Crescita di misura e di espressione genica Dinamica di tumore-mirata S. Typhimurium Batteri

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di studiare le dinamiche di espressione genica in vivo dei batteri S tyrian che crescono all'interno dei tumori. In primo luogo in un modello di cancro di xenotrapianto di topo, i batteri vengono iniettati per via endovenosa dalla vena caudale. I batteri colonizzano il tumore e crescono in modo esponenziale mentre l'espressione genica viene visualizzata utilizzando reporter luminescenti.

L'imaging a bioluminescenza dell'intero animale viene eseguito utilizzando il sistema di imaging dello spettro IVUS. Nell'arco di 24-48 ore viene effettuato un ciclo di immagini IVUS. Questa serie di immagini è correlata alla conta delle colonie generata dall'omogeneizzazione e dalla placcatura dei tumori.

Insieme, questi dati ci permettono di misurare quantitativamente l'espressione genica e la dinamica della popolazione di batteri bersaglio per il tumore in vivo nel passaggio della preparazione delle cellule in tempo reale, linee cellulari utilizzando tecniche standard di coltura cellulare. In questo esperimento, abbiamo utilizzato ocar otto cellule grosse per una cofluenza target compresa tra l'80 e il 100% Raccogliere e contare le cellule su un emo, citometro, resus, sospensione e DMEM privo di rosso fenolo a una concentrazione target di cinque volte 10 per sette cellule per millilitro, o circa 200 microlitri per pallone. Aggiungere il matrigel con fattore di crescita ridotto del 15% e mantenere la sospensione cellulare su ghiaccio fino all'impianto del tumore.

Anes ha anestetizzato topi nudi femmine di quattro settimane utilizzando il 3% di fluoro. Caricare le cellule da 100 microlitri per tumore in una siringa da un mulino e collegare un ago da 27 e mezzo per ciascuno dei due siti di iniezione bilaterali del fianco posteriore. Sollevare delicatamente la pelle con una pinza per formare una tenda e iniettare le cellule alla base.

Fare attenzione a non penetrare troppo in profondità producendo sangue. Utilizzare una pinzetta per rimuovere delicatamente la siringa senza schizzi. Monitorare la crescita del tumore ogni giorno per 10-20 giorni fino a raggiungere un diametro del tumore da due a quattro millimetri.

Preparazione dei batteri, iniziare una coltura notturna di batteri in tre mils LB di terreno più antibiotici da un brodo congelatore a meno 80 o da un piatto refrigerato. In questo esperimento abbiamo usato il ceppo più forte ELH quattro 30 al mattino. Diluire la coltura da uno a 100 in libbre filtrate e crescere fino a un OD 600 da 0,4 a 0,6.

Centrifugare e lavare tre volte in soluzione salina tamponata con fosfato e risospendere a un OD finale di 600 di 0,1 o circa una volta 10 per le sette cellule per mil. Iniezione di batteri, anestetizzazione degli animali e posizione con la coda rivolta verso la mano dominante. Individua la vena caudale e dilatala usando acqua tiepida o una lampada termica.

Caricare i batteri 100 microlitri per topo in una siringa da un mil e piegare il chip a meno di 90 gradi. Allineare la punta della siringa con la vena caudale, penetrare a una profondità ridotta senza avvertire resistenza e iniettare i batteri. Osservare lo spostamento del flusso sanguigno per un'iniezione riuscita.

Attendere circa 12-18 ore prima che si verifichi l'imaging per la colonizzazione. L'imaging dei topi anestetizza gli animali nella camera di induzione. Quindi posizionare ciascun mouse sulla piattaforma di imaging.

Mantieni un posizionamento preciso per garantire risultati quantitativi tra i punti temporali, riprendi gli animali utilizzando il sistema di imaging Ibis Spectrum. Se si esegue l'imaging di più di un animale, posizionare barriere fotoelettriche tra di loro per evitare la dissezione dell'animale con illuminazione incrociata, tenendo il tumore con una pinzetta. Rimuovere la pelle con un movimento inverso delle forbici.

Movimento: Quando la maggior parte della pelle è stata separata, rimuovere completamente il tumore utilizzando una pinzetta. Posizionare gli organi e le provette da microcentrifuga pre-pesate. Poiché la massa di questi tubi può variare in modo significativo, è importante pesarli in anticipo per ottenere risultati quantitativi.

Quantificare la biodistribuzione batterica per ogni punto temporale, asportare e pesare i tumori, aggiungere 500 microlitri di PBS più il 15% di glicerolo e omogeneizzare utilizzando una lacerazione tissutale, genera una diluizione seriale e una piastra per il conteggio delle colonie batteriche, risultati rappresentativi. Utilizzando questo protocollo, siamo in grado di generare dati sulla crescita in vivo e sulle dinamiche di espressione genica di batteri bersaglio per il tumore. Il flusso di lavoro complessivo è riassunto qui.

Nella prima fase, abbiamo iniettato batteri e analizzato l'immagine dell'animale utilizzando l'ivus per misurare l'espressione genica con la luminescenza come reporter. Quindi, nella seconda fase, abbiamo asportato, omogeneizzato e piastrato i tumori per la conta delle colonie per determinare il numero di batteri che crescono nel tumore. La bioluminescenza generata dai ceppi batterici viene visualizzata utilizzando l'aumento del segnale ivus con il dosaggio iniettato con un dosaggio minimo di colonizzazione intorno a cinque volte 10 a cinque in tutti i casi a causa delle attenuazioni.

I batteri hanno colonizzato specificamente i tumori o non riescono a crescere in modo significativo nei topi. Il segnale viene quantificato utilizzando unità di radianza per normalizzare il tempo di esposizione o valori tipici superiori a 10 a sei o superiori sono indicativi di colonizzazione per una data infezione. Il segnale aumenta con il tempo da 24 a 48 ore. Il picco di insorgenza è di circa 36 ore dopo l'iniezione, ma i tempi possono variare a seconda del ceppo e del plasmide utilizzato. Assicurati di posizionare il mouse esattamente allo stesso modo ogni volta per garantire risultati quantitativi nella prossima serie di esperimenti.

La biodistribuzione batterica viene quantificata per misurare la crescita dei batteri nel tempo in diversi organi, i batteri vitali e i tumori vengono quantificati asportando e omogeneizzando il tumore e placcando la sua diluizione seriale. Altri organi possono essere quantificati. Allo stesso modo, qui abbiamo usato la milza poiché il rapporto tra milza tumorale è una misura tipica della specificità batterica dopo il calcolo del fattore di diluizione.

Questi conteggi ci permettono di misurare la popolazione batterica specifica nel tempo. A sinistra, possiamo vedere il numero di batteri crescere costantemente per tutta la durata dell'esperimento. Con un tempo di raddoppio compreso tra una e tre ore, sostanzialmente inferiore rispetto agli esperimenti di coltura batch.

Ciò è probabilmente dovuto alle scarse condizioni nutritive nel microambiente tumorale. A destra, abbiamo quantificato il rapporto tumorale della milza e abbiamo osservato che aumenta durante l'esperimento. L'obiettivo di questi esperimenti è quello di monitorare quantitativamente le dinamiche di crescita e l'espressione genica di batteri e ambienti tumorali utilizzando tecniche di imaging IVUS e conteggio delle colonie.

Abbiamo dimostrato che le popolazioni di batteri possono essere caratterizzate in vivo in ambienti tumorali. In futuro, programmi di espressione genica più complessi potranno essere progettati e ingegnerizzati per costruire sofisticati sistemi di somministrazione terapeutica nei batteri.