Metabolic Etichettatura e con membrana frazionamento per proteomica comparativa Analisi del Arabidopsis thaliana Culture sospensione cellulare

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di separare diversi sottocompartimenti di membrana e studiare la loro composizione proteica differenziale. Ciò si ottiene mediante la marcatura di isotopi stabili delle cellule in diverse condizioni per consentire la differenziazione dei trattamenti. Nell'analisi spettrometrica di massa come seconda fase, il materiale cellulare dei due trattamenti viene miscelato, il che garantisce un'elaborazione congiunta e riduce la variazione da campione a campione.

Successivamente, i sottocompartimenti della membrana plasmatica vengono purificati e separati in sottocompartimenti impoveriti sterili, ricchi e sterili mediante saccarosio. Si ottengono risultati di centrifugazione in gradiente che mostrano abbondanze proteiche differenziali nei sottocompartimenti sottoposti a diversi trattamenti sulla base dei dati della spettrometria di massa quantitativa. Il vantaggio principale di questo protocollo rispetto ai metodi esistenti, come il Western blotting, è che possiamo registrare quantitativamente la distribuzione sottocompartimentale di migliaia di proteine e quindi scoprire nuovi candidati per i processi di segnalazione.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la purificazione di un sistema a due fasi è difficile da imparare. La ragione di ciò è che comporta molti passaggi e il controllo preciso e la gestione accurata sono molto importanti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione scoprendo nuovi candidati proteine come regolatori dei processi di membrana Inizia coltivando colture di sospensioni cellulari di arabidopsis e non marcate come descritto nel protocollo di testo.

Le cellule omogeneizzate provenienti da circa un litro di colture cellulari in sospensione di sette giorni in azoto liquido mescolano le stesse quantità di colture cellulari congelate marcate e non marcate in base al peso fresco in un becher e aggiungono due volumi di tampone H, posizionano immediatamente il becher su uno shaker e agitano fino a quando il materiale non si scioglie e non è ghiacciato. I cristalli filtrano l'omogeneizzato attraverso uno strato di tessuto a specchio in provette da centrifuga da 250 millilitri dopo aver bilanciato i campioni con la centrifuga tampone H a 10.000 Gs per otto minuti. Dopo la centrifugazione, caricare la stecca in provette da ultra centrifuga pre-raffreddate con un volume di circa 32 millilitri.

Dopo aver bilanciato i campioni con il tampone h pellet, i microsomi centrifugano a 100, 000 Gs e quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo la centrifugazione rimuovere il surnatante, il surnatante contiene proteine solubili. Una piccola quantità di questa frazione può essere conservata per un'ulteriore precipitazione delle proteine e la successiva analisi delle proteine solubili sospende il pellet di membrana di ciascun campione nella rispettiva quantità di tampone R come descritto nel caricamento del protocollo di testo sulla parte superiore del sistema U uno a due fasi.

Se si utilizza il sistema bifase da sei grammi, caricare esattamente due grammi di pellet a membrana risoluta per caricare lo stesso volume di tampone puro R utilizzato per la sospensione di reus del campione su U2. Mescolare lentamente le provette U-1 e U2 capovolgendole 30 volte a circa un'inversione al secondo, centrifugare i campioni a 1500 Gs e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere la fase superiore da U2. Trasferire la fase superiore da U uno a U2 prima di ripetere la centrifugazione utilizzando gli stessi parametri. Successivamente, spostare la fase superiore dall'U2 nelle provette da ultracentrifuga, diluire con cinque volumi di tampone R e miscelare accuratamente i campioni, centrifugare i campioni a 200.000 Gs e quattro gradi Celsius per un'ora.

Infine, il riutilizzo. Sospendere il pellet della membrana in una piccola quantità di tampone T ed E per isolare le membrane resistenti ai detergenti. Dopo aver controllato la concentrazione della frazione della membrana plasmatica mediante il saggio di Bradford, aggiungere Triton X 100 alla frazione della membrana plasmatica con un rapporto tra detergente e proteine, un rapporto peso/peso compreso tra 13 e 15 e una concentrazione finale del detergente compresa tra 0,5 e 1%Agitare i campioni a circa 100 giri/min e quattro gradi Celsius per 30 minuti.

Quindi aggiungere tre volumi di saccarosio molare 2,4 a un volume della membrana plasmatica trattata per ottenere una concentrazione finale di saccarosio di 1,8 molari. Preparare il gradiente di saccarosio in provette da ultracentrifuga caricando le rispettive soluzioni di saccarosio sopra la frazione molare di 1,8 Centrifugare i campioni a 250.000 GS e quattro gradi Celsius per 18 ore. Rimuovere con cautela le provette per ultracentrifuga dal rotore per evitare l'interruzione della banda a bassa densità, che può essere visibile come un anello lattiginoso all'interfaccia tra 0,15 molari e 1,4 molari di saccarosio.

A volte non si vede nulla, ma la frazione proteica resistente ai detergenti è ancora lì. Rimuovere una frazione di 0,75 millilitri di volume dalla parte superiore del gradiente, le frazioni due e tre, che coprono i volumi di circa 1,5 millilitri sopra l'anello di interfase. E 0,5 millilitri sotto l'anello di interfase.

Rappresenta la frazione della membrana resistente ai detergenti. Raccogli queste frazioni in tubi Falcon da 15 millilitri. Le frazioni nove e 10 contengono la frazione di membrana solubile in detergente e possono anche essere raccolte per il confronto.

Per iniziare l'estrazione delle proteine dalla frazione resistente ai detergenti, aggiungere quattro volumi di metanolo alle frazioni raccolte e vorticare accuratamente. Quindi aggiungere un volume di cloroformio prima di agitare di nuovo a fondo. Infine, aggiungere tre volumi d'acqua e centrifugare accuratamente i campioni a 2000 Gs per cinque.

Utilizzando una centrifuga da banco, rimuovere la fase acquosa sopra lo strato proteico nell'interfase. Quindi, aggiungi tre volumi di metanolo e vortice. Rimuovere accuratamente il surnatante S prima di aspirare il pellet Per prepararsi alla digestione in soluzione.

Iniziare la digestione in soluzione sciogliendo il campione in un piccolo volume di urea a sei molari, due molari della tiroide, pH otto, abbreviato UTU. Utilizzare un volume il più basso possibile che sia compatibile con il campione. Dopo aver centrifugato i campioni ed eseguito la digestione come descritto nel protocollo di testo, diluire il campione con quattro volumi di tris HCL PH otto da 10 millimolari.

Quindi aggiungere un microlitro di tripsina per 50 microgrammi di proteine del campione, incubare per una notte a temperatura ambiente con agitazione costante a 700 giri/min, centrifugare i campioni a 4.000 GS per 10 minuti. Infine, acidificare i campioni alla concentrazione finale di TFA dello 0,2% per raggiungere il pH due aggiungendo circa un decimo volume di acido trifluoroacetico al 2%. Per produrre punte di stadio C 18, posizionare un disco mour C 18 su una superficie piana e pulita, ad esempio una capsula di Petri in plastica usa e getta.

Perforare un piccolo disco utilizzando un ago ipodermico a punta smussata con un diametro di 1,5 millimetri. Il disco si incastra nell'ago e può essere trasferito in un puntale per pipetta. Estrarre il disco dall'ago e fissarlo nella rastremazione di una punta per pipette utilizzando un pezzo di silice fusa o un raccordo per tubo all'interno dell'ago, condizionare una punta dello stadio C 18 posizionando 50 microlitri di soluzione B sulla punta dello stadio preparata.

Far girare la punta nella centrifuga a 2000 giri/min per due minuti In una centrifuga da banco, equilibrare la punta dello stadio utilizzando 100 microlitri di soluzione a. Centrifugare la punta a 5.000 GS in una centrifuga da banco. Ripetere l'equilibrio e la centrifuga.

Caricare il campione sul disco pipettando con cura il campione nel puntale della pipetta con il disco all'interno. Far girare le punte nella centrifuga fino a quando l'intero volume del campione passa attraverso il disco C 18. Lavare le punte dello stadio due volte con 100 microlitri di soluzione A.Dopo aver girato le punte nella centrifuga, raccogliere l'EIT in una provetta di reazione fresca da 1,5 millilitri a 40 microlitri di soluzione B e centrifugare.

Anche in questo caso, concentrare il campione nello speed vac in condizioni ideali. Interrompere il processo di disidratazione quando rimangono solo uno o due microlitri di liquido. Come passaggio finale, aggiungere un volume finale di nove microlitri di soluzione di sospensione Resus al campione e trasferirlo sulla piastra di microtitolazione per l'analisi della spettrometria di massa.

L'arricchimento delle proteine della membrana plasmatica può essere dimostrato dall'analisi proteomica di piccoli eloqua della membrana plasmatica, frazioni e proteine nella fase inferiore del sistema a due fasi. La fase inferiore contiene le membrane interne della cellula. Ad esempio, le proteine della membrana plasmatica tipicamente note, come le proteine chinasi recettoriali, hanno mostrato un'elevata abbondanza nella frazione di membrana plasmatica e una bassa abbondanza nella frazione di fase inferiore contenente le membrane interne.

A loro volta, le proteine note del reticolo endoplasmatico mostrano un'elevata abbondanza nella frazione di membrana interna e non sono state osservate nella frazione di membrana plasmatica. Il successivo arricchimento di frazioni di membrana resistenti ai detergenti porterà, in casi ideali, alla formazione di un anello lattiginoso di vescicole di membrana a bassa densità. A circa un quinto dell'altezza del tubo, la più alta abbondanza di proteina residua è stata trovata nella membrana resistente ai detergenti o nelle frazioni DRM, come previsto.

Al contrario, le proteine che non sono presenti nella membrana, i micro domini come un trasportatore A, b, C non mostrano un aumento dell'abbondanza nella frazione DRM. Inoltre, i contaminanti tipici come una proteina mitocondriale del complesso A TPAs F zero e la proteina ribosomiale del ribosoma 60 s non mostrano un'abbondanza arricchita nella frazione DRM. Sebbene sia ancora possibile identificare quantità minime dopo l'analisi spettrometrica di massa, è possibile distinguere quantitativamente i rapporti di abbondanza proteica dello stato di fosforilazione delle proteine nella membrana plasmatica, le frazioni di colture cellulari marcate e non marcate.

I risultati tipici della finestra di quantificazione quantitativa MS dovrebbero mostrare un rapporto di intensità ionica di uno a uno per la maggior parte dei peptidi identificati. I peptidi con un rapporto di intensità ionica significativamente diverso da uno a uno sono considerati regolati in modo differenziale tra la coltura cellulare marcata e non marcata e sono candidati per la corrispondenza con le proteine interessate dal trattamento applicato. Un buon controllo di qualità del successo della marcatura metabolica è la coalizione di entrambe le versioni peptidiche marcate e non marcate come un singolo picco nella separazione nano HPLC, come mostrato qui.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni dall'inizio dell'estrazione fino al caricamento del campione sullo spettrometro di massa. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il Western Belt per rispondere a ulteriori domande sulla supplica di specifiche proteine bersaglio. Quindi, dopo aver visto questo video, dovremmo avere una buona comprensione di come mescolare colture cellulari vegetali marcate con isotopi stabili, come eseguire una purificazione della membrana plasmatica su un sistema a due fasi e come separare i sottocompartimenti della membrana sterili ricchi da quelli sterili impoveriti.