PBS 1x freddo senza Ca 2 + e Mg 2 +. La SLO utilizzata in questi test è un constitutively mutante cisteina attivo che non richiede agenti riducenti per l&#39;attività, gentilmente fornito dal Dr. Rod Tweten, University of Oklahoma. La tossina è stata espressa in E. coli BL21 DE3 e purificata in condizioni native, come descritto in precedenza 16. </li><li> Preparare la soluzione stock FM1-43: Risospendere FM1-43 polvere liofilizzata in DMSO per creare una soluzione di 25 mm. </li><li> Preparare Soluzione A: Diluire la soluzione stock FM1-43 in DMEM fredda con Ca 2 + ad una concentrazione finale di 4 micron (1,5 ml sono necessari per ogni piatto MatTek) e memorizzare sul ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparare Soluzione B: Diluire la soluzione stock FM1-43 in DMEM freddo senza Ca EGTA mM 2 + e 10 (Ca 2 + DMEM-free) ad una concentrazione finale di 4 micron (1,5 ml necessari per ogni piatto MatTek) e memorizzare sul ghiaccio fino necessario. </li><li> Pre-caldo (37 ° C) 1 ml della soluzione A e soluzione B in provette Eppendorf. </li><li> Continuate a soluzioni di ghiaccio di DMEM con Ca 2 + e Cun DMEM 2-free +. </li></ol> 3. Imaging cellulare dal vivo di FM1-43 Afflusso in SLO trattati e cellule non trattate <ol><li> Riempire un contenitore metallico superficiale medie dimensioni con ghiaccio tritato, invertire in un grande contenitore di vetro con ghiaccio, e aggiungere ulteriori ghiaccio lasciando solo la superficie di fondo del contenitore metallico esposto. Mettere un tovagliolo di carta bagnato sul fondo metallico esposto per consentire il trasferimento anche termico. </li><li> Prendete un piatto MatTek controllo siRNA-trattati (campione 1) e posizionarlo sul freddo umido tovagliolo di carta. Aspirare delicatamente tutti i media e lavare 3 volte con il freddo Ca 2 + senza DMEM. Dopo l&#39;ultimo lavaggio, aspirare via tutti i supporti nel piatto. </li><li> Per immagine associata alle cellule FM1-43 in cellule senza SLO ferimento (Esempio 1) in presenza di Ca 2 +, aggiungere 180 ml ​​di soluzione fredda B al vetro coprioggetto centro del piatto inferiore 35 mm vetro e incubare per 5 min in ghiaccio (Tabella 1). </li&gt; <li> Posizionare piatto MatTek sulla scena di un microscopio confocale riscaldato a 37 ° C e dotato di una camera climatica (che mantiene la temperatura, l&#39;umidità e CO 2 livelli). Trovare il campo di celle che verrà creata l&#39;immagine guardando attraverso un 40X NA 1.3 obiettivo (Nikon). Se disponibile, attivare PerfectFocus o un dispositivo simile per correggere la deriva termica. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione A preriscaldata delicatamente al lato del piatto 35 mm e rimettere il coperchio della camera ambientale (Tabella 1). </li><li> Acquisire immagini per 4 min a 1 fotogramma ogni 3 secondi utilizzando il software di imaging appropriato (Volocity del sistema di filatura di microscopia confocale disco UltraView Vox Perkin Elmer). Eccitazione FM1-43 è realizzato con una linea laser 488 nm usando un filtro dicroico con un passa banda 488 nm, e la discriminazione di emissione è ottenuta attraverso l&#39;uso di un filtro 527 (W55) emissione. Livelli di potenza del laser e la sensibilità della fotocamera sono impostate per ottenere esposizioni di immagine di 100 msec. </li><li> Ripetere i punti da 3.2 a 3.6 per rilevare FM1-43 in cellule siRNA-trattate controllo senza ferita SLO (Esempio 2) in assenza di Ca 2 +, salvo che al punto 3.5 Soluzione B dovrebbe essere aggiunto (Tabella 1). </li><li> Per misurare FM1-43 afferisce nelle cellule di controllo siRNA-trattati con feriti SLO sia in presenza (Esempio 3) o assenza di Ca 2 + (Esempio 4), aggiungere 180 ml ​​di soluzione fredda B contenenti SLO al vetro coprioggetto centro 35-mm piatto fondo di vetro e incubare per 5 minuti sul ghiaccio come nella fase 3.3. Ripetere i passi 3.2 tramite 3.6; regolare l&#39;aggiunta di uno o Soluzione A Soluzione B nella fase 3.5 (Tabella 1). </li><li> Per determinare il ruolo di ASM nel plasma di riparazione della membrana, ripetere i passaggi 3,2-3,6 utilizzando cellule trattate con siRNA ASM per tutte le condizioni (campioni 5-8) (Tabella 1). </li><li> Per determinare il ruolo di sfingomielinasi extracellulare ricombinante (SM) sulcinetica di riparazione della membrana plasmatica (riflessi dalla inibizione in FM1-43 afflusso) (Campioni 9-10), SM viene aggiunto (0-50 μU) a uno o Soluzione A Soluzione B al punto 3.5 e quindi aggiunti alle cellule durante cellule vive rappresentazione in un volume totale di 1 ml (Tabella 1). </li></ol> 4. Quantificazione dei FM1-43 Afflusso in cellule <ol><li> Dopo il film sono stati acquisiti, misurare l&#39;intensità di fluorescenza intracellulare di FM1-43 utilizzando il software di analisi di immagine (Volocity Suite, PerkinElmer). Prelievo di una regione di interesse nella regione citosolica di ciascuna cella nel campo e applicare gli strumenti software per determinare la media FM1-43 intensità di fluorescenza in tutte le strutture del video. </li><li> Per regolare le variazioni di iniziale FM1-43 colorazione, i dati per ciascun video vengono espressi come fold aumento di intensità di fluorescenza nel tempo, e tracciate per ciascuna delle diverse condizioni. L&#39;aumento piega in fluorescenza di ciascun tempo di valutazione percella viene calcolato come F T / F 0, dove F T è la fluorescenza media al timepoint specifico, e F 0 è la fluorescenza media a T = 0 (figure 1-2). </li></ol>

<ol><li>Heilbrunn, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeilbrunn%2C+L+%22The+dynamics+of+living+protoplasm%22">The dynamics of living protoplasm</a>. , Academic Press. (1956).</li>
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<li>Tam, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis+of+acid+sphingomyelinase+by+wounded+cells+promotes+endocytosis+and+plasma+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair.</a> J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).</li>
<li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J. Vis. Exp. (52), e2717(2011).</li>
<li>Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol-dependent+cytolysins%2C+a+family+of+versatile+pore-forming+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins.</a> Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).</li>
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<li>Buckley, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+three+membranes.+Channel+formation+by+aerolysin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin.</a> FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).</li>
<li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Aeromonas+toxin+proaerolysin+in+its+water-soluble+and+membrane-channel+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states.</a> Nature. 367, 292-295 Forthcoming.</li>
<li>Yamaji-Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+and+pore+formation+of+a+sphingomyelin-specific+toxin%2C+lysenin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin.</a> J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Studi precedenti sul pregiudizio e la membrana plasmatica riparazione meccanica invocati diversi meccanismi delle cellule feriti, che vanno dalla caduta perle di vetro, micropipetting, tranciatura, graffiare o raschiare. La lettura di tutti questi saggi era più qualitativa che quantitativa, e non dare informazioni precise sulla cinetica del meccanismo di riparazione. La capacità delle cellule di richiudere loro membrana plasmatica dopo queste forme di lesioni è stata misurata dalla presenza o assenza di rivelatori aggiu...

E &#39;noto da diversi decenni riparazione della membrana plasmatica dopo una lesione meccanica è un 1,2 Ca 2 +-dipendente processo. Studi successivi hanno mostrato che Ca 2 + afflusso attraverso la ferita innesca un vigoroso processo di esocitosi di vescicole intracellulari al sito della lesione, che è richiesto per richiusura 3,4. Il tasso di perdita di un colorante fluorescente caricato nel citoplasma delle cellule è stato utilizzato per valutare la velocità di riparazione, concludendo che richiusura è stato completato entro &lt;30 sec dopo la lesione 5. Due modelli sono stati inizialmente proposti per spiegare il requisito di esocitosi nella riparazione membrana plasmatica: 1) il modello &quot;patch&quot;, che suggerisce che Ca 2 + afflusso attraverso la lesione innesca fusione inizialmente omotipica di vescicole intracellulari, formando una grande &quot;patch&quot; che sarebbe poi essere applicato alla membrana plasmatica di richiudere la ferita 6 e 2) il modello di riduzione della tensione, che propone di membrana Added entro Ca 2 +-dipendente esocitosi in prossimità della ferita ridurrebbe tensione della membrana plasmatica, facilitando richiusura del doppio strato 7. Il ruolo di Ca 2 +-triggered esocitosi nel plasma di riparazione della membrana è stata ulteriormente rafforzata da studi che dimostrano che i lisosomi contengono una molecola di Ca 2 + sensore, synaptotagmin VII, che facilita il loro esocitosi e plasma riparazione della membrana in cellule danneggiate 8,9,10,11 . Tuttavia, ulteriori elementi di prova ha indicato che solo esocitosi non era sufficiente a promuovere la riparazione della membrana plasmatica. Oltre alle rotture meccaniche sulla membrana plasmatica, una forma frequente di danno cellulare è permeabilizzazione da tossine formanti pori prodotte da batteri o cellule immunitarie 12,13 14,15. Diversamente lacrime meccanici, proteine ​​formanti pori si inseriscono sulla membrana plasmatica formando una stabile, poro proteina-allineato che non può essere richiuso semplicemente applicando una &quot;patch&quot; membrana o da riduzioneing tensione della membrana. Curiosamente, studi hanno rivelato che le cellule di mammifero hanno un meccanismo efficace per riparare la membrana plasmatica dopo permeabilizzazione con proteine ​​formanti pori, e questo processo richiede anche la presenza di Ca 2 + extracellulare 12. Questa scoperta ha sollevato la questione se la rimozione dei pori transmembrana dalla superficie cellulare era anche un processo rapido, come osservato con ferite meccaniche 5. Sorprendentemente, i nostri studi recenti rivelato che la richiusura delle cellule permeabilizzate con tossine formanti pori ha proprietà molto simili alla riparazione di ferite meccaniche: il processo richiede Ca 2 + extracellulare, e completata entro ~ 30 sec. Indagare questo processo più in dettaglio, abbiamo recentemente appreso che, oltre a Ca 2 + esocitosi regolata dei lisosomi, riparazione membrana plasmatica comporta una rapida forma di endocitosi, che viene attivato dal rilascio dell&#39;enzima lisosomiale sfingomielinasi acida (ASM) ed è essenziale non solo per the rimozione dei pori transmembrana, ma anche per la riparazione di ferite meccaniche 16. Per determinare la cinetica di una nuova chiusura cellule dopo permeabilizzazione con le proteine ​​formanti pori, nel nostro laboratorio abbiamo adattato una metodologia di imaging dal vivo che era stato precedentemente utilizzato per valutare la richiusura delle fibre muscolari isolate infortunato laser 17. Questo test si basa sulle proprietà del colorante lipofilo FM1-43, che si intercala stabilmente nel foglietto esterno di bistrati lipidici crescente di intensità di fluorescenza. Quando la membrana a doppio strato plasma viene perturbato extracellulari guadagni tinture accesso alle membrane intracellulari, fornendo un saggio sensibile per rilevare lesioni membrana plasmatica e riparare 18,16,19,20. Per adattare questo test per la valutazione della richiusura cellule dopo permeabilizzazione con le proteine ​​formanti pori, abbiamo le cellule pre-incubate a 4 ° C con la tossina batterica streptolisina O (SLO), che si lega al colesterolo di membrana 21. Cell sincronopermeabilizzazione può quindi essere facilmente ottenuto spostando le celle da ghiaccio per riscaldare medie in una fase microscopio riscaldata, che attiva l&#39;oligomerizzazione e cambio di conformazione che porta alla formazione di pori transmembrana. Un vantaggio di questo approccio, nei saggi precedentemente pubblicati utilizzando ferimento laser, è che un numero maggiore di cellule possono essere analizzati simultaneamente in un campo microscopico, fornendo una migliore campionamento della popolazione cellulare. Date le similarità meccanicistiche tra il processo richiusura cellulare visto dopo l&#39;infortunio meccanica e permeabilizzazione con le tossine che formano pori, il saggio che descriviamo qui fornisce un metodo molto versatile e potente per i fattori coinvolti nel fondamentale processo di riparazione della membrana plasmatica dissezione. Come esempio, si dimostra che è possibile utilizzare questo test per identificare fasi Ca 2 + dipendenti ed indipendenti del processo di riparazione.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>HeLa 229 linea cellulare</td><td>ATCC</td><td>CCL2-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose </td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose No Calcium</td><td>Invitrogen</td><td>20168</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td></td></tr><tr><td>Optimem Reduced Serum</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di controllo Contenuto GC RNAi oligo</td><td>Invitrogen</td><td>12935300</td><td></td></tr><tr><td>SMPD1 RNAi oligo</td><td>Invitrogen</td><td>HSS143988</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino Inattivato termicamente</td><td>Gemini-Bioproducts</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Sfingomielinasi da Bacillus cereus</td><td>Sigma</td><td>S7651</td><td></td></tr><tr><td>Piastre inferiori in vetro da 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Material</td></tr><tr><td>Fliped Microscopio invertito</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C9100-50</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale a disco rotante</td><td>PerkinElmer</td><td>UltraViewVoX</td><td></td></tr><tr><td>Analisi del software software</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity Suite</td><td></td></tr><tr><td>Camera climatica</td><td>Dispositivi di patologia</td><td>LiveCell System Camera</td><td></td></tr></tbody></table>

vivere imaging test per la valutazione dei ruoli di ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; e sfingomielinasi nella riparazione di pore-formano ferite tossina

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Lesione della membrana plasmatica è un evento frequente, e le ferite devono essere rapidamente riparato per garantire la sopravvivenza cellulare. Afflusso di Ca 2 + è un evento chiave di segnalazione che attiva la riparazione di ferite meccaniche sulla membrana plasmatica entro ~ 30 sec. Recenti studi hanno rivelato che le cellule di mammifero anche richiudersi loro membrana plasmatica dopo permeabilizzazione con formazione di pori tossine in un processo 2 +-dipendente Ca che coinvolge esocitosi della sfingomielinasi acida lisosomiale seguita da pori endocitosi. Qui, descriviamo la metodologia utilizzata per dimostrare che la richiusura delle cellule permeabilizzate dalla tossina streptolisina O è anche un rapido e dipendente da Ca 2 + afflusso. Il design saggio permette la sincronizzazione dell&#39;evento lesioni e una misurazione cinetica precisa della capacità delle cellule di ripristinare l&#39;integrità della membrana plasmatica mediante imaging e quantificare la misura in cui il colorante liphophilic FM1-43 raggiunge membrane intracellulari. Questo live als testO consente una valutazione sensibile della capacità di esogenamente aggiunto fattori solubili quali sphingomyelinase inibire FM1-43 afflusso, riflettendo la capacità delle cellule di riparazione sulla membrana plasmatica. Questa analisi ha permesso di mostrare per la prima volta che sphingomyelinase agisce a valle di Ca 2 +-dipendente esocitosi, poiché extracellulare aggiunta dell&#39;enzima promuove richiusura delle cellule permeabilizzate in assenza di Ca 2 +.

Basse concentrazioni di batteri plasma sphingomyelinase (SM) salvataggio riparazione della membrana delle cellule impoverito in acido lisosomiale sphingomyelinase. Usando il test di imaging FM1-43, abbiamo precedentemente dimostrato che cellule carenti per la ASM lisosomiale ed esposte a SLO ferendo in presenza di Ca 2 + hanno una membrana plasmatica difetto viene salvato da extracellulare aggiunta dell&#39;enzima umano ricombinante 19. Poiché la ASM lisosomiale umano ha u...

Vivo imaging di cellule esposte al colorante lipofilo FM1-43 consente una determinazione precisa della cinetica con cui tossine formanti pori vengono rimossi dalla membrana plasmatica. Questo è un test sensibile che può essere utilizzato per valutare requisiti di Ca 2 +, sfingomielinasi e altri fattori sulla membrana plasmatica di riparazione.

Vivere Imaging test per la valutazione dei ruoli di Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; E sfingomielinasi nella riparazione di Pore-formano ferite Tossina

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare il colorante lipofilico FM 1-43 nell'immagine di cellule vive per misurare con precisione la cinetica di rimozione delle tossine scarsamente attive dalla membrana plasmatica. Questo viene ottenuto innanzitutto prelegando la tossina a quattro gradi Celsius. Il secondo passaggio consiste nel trasferire la piastra sullo stadio riscaldato del microscopio e individuare un piano focale in cui le cellule possano essere visualizzate.Successivamente, aggiungere il mezzo preriscaldato appropriato e iniziare immediatamente l'acquisizione delle immagini. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare e quantificare la fluorescenza intracellulare di FM 1-43. In definitiva, questo saggio sensibile può essere utilizzato per valutare i requisiti di calcio, fingal, mielina e altri fattori necessari per la riparazione della membrana plasmatica.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il danno indotto da laser, è che il saggio di permeabilizzazione SLL consente la formazione sincronizzata di lesioni della membrana plasmatica molto uniformi per dimensione una volta attivata la izzazione cellulare. L'acquisizione temporale in tempo reale dell'ingresso di coloranti lipofili permette di determinare con precisione la cinetica del ripristino della membrana plasmatica in modo sensibile e altamente riproducibile. Questo saggio è ideale per valutare l'effetto di diversi agenti, come il calcio e la F measi ricombinante, sul riparo della membrana plasmatica, eliminando la variabilità associata ad altri metodi di lesione della membrana plasmatica.Per iniziare la procedura di silenziamento trascrizionale della sfingomielinasi acida o di un oligonucleotide SM in cellule HeLa coltivate in mezzo di crescita DMEM su piastre da 35 millimetri con fondo in vetro, incubare durante la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore con 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, almeno un'ora prima di aggiungere la miscela di transfezione con IRNA, aspirare il mezzo di crescita e sostituirlo con due millilitri di mezzo DMEM con siero ridotto. Reintrodurre le cellule nell'incubatore e preparare quattro provette per la miscela di transfezione con oligonucleotidi SI RNA. La quantità indicata di reagente è riferita a ogni singola piastra da 35 millimetri da trasfettare: nelle provette A e C, aggiungere 250 microlitri di mezzo Opti-MEM con siero ridotto e quattro microlitri di Lipofectamine RNAiMAX; nella provetta B, aggiungere 250 microlitri di mezzo Opti-MEM con siero ridotto e otto microlitri o 160 picomoli di controllo; nella provetta D, aggiungere 250 microlitri di mezzo Opti-MEM con siero ridotto e otto microlitri o 160 picomoli di A-S-M-I-A. Incubare le provette a temperatura ambiente per cinque minuti.Successivamente, unire i tubi A e B per formare il complesso di trasfezione per il controllo S, irna e i tubi C e D. Per l'irna A SMS, incubare le reazioni a temperatura ambiente per 20 minuti. Dopo 20 minuti, aggiungere lentamente, goccia a goccia, ciascuna miscela di reazione di trasfezione nei rispettivi piatti in vetro da 35 millimetri. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.A 24 ore dal transfezionamento, aspirare delicatamente il mezzo e sostituirlo con mezzo di crescita DMEM fresco per un'efficiente silenziamento di A SM. Le piastre devono essere ulteriormente incubate a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per circa 31 ore, per un totale di 55 ore prima dell'acquisizione di immagini in tempo reale. I seguenti reagenti sono necessari per la microscopia su cellule vive: soluzione del tossina ricombinante formante pori streptolisina O o SLO alla concentrazione di 100 nanogrammi per microlitro in PBS freddo senza calcio e magnesio.Una soluzione madre di 25 millimolari di FM 1-43 in DMSO soluzione A, ovvero FM 1-43 diluito in DMEM freddo con calcio fino a una concentrazione finale di quattro micromolari, e soluzione B, ovvero FM 1-43 diluito in DMEM freddo senza calcio e con 10 millimolari di EGTA fino a una concentrazione finale di quattro micromolari, prima dell'acquisizione di immagini di cellule vive. Preriscaldare aliquote di un millilitro della soluzione A e della soluzione B in provette da microcentrifuga a 37 gradi Celsius. Mantenere il DMEM con calcio e il DMEM senza calcio sul ghiaccio.Iniziare i preparativi per l'immagineggiamento di cellule vive riempiendo un contenitore metallico poco profondo di medie dimensioni con ghiaccio tritato. Capovolgerlo in un contenitore di vetro grande contenente ghiaccio e aggiungere altro ghiaccio, lasciando esposta solo la superficie inferiore del contenitore metallico. Posizionare un tovagliolo di carta bagnato sulla parte metallica esposta per consentire un trasferimento termico uniforme.Posizionare una piastra di controllo da 35 millimetri con fondo in vetro su un tovagliolo di carta bagnato e freddo; aspirare delicatamente tutto il mezzo e lavare tre volte con DMEM freddo privo di calcio. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare completamente il mezzo dalla piastra per acquisire immagini del FM 1-43 associato alle cellule in assenza di danno da SLO e in presenza di calcio. Aggiungere 180 microlitri di soluzione B fredda al centro del coprivetro della piastra da 35 millimetri con fondo in vetro e incubare per cinque minuti sul ghiaccio. L'acquisizione di immagini su cellule vive viene effettuata mediante un sistema a disco rotante di microscopia confocale e il software di acquisizione appropriato.Il microscopio è dotato di una camera ambientale per mantenere costanti temperatura, umidità e livelli di anidride carbonica. Posizionare la piastra sullo stage del microscopio riscaldato a 37 gradi Celsius e riposizionare il coperchio della camera ambientale utilizzando un obiettivo con apertura numerica 40x 1,3.Individuare il campo di cellule che verrà acquisito per il successo dell'esperimento. Un modulo automatico di messa a fuoco sul microscopio per correggere la deriva termica durante l'acquisizione è essenziale, se disponibile. Attivare la messa a fuoco perfetta o un dispositivo simile per correggere la deriva termica.Ora rimuovere il coperchio della camera ambientale e aggiungere un millilitro di soluzione preriscaldata delicatamente lungo il lato della piastra da 35 millimetri. Rimettere il coperchio della camera ambientale. Impostare i parametri per l'immagine: l'eccitazione di FM 1 43 viene effettuata con una linea laser da 488 nanometri.Utilizzando un filtro dicromatico con un passaggio in banda a 488 nanometri, la discriminazione dell'emissione si ottiene impiegando un filtro di emissione a 527, impostando i livelli di potenza del laser e la sensibilità della telecamera per ottenere esposizioni delle immagini di 100 millisecondi. Acquisire immagini per quattro minuti, con un fotogramma ogni tre secondi. Lo stesso protocollo generale viene seguito per l'acquisizione in tempo reale di cellule in diverse condizioni sperimentali, con alcune modifiche come indicato in questa tabella per rilevare FM 1-43 in cellule trattate con siRNA di controllo, senza danneggiamento mediante SLO e in assenza di calcio; la soluzione B deve essere aggiunta lateralmente alla piastra da 35 millimetri dopo averla preriscaldata.Invece della soluzione A prima dell'acquisizione per misurare l'ingresso di FM 43 nelle cellule controllo trattate con siRNA ferite con SLO in presenza di calcio, aggiungere la soluzione B fredda con SLO al vetrino centrale della piastra da 35 millimetri e incubare per cinque minuti sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere la soluzione A calda alla piastra. Il trasferimento del campione sul piano microscopico caldo indurrà la formazione di pori transmembrana per misurare l'ingresso di FM 1 43 nelle cellule controllo trattate con siRNA ferite con SLO in assenza di calcio; aggiungere la soluzione B fredda con SLO al vetrino centrale della piastra da 35 millimetri e incubare per cinque minuti sul ghiaccio.Quindi aggiungere la soluzione B calda alla piastra. Per determinare il ruolo di un SM nel ripristino della membrana plasmatica, utilizzare cellule trattate con irna SM per tutte le condizioni. Infine, per determinare il ruolo delle meline ricombinanti extracellulari di bingo sulla cinetica del ripristino della membrana plasmatica, la melina di bingo viene aggiunta alla soluzione A calda o alla soluzione B, e successivamente alle cellule.Durante l'acquisizione in vivo in un volume totale di un millilitro, dopo aver registrato i filmati, si misura l'intensità di fluorescenza intracellulare di FM 1-43. Utilizzando un software di analisi delle immagini, tracciare una regione di interesse nella zona citosolica di ogni cellula nel campo e applicare gli strumenti del software per determinare l'intensità media di fluorescenza di FM 1-43. Durante tutti i fotogrammi del video, selezionare dall'elenco delle sequenze di immagini a destra il campione da quantificare, fare doppio clic sullo strumento timbro per aprire la finestra di configurazione. Finestra di dialogo timbro ROI.Per l'analisi dell'intensità, è preferibile selezionare un timbro ellittico. Le dimensioni dell'ellisse devono essere determinate empiricamente in base alle dimensioni e alla forma della cellula. Tuttavia, per la maggior parte delle cellule in coltura, un'ellisse di quattro per quattro micrometri è appropriata.È importante utilizzare un'area di interesse (ROI) delle stesse dimensioni per ogni sequenza di immagini da analizzare durante la quantificazione. Successivamente, spostare il cursore temporale fino all'ultimo punto temporale per individuare, con lo strumento timbro, il punto di massima intensità all'interno della cellula. Evidenziare un'area di interesse (ROI) per ciascuna cellula come mostrato in figura.Ora spostare il cursore temporale al punto di tempo zero, assicurandosi che l'area di interesse (ROI) rimanga all'interno della zona scelta per tutta la durata dell'acquisizione. Selezionare le misurazioni. Per iniziare la quantificazione, è ora disponibile un menu a discesa per le misurazioni. Da questo menu a discesa, selezionare "misura tutti i punti temporali".Fare nuovamente clic sul menu a discesa delle misurazioni e selezionare "crea elemento misurazione". Appare una finestra di dialogo che consente di assegnare un nome ai dati selezionando "ok"; un nuovo elemento contenente i dati appare con il nome scelto. Ripetere questa sequenza per tutte le acquisizioni.Per l'analisi dei dati, selezionare l'elemento desiderato dall'elenco a destra, quindi selezionare la scheda di analisi dalla finestra dei dati per visualizzare la voce di menu a discesa per l'analisi. Dal menu a discesa, selezionare la voce analizza e verrà visualizzata una finestra di dialogo. Nella finestra di modifica dell'analisi sono disponibili sei impostazioni.Impostare innanzitutto l'analisi in modo da limitarla a due ROI. Per la seconda casella, analizzare questi dati in cui la media deve essere evidenziata. Nella casella di riepilogo, deve essere selezionato il valore. Infine, scegliere R times per RO e name per la colonna. Dopo aver impostato questi valori, fare clic su okay per trasformare i dati in un foglio di calcolo con i valori di intensità per ogni tempo. Per ogni ROI, i dati possono anche essere visualizzati come un grafico selezionando la scheda grafico nella finestra dei dati; i dati possono ora essere esportati come file delimitato da tabulazioni da utilizzare in un programma di analisi statistica grafica a scelta dell'utente. I risultati rappresentativi degli esperimenti illustrati sono mostrati qui.L'afflusso del colorante lipofilico FM 1-43 è stato ripreso a un'immagine ogni tre secondi per quattro minuti, e la fluorescenza intracellulare di FM 1-43 è stata quantificata ed espressa come aumento multiplo dell'intensità di fluorescenza nel tempo. Questo primo grafico mostra che in assenza di calcio, sia le cellule di controllo IRNA che quelle trattate con A SMS irna erano permeabili alla SLO, indicando che un'esaurimento del SM non interferisce con la sensibilità alla tossina. Sono state analizzate da 18 a 27 cellule per ogni condizione e le barre di errore corrispondono alla media più o meno SEM.I risultati mostrati in questo prossimo grafico indicano che in presenza di calcio, le cellule trattate con S-I-R-N-A di controllo sono state in grado di richiudere la loro membrana plasmatica e arrestare l'ingresso del colorante, mentre le cellule trattate con un irna SMS non sono riuscite a richiudersi. Inoltre, l'aggiunta esogena di basse dosi di sfingomielina compensa il difetto della membrana plasmatica nelle cellule trattate con irna SMS. Sono state analizzate da 18 a 62 cellule per ogni condizione e le barre di errore corrispondono alla media più o meno SEM. Gli intervalli temporali selezionati dei filmati analizzati sono mostrati in queste immagini.È interessante notare che un recupero completo della capacità delle cellule prive di SM di richiudersi dopo l'esposizione a SLO è stato osservato con basse concentrazioni di Flonase, pari a cinque e 7,5 microunità per millilitro. All'aumentare della concentrazione enzimatica aggiunta al mezzo, si è verificata una progressiva riduzione del recupero. Le cellule con fenotipo esposte a 10 microunità per millilitro sono state solo parzialmente bloccate.L'afflusso di FM 1-43. Dopo l'esposizione a SLO, le cellule trattate con 50 micro-unità per millilitro hanno mostrato un intenso afflusso del colorante, indicativo di un difetto completo di resealing simile a quello osservato nelle cellule prive di SM. Questi risultati suggeriscono che la rimozione endocitica dei pori di SLO è strettamente regolata dai livelli di ceramide generati sulla membrana plasmatica.Quando il contenuto di mielina supera un certo livello, il processo non avviene normalmente e le cellule non riescono a rimuovere le lesioni. In modo notevole, l'aggiunta di s Flonase batterico a cellule rese permeabili mediante SLO in assenza di calcio ha ripristinato la riparazione della membrana plasmatica. Sono state analizzate da 18 a 31 cellule per ogni condizione, e le barre di errore corrispondono alla media più o meno SEM, come osservato nelle cellule esposte alla tossina formante pori in presenza di calcio esclusivamente.Concentrazioni basse di sfingomielina si sono rivelate efficaci nel bloccare l'afflusso di FM 1 43. Questi risultati indicano che Flonase agisce a valle del passaggio dipendente dal calcio nella riparazione della membrana plasmatica. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale disporre di una tossina attiva che sia stata precedentemente testata e titolata per determinare la corretta concentrazione di lavoro.Questo è importante perché cicli ripetuti di congelamento e scongelamento possono inattivare la tossina SLO. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come testare la riparabilità della membrana plasmatica delle cellule in coltura mediante un saggio basato su imaging vitale sensibile che permette una quantificazione precisa della cinetica di risigillamento in modo altamente riproducibile. Imparerai inoltre come aggiungere agenti solubili specifici alle cellule durante la procedura di imaging e valutarne l'effetto sulla riparazione della membrana plasmatica.

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