Name: Crescita di misura e di espressione genica Dinamica di tumore-mirata S. Typhimurium Batteri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Scopri la dinamica di crescita e espressione genica di S. Typhimurium attenuato in tumori murini mediante imaging bioluminescente IVIS e conteggio colonie. Questo metodo consente di monitorare in tempo reale le terapie batteriche in oncologia.

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Ringraziamo H. Fleming per la lettura critica e la modifica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato Misrock (TD) e NDSEG Graduate Fellowship (AP). BNS è un investigatore HHMI.

1. Preparazione delle cellule <ol><li> Linee cellulari passaggio utilizzando tecniche standard di coltura cellulare. In questo esperimento, abbiamo utilizzato OVCAR-8 (NCI DCTD Tumore Repository, Frederick, MD). Coltivare le cellule a un target confluenza di 80 - 100%. </li><li> Incubare le cellule con 5 ml di tripsina per 5 minuti, quindi aggiungere 5 ml di terreno RPMI + FBS per inattivare la tripsina. </li><li> Celle di raccolta e di contare su un emocitometro. Risospendere in rosso fenolo-DMEM privo bersaglio ad una concentrazione di 5 x 10 7 cellule / ml, o circa 200 pl per bombola. </li><li> Aggiungere 15% ridotta del fattore di crescita Matrigel (BD Biosciences) e mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio fino all&#39;impianto. </li></ol> 2. Impianto del tumore <ol><li> Anestetizzare 4 settimane vecchia femmina Ncr / Nu topo, utilizzando 3% isoflurano e attendere circa 5 minuti per garantire l&#39;anestesia profonda. Utilizzare vet unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Caricare le cellule (100 microlitri per tumore) in una siringa da 1 ml e allegare un 27 1/ 2 ago calibro. </li><li> Per ciascuno dei due siti di iniezione fianchi posteriori bilaterali, sollevare delicatamente la pelle con una pinza per fare una tenda e iniettare le cellule alla base. Fare attenzione a non penetrare troppo in profondità, producendo sangue. Utilizzare le pinzette per rimuovere delicatamente la siringa senza spruzzi. </li><li> Monitorare la crescita del tumore al giorno per 10-20 giorni fino a un diametro del tumore di 2 - viene raggiunto da 4 mm. </li></ol> 3. Batteri Preparazione <ol><li> Avviare una cultura durante la notte di batteri in 3 ml di LB + ampicillina multimediale da un -80 C magazzino congelatore o piastra refrigerata. In questo esperimento, abbiamo utilizzato S. typhimurium ceppo ELH430 (SL1344 PhoPQ-Aroa-). </li><li> La mattina, diluire la cultura 1:100 in LB filtrata e crescere per OD600 0,4-0,6. </li><li> Spin down e lavare 3 volte in tampone fosfato salino (PBS) e risospendere ad una finale OD600 di 0,1 (circa 1 x 10 7 cellule / ml). </li></ol> 4. Batteri Iniezione <ol><li> Anestetizzare l&#39;animale unposizione d su un lato con la coda rivolta verso la mano dominante. Utilizzare vet unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Dilatare la vena caudale utilizzando acqua calda o una lampada di calore. </li><li> Caricare i batteri (100 microlitri per topo) in una siringa da 1 ml e piegare la punta poco meno di 90 gradi. </li><li> Allineare la punta della siringa con la vena della coda, penetrare a bassa profondità (dovrebbe sentire alcuna resistenza), e iniettare batteri. Osservare lo spostamento flusso sanguigno per una iniezione di successo. </li></ol> 5. Topo Imaging <ol><li> Anestetizzare gli animali nella camera di induzione quindi posizionare ogni mouse sulla piattaforma di imaging. Utilizzare vet unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Mantenere il posizionamento preciso per garantire risultati quantitativi tra i punti di tempo. </li><li> Animali immagine utilizzando il sistema di imaging Spectrum IVIS (Caliper Life Sciences). Se l&#39;imaging più di 1 animale, luogo fotocellule tra di loro per evitare cross-illuminazione. Animali dovrebbero essere ripreso prima sul lato ventrale per confermare la localizzazione di batteri. </li><li> Animali Immagine dorsalmente con IVIS ogni 2 ore per la durata dell&#39;esperimento (36 ore). Generare un corso di tempo per un dato ROI. </li></ol> 6. Quantificare Biodistribuzione batterica <ol><li> Euthanize animali utilizzando CO 2 e posto sul retro su un pannolino assorbente. </li><li> Girare l&#39;animale per esporre i due tumori posteriori fianco sottocutanei. Tagliare il tessuto della pelle circostante per separare e rimuovere i tumori. Tenendo il tumore con una pinzetta, togliere la pelle con un movimento a forbice rovesciata. Quando la maggior parte della pelle è stata separata, rimuovere completamente il tumore usando pinzette. </li><li> Posizionare gli organi in provette da microcentrifuga pre-pesati. Poiché la massa di questi tubi può variare significativamente è importante per loro pre-pesare per risultati quantitativi. </li></ol> 7. Quantificare Biodistribuzione batterica <ol><li> Per ogni punto, accise e pesare i tumori. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di PBS + 15% glicerolo e omogeneizzare con un tessuto-Tearor (BioSpec). Sciacquare l&#39;omogeneizzatore 3 volte con etanolo tra i campioni. </li><li> Generare diluizioni seriali e piastra per il conteggio delle colonie batteriche. Per piastra diluizioni multiple su un&#39;unica piastra Usare piatti pre-sezionati. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Utilizzando questa procedura, siamo in grado di generare corsi di tempo per la crescita e la dinamica di espressione genica dei batteri colonizzano i tumori. Mentre queste misurazioni sono eseguite di routine in vitro in coltura batch o dispositivi microfluidici, sono molto più difficili da eseguire in vivo. Ci sono diverse modifiche che possono essere applicate a questi metodi. Mentre abbiamo utilizzato la linea cellulare OVCAR-8 per generare nostri modelli murini, un cert...

La biologia sintetica è progredita rapidamente nel corso degli ultimi dieci anni ed è ora posizionato a impatto dei problemi importanti nella energia e salute. Tuttavia, l&#39;espansione in ambito clinico è stato rallentato da problemi di sicurezza e l&#39;assenza di sviluppo di criteri di progettazione per circuiti genetici in vivo. Accelerare le applicazioni mediche di grande impatto richiede metodi che si interfacciano direttamente con infrastrutture mediche, circuiti genetici che funzionano al di fuori del setting di laboratorio controllato, e padroni di casa microbici sicuri e clinicamente accettato che utilizza. Un numero di ceppi sono state studiate per la terapia del cancro a causa della loro capacità di crescere preferenzialmente nei tumori. Questi hanno incluso C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, e S. typhimurium 3-8. S. typhimurium ha generato particolare interesse come hanno esibito la sicurezza e la tolleranza in un certo numero di prove cliniche umane 9-12. Questi batteriologiche<html> un stati inizialmente mostrati per creare effetti antitumorali attraverso la stimolazione del sistema immunitario dell&#39;ospite e dalla deplezione di sostanze nutritive necessarie per il metabolismo delle cellule del cancro. Produzione di merci terapeutico è stato poi aggiunto attraverso modificazioni genetiche. Mentre questi studi rappresentano importanti progressi nell&#39;uso di batteri per le terapie tumorali, la maggior parte degli sforzi esistenti hanno fatto affidamento su un&#39;espressione di alto livello, che in genere si traduce nella fornitura di alti dosaggi, effetti off-target, e lo sviluppo di resistenza dell&#39;ospite 13-16 . Ora, la biologia sintetica può aggiungere la produzione del carico programmabile utilizzando circuiti genetici computazionalmente-progettati in grado di eseguire il rilevamento avanzate e di consegna 17-20. Questi circuiti possono essere progettati per agire come sistema di consegna che rilevano gli stimoli tumore-specifici e di auto-regolare la produzione di merci, se necessario. Tuttavia, studiando la funzione di questi circuiti in vivo è stato quindi finora impegnativo. ve_content &quot;&gt; Dal plasmidi sono il quadro di riferimento comune per i circuiti sintetici, si descrive un metodo per caratterizzare la dinamica di espressione genica plasmide-based in vivo, utilizzando un modello di topo. Questi metodi utilizzano time-lapse luminescenza imaging e misurazione quantitativa di biodistribuzione. Insieme, questi approcci forniscono un quadro per studiare le reti basate plasmide in vivo per applicazioni cliniche.

<table><tbody><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina da 3/10 cc</td><td>BD Biosciences</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>Ago PrecisionGlide </td><td>BD Biosciences</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X), liquido, con L-glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Brodo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani brodo</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr></tbody></table>

crescita di misura e di espressione genica dinamica di tumore-mirata<em&gt; s. typhimurium</em&gt; batteri

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

L&#39;obiettivo di questi esperimenti è generare dati quantitativi di andamento sulla crescita e la dinamica di espressione genica di S. attenuato typhimurium colonie batteriche che crescono all&#39;interno dei tumori. Abbiamo generato tumori trapiantati in topi modello per iniezione sottocutanea di una linea cellulare di carcinoma ovarico umano, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumore Repository, Frederick, MD). Abbiamo trasformato ceppi attenuati di S. batteri typhimurium (ELH430: SL1344 phoPQ-1) con una luciferasi costitutivamente espresso (luxCDABE) plasmide per la visualizzazione 2. Questi ceppi specificamente colonizzano tumori rimanendo essenzialmente non virulento al mouse 1. Una volta tumori misurabili sono stati stabiliti, i batteri sono stati iniettati per via endovenosa attraverso la vena della coda con diversi dosaggi. Tumore localizzato, espressione del gene batterico è stata monitorata in tempo reale nel corso di 60 ore utilizzando unnel sistema di imaging in vivo (IVIS). Ad ogni tempo, i tumori sono stati asportati, omogeneizzato, e piastrate per quantificare colonie batteriche per la correlazione con i dati di espressione genica. Insieme, questi dati produce una misura quantitativa della crescita in vivo e la dinamica di espressione genica dei batteri in crescita all&#39;interno dei tumori.

Usando questo protocollo, siamo in grado di generare dati sulla crescita in vivo e la dinamica di espressione genica dei batteri mirati tumorali. Il flusso di lavoro generale è riassunto in Figura 1. Nella prima fase, abbiamo iniettare batteri (verde) e l&#39;immagine dell&#39;animale utilizzando IVIS per misurare l&#39;espressione genica con luminescenza (blu) come reporter. Poi, nella seconda fase, abbiamo accise, omogeneizzare, e tumo...

L&#39;obiettivo di questi esperimenti è generare dati quantitativi di andamento sulla crescita e la dinamica di espressione genica di attenuato<em&gt; S. typhimurium</em&gt; Colonie batteriche che crescono all&#39;interno dei tumori. Questo video illustra la preparazione delle cellule tumorali e l&#39;impianto, la preparazione e l&#39;iniezione di batteri, imaging intero animale luminescenza, l&#39;asportazione del tumore, e la colonia batterica conteggio.

Crescita di misura e di espressione genica Dinamica di tumore-mirata<em&gt; S. Typhimurium</em&gt; Batteri

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è studiare la dinamica dell'espressione genica in vivo di batteri S tyrian che crescono all'interno di tumori. Innanzitutto, in un modello murino di xenotrapianto tumorale, i batteri vengono iniettati per via endovenosa attraverso la vena della coda. I batteri colonizzano il tumore e crescono in modo esponenziale, mentre l'espressione genica viene visualizzata mediante l'utilizzo di reporter luminiscenti.L'analisi dell'immagine bioluminescente dell'intero animale viene eseguita utilizzando il sistema di imaging IVUS. Nel corso di 24-48 ore vengono acquisite una serie temporale di immagini IVUS. Questa serie di immagini viene correlata ai conteggi di colonie ottenuti omogeneizzando e seminando i tumori.Complessivamente, questi dati ci permettono di misurare quantitativamente l'espressione genica e la dinamica delle popolazioni di batteri mirati al tumore in vivo, in tempo reale, durante il passaggio della preparazione cellulare, utilizzando linee cellulari e tecniche standard di coltura cellulare. In questo esperimento, abbiamo utilizzato cellule ocar otto, cellule gross, fino a raggiungere una confluenza bersaglio dell'80-100%. Raccogliere

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I batteriofagi (fagi), virus che infettano i batteri, sono parte integrante del microbioma intestinale. Sebbene questi abitanti simbiotici guidino la fitness batterica e le dinamiche di popolazione, si sa poco su come influiscono sull'omeostasi intestinale e sulle malattie. Questo protocollo studia i fagi T4 isolati all'interno di un modello murino, adattabile ad altre coppie fago-batterio.

Interazione tra batteriofago T4 ed E. coli nell'intestino murino: un modello prototipico per lo studio delle dinamiche ospite-batteriofago in vivo

Scopri la dinamica di crescita e espressione genica di S. Typhimurium attenuato in tumori murini mediante imaging bioluminescente IVIS e conteggio colonie. Questo metodo consente di monitorare in tempo reale le terapie batteriche in oncologia.

Crescita di misura e di espressione genica Dinamica di tumore-mirata

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