Metabolic Etichettatura e con membrana frazionamento per proteomica comparativa Analisi del

L'obiettivo generale del seguente esperimento è separare diverse sottocompartimenti della membrana e studiarne la composizione proteica differenziale. Questo viene ottenuto mediante marcatura con isotopi stabili delle cellule in diverse condizioni, al fine di consentire la differenziazione dei trattamenti. Nell'analisi spettrometrica di massa, come secondo passaggio, il materiale cellulare proveniente dai due trattamenti viene miscelato, garantendo una lavorazione congiunta e riducendo la variabilità tra campione e campione.

I successivi sottocompartimenti della membrana plasmatica vengono purificati e separati, mediante centrifugazione su gradiente di saccarosio, in sottocompartimenti sterili, ricchi e impoveriti di steroli. I risultati ottenuti mostrano abbondanze proteiche differenziali nei sottocompartimenti in seguito a diversi trattamenti, basandosi su dati di spettrometria di massa quantitativa. Il principale vantaggio di questo protocollo rispetto ai metodi esistenti, come il Western blotting, è la possibilità di registrare quantitativamente la distribuzione di migliaia di proteine nei sottocompartimenti, consentendo così di individuare nuovi candidati coinvolti nei processi di segnalazione.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la purificazione meccanica di un sistema a due fasi è difficile da apprendere. Il motivo è che il procedimento comprende numerose fasi, e un controllo preciso e un'accurata manipolazione sono estremamente importanti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione, identificando nuovi candidati proteici come regolatori di processi membranari. Iniziare coltivando colture in sospensione di cellule di arabidopsis ana marcate e non marcate, come descritto nel protocollo testuale.

Cellule omogeneizzate provenienti da circa un litro di colture in sospensione di sette giorni in azoto liquido: mescolare quantità uguali di colture cellulari congelate marcate e non marcate in base al peso fresco in un becher e aggiungere due volumi di tampone H; posizionare immediatamente il becher su un agitatore e agitare finché il materiale non è completamente scongelato e privo di ghiaccio. Filtrare l'omogenato attraverso un singolo strato di stoffa da filtro in provette da centrifuga da 250 millilitri; dopo aver bilanciato i campioni con il tampone H, centrifugare a 10.000 G per otto minuti. Al termine della centrifugazione, caricare il sopranatante in provette da ultracentrifuga pre-ralleddate con una capacità di circa 32 millilitri.

Dopo aver bilanciato i campioni con il tampone h, pellettizzare i microsomi centrifugando a 100.000 G e quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante, che contiene le proteine solubili. Una piccola quantità di questa frazione può essere conservata per ulteriori precipitazioni proteiche e successiva analisi delle proteine solubili; ri-sospendere il pellet di membrana di ciascun campione nella rispettiva quantità di tampone R come descritto nel protocollo testuale, quindi caricare sulla parte superiore del sistema bifasico U uno.

Se si utilizza il sistema bifasico da sei grammi, caricare esattamente due grammi del pellet di membrane risospeso e lo stesso volume di tampone R puro utilizzato per la risospensione del campione nel tubo U2. Mescolare lentamente i tubi U1 e U2 capovolgendoli 30 volte a una frequenza di circa un capovolgimento al secondo; centrifugare i campioni a 1500 G e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Al termine della centrifugazione, rimuovere la fase superiore da U2. Trasferire la fase superiore da U1 in U2, quindi ripetere la centrifugazione utilizzando gli stessi parametri. Successivamente, trasferire la fase superiore da U2 nei tubi per ultracentrifuga, diluire con cinque volumi di tampone R e mescolare accuratamente; centrifugare i campioni a 200.000 G e quattro gradi Celsius per un'ora.

Infine, riutilizzo. Sospendere il pellet di membrane in una piccola quantità di tampone T ed E per l'isolamento delle membrane resistenti ai detergenti. Dopo aver verificato la concentrazione della frazione di membrana plasmatica mediante saggio di Bradford, aggiungere Triton X-100 alla frazione di membrana plasmatica in un rapporto tra detergente e proteina, peso su peso, compreso tra 13 e 15, e una concentrazione finale di detergente compresa tra 0,5 e 1%. Agitare i campioni a circa 100 RPM e a quattro gradi Celsius per 30 minuti.

Quindi aggiungere tre volumi di saccarosio 2,4 molare a un volume della membrana plasmatica trattata per ottenere una concentrazione finale di saccarosio pari a 1,8 molare. Preparare il gradiente di saccarosio nei tubi per ultracentrifuga caricando le rispettive soluzioni di saccarosio sopra la frazione 1,8 molare. Centrifugare i campioni a 250.000 ×g e a quattro gradi Celsius per 18 ore. Rimuovere con attenzione i tubi dell'ultracentrifuga dal rotore per evitare di alterare la banda a bassa densità, che potrebbe essere visibile come un anello lattiginoso all'interfaccia tra saccarosio 0,15 molare e saccarosio 1,4 molare.

A volte non si vede nulla, ma la frazione proteica resistente ai detergenti è ancora presente. Rimuovere una frazione di volume pari a 0,75 millilitri dalla parte superiore del gradiente, dalle frazioni due e tre, che coprono i volumi di circa 1,5 millilitri al di sopra dell'anello interfasico e di 0,5 millilitri al di sotto dell'anello interfasico.

Rappresentano la frazione di membrana resistente ai detergenti. Raccogliere queste frazioni in provette Falcon da 15 millilitri. Le frazioni nove e dieci contengono la frazione di membrana solubile nei detergenti e possono essere raccolte anch'esse a scopo comparativo.

Per iniziare l'estrazione delle proteine dalla frazione resistente ai detergenti, aggiungere quattro volumi di metanolo alle frazioni raccolte e vortexare accuratamente. Successivamente, aggiungere un volume di cloroformio prima di vortexare nuovamente in modo accurato. Infine, aggiungere tre volumi di acqua e vortexare accuratamente; centrifugare i campioni a 2000 G per cinque minuti.

Utilizzando una centrifuga da banco, rimuovere la fase acquosa sopra lo strato proteico nell'interfase. Successivamente, aggiungere tre volumi di metanolo e vortexare. Rimuovere completamente il sopranatante S prima di prelevare il pellet per la preparazione alla digestione in soluzione.

Iniziare la digestione in soluzione sciogliendo il campione in un piccolo volume di urea sei moli, tiroidite due moli pH otto, abbreviato UTU. Utilizzare il volume più basso possibile compatibile con il campione. Dopo aver centrifugato i campioni ed eseguito la digestione come descritto nel protocollo testuale, diluire il campione con quattro volumi di tris HCl 10 millimolare pH otto.

Quindi aggiungere un microlitro di tripsina per ogni 50 microgrammi di proteina del campione, incubare tutta la notte a temperatura ambiente con agitazione costante a 700 giri al minuto, centrifugare i campioni a 4.000 ×g per 10 minuti. Infine, acidificare i campioni fino a una concentrazione finale dello 0,2% di TFA per raggiungere un pH pari a 2 aggiungendo circa un decimo del volume di acido trifluoroacetico al 2%. Per preparare le punte C18 in stadio solidificato, posizionare un disco C18 su una superficie piatta e pulita, come una piastra di Petri di plastica monouso.

Praticare un piccolo disco utilizzando un ago ipodermico con punta arrotondata e diametro di 1,5 millimetri. Il disco rimane all'interno dell'ago e può essere trasferito in una punta di pipetta. Espellere il disco dall'ago e fissarlo nel restringimento della punta di pipetta utilizzando un pezzo di silice fusa o di tubo adatto all'interno dell'ago. Condizionare una punta C18 in stadio preparando 50 microlitri di soluzione B sulla punta in stadio preparata.

Fare girare la punta in centrifuga a 2000 giri/min per due minuti. In una centrifuga da banco, equilibrare la punta della fase utilizzando 100 microlitri di soluzione a. Centrifugare la punta a 5.000 g in una centrifuga da banco. Ripetere l'equilibratura e la centrifugazione.

Caricare il campione sul disco pipettando con attenzione il campione all'interno della punta della pipetta contenente il disco. Far girare le punte nella centrifuga fino a quando tutto il volume del campione è passato attraverso il disco C 18. Lavare le punte in due ripetizioni con 100 microlitri di soluzione A. Dopo aver centrifugato le punte, raccogliere l'EIT in un nuovo tubo da reazione da 1,5 millilitro aggiungendo 40 microlitri di soluzione B e centrifugare.

Di nuovo, concentrare il campione nel velocizzatore sotto condizioni ottimali. Arrestare il processo di disidratazione quando rimane circa uno o due microlitri di liquido. Come passaggio finale, aggiungere un volume finale di nove microlitri di soluzione di sospensione Resus al campione e trasferirlo nella piastra micrometrica per l'analisi mediante spettrometria di massa.

L'arricchimento delle proteine della membrana plasmatica può essere dimostrato mediante analisi proteomica di piccole quantità di membrana plasmatica, frazioni e proteine nel fase inferiore del sistema a due fasi. La fase inferiore contiene le membrane interne della cellula. Ad esempio, proteine tipicamente note della membrana plasmatica, come le proteine chinasi recettoriali, mostrano un'alta abbondanza nella frazione della membrana plasmatica e una bassa abbondanza nella frazione della fase inferiore contenente le membrane interne.

A loro volta, le proteine note dell'apparato del reticolo endoplasmatico mostrano un'elevata abbondanza nella frazione della membrana interna e non sono state osservate nella frazione della membrana plasmatica. L'arricchimento successivo delle frazioni di membrana resistenti ai detergenti porterà, nei casi ideali, alla formazione di un anello lattiginoso di vescicole di membrana a bassa densità. Ad un'altezza pari a circa un quinto di quella del tubo, è stata riscontrata la massima abbondanza della proteina remn nelle frazioni di membrana resistenti ai detergenti o frazioni DRM, come previsto.

Al contrario, le proteine che non sono presenti nella membrana, come i microdomini di un trasportatore ABC, non mostrano un aumento dell'abbondanza nella frazione DRM. Inoltre, contaminanti tipici come una proteina mitocondriale del complesso F zero dell'ATPasi e una proteina ribosomiale del ribosoma 60S non mostrano un'abbondanza arricchita nella frazione DRM. Sebbene quantità minime possano ancora essere identificate dopo l'analisi spettrometrica di massa, i rapporti di abbondanza proteica dello stato di fosforilazione delle proteine nella membrana plasmatica, e le frazioni di colture cellulari marcate e non marcate, possono essere distinti in modo quantitativo.

I risultati tipici ottenuti dalla finestra di quantificazione MS quant dovrebbero mostrare un rapporto di intensità ionica uno a uno per la maggior parte dei peptidi identificati. I peptidi con un rapporto di intensità ionica significativamente diverso da uno a uno sono considerati diversamente regolati tra le colture cellulari marcate e non marcate, e rappresentano candidati per l'abbinamento a proteine influenzate dal trattamento applicato. Un buon controllo di qualità per confermare un'etichettatura metabolica riuscita è la coalescenza delle versioni marcate e non marcate dello stesso peptide in un unico picco durante la separazione mediante nano HPLC, come mostrato qui.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in tre giorni, dall'inizio dell'estrazione fino al caricamento del campione sullo spettrometro di massa. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come il Western Blot, al fine di rispondere ad ulteriori domande riguardo alla quantificazione di proteine bersaglio specifiche. Dopo aver visto questo video, dovremmo avere una buona comprensione di come mescolare colture cellulari vegetali marcate con isotopi stabili, di come eseguire una purificazione della membrana plasmatica mediante un sistema a due fasi e di come separare i compartimenti sub-membranari ricchi di steroli da quelli poveri di steroli.