Isolamento dei neuroni sensoriali Aplysia californica Per Bloccare Registrazioni patch di correnti glutamatergico

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i singoli neuroni sensoriali della plegia in coltura a breve termine. Per gli studi con patch clamp, ciò si ottiene sezionando prima i gangli contenenti cellule sensoriali di un animale anestetizzato. Il secondo passo consiste nel digerire i gangli in soluzione enzimatica durante la notte.

Successivamente, i neuroni sensoriali di interesse vengono sezionati dai gangli digeriti. La fase finale è la dissociazione dei piatti di coltura preparati per farli aderire al substrato di coltura durante la notte. In definitiva, il voltage clamping viene utilizzato per studiare la tensione e le correnti ioniche agoniste dipendenti espresse in questi neuroni.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la registrazione cellulare in situ, è che l'isolamento dei neuroni consente l'uso di una tecnica di bloccaggio della tensione a singolo elettrodo. Questo metodo può aiutare a identificare le incognite chiave nel campo della neurobiologia industriale, come l'identità delle correnti ioniche attivate dai neurotrasmettitori implicati nell'apprendimento e nella memoria. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della sensibilità dei neuroni alla digestione enzimatica e alla dispersione su piastre di coltura.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando ci siamo resi conto che alcune correnti glutammatergiche importanti per l'apprendimento e la memoria avrebbero beneficiato dell'isolamento cellulare fornito da questo metodo. A dimostrare la procedura saranno gli studenti laureati, Andy Kesel e Justin Greer. Iniziare questa procedura posizionando un animale anestetizzato con il lato ventrale rivolto verso il basso nel vassoio di dissezione.

Fissa l'animale attraverso i bordi della parete del corpo e dei bordi parapolari, ma evita la coda e la testa per esporre la superficie dorsale del solco genitale. Quindi, sciacquare la superficie dorsale in acqua fredda del rubinetto a corrente lenta. Quindi applicare un leggero getto di alcol isopropilico al 70% da un flacone da spremere lungo il solco genitale e sopra la parte superiore della testa.

Per eseguire l'incisione iniziale, tenere tesa una piega di tessuto a sinistra della base del solco genitale con la pinza per il naso delle costole mentre si taglia un foro poco profondo attraverso l'area liscia e piatta della parete del corpo appena a destra del solco genitale con un paio di forbici angolate sottili. Quindi espandere l'incisione anteriormente fino a un punto tra i quattro ROF mentre si tira verso l'alto con la lama inferiore per evitare di intaccare l'intestino. Quindi, usa una pinza pulita e forbici sottili per rimuovere i gangli della testa recidendo il punto in cui i nervi che formano i gangli della testa si trasformano in un anello attorno all'esofago per rimuovere il petalo pleurico e i gangli cerebrali come un gruppo.

Successivamente, rimuovere il ganglio buccale che aderisce al lato ventrale dell'esofago. Per isolare i gangli di interesse, tagliare i gangli della testa, lasciando una lunghezza di connettivo attaccata a ciascun ganglio di interesse che sia uguale almeno al diametro del ganglio. Ciò ritarderà l'enzima dalla digestione eccessiva delle cellule di interesse nella fase successiva.

Quindi sciacquare due volte ogni ganglio bersaglio in piatti di acqua di mare artificiale con penicillina streptomicina. Se si prendono di mira le cellule del PVC, lasciare l'emiganglio pleurico destro attaccato al ganglio dell'emi del petalo destro e, allo stesso modo, lasciare l'emiganglio plurale sinistro attaccato al ganglio dell'emi del petalo sinistro. Quindi mettere i gangli sciacquati in una soluzione enzimatica e fissare saldamente il tappo.

Successivamente, posizionare il tubo su un lato su uno shaker rotante e impostare a bassa velocità per 13-15 ore durante la notte a circa 23 gradi Celsius. In questa procedura, riempire il centro dei piatti da 35 millimetri che sono stati rivestiti con PDL e sterilizzati UV con circa 0,5 millimetri di acqua di mare artificiale e penicillina streptomicina per creare un'isola di terreno all'interno. Per preparare la microdissezione dei gangli digeriti, versare la soluzione enzimatica contenente il pedale pleurico digerito e i gangli buccali nella vaschetta di dissezione.

Quindi, posizionare il piatto sul tavolino del microscopio contro una superficie nera sotto la luce riflessa. Quindi, utilizzando il tessuto connettivo attaccato appuntato su ciascun petalo pleurico, emiganglio con il lato dorsale rivolto verso l'alto, i tessuti saranno morbidi e intolleranti allo stiramento. Quindi isolare le cellule in PVC da un emiganglio pleurico utilizzando due paia di pinze mentre si tiene un perno di dissezione fine con una di esse come sonda.

Usa la sonda per staccare queste celle dal petalo, plurale, connettivo. Quindi lasciare che il grappolo di cellule cada sul fondo del piatto di dissezione. Trasferire il grappolo di cellule in un piatto di coltura preparato da 35 millimetri aspirando delicatamente il grappolo nella punta di una pipetta da pascolo monouso in vetro leggermente lucidata a fuoco.

Quindi erogarlo lentamente nell'isola del terreno in un piatto di coltura, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria nella pipetta. Ripetere l'isolamento del grappolo di PVC dell'altro emiganglio e metterlo in un piatto di coltura separato. Ecco una micrografia fotografica del cluster di cellule in PVC arancione scuro a forma di V del ganglio emi pleurico destro.

Per sezionare i neuroni BSC. Per prima cosa appuntare il ganglio buccale con il lato ventrale rivolto verso l'alto con cura da risparmiare. Le cellule di interesse successivamente isolano le cellule BSC utilizzando due paia di pinze mentre tengono un perno di dissezione sottile con una di esse come sonda.

Quindi, utilizzare la sonda per staccare queste cellule dal ganglio buccale. Quindi lasciare che le cellule cadano sul fondo della capsula di dissezione. Questa micrografia fotografica mostra la posizione delle cellule glutammatergiche del ganglio buccale.

I neuroni BSC sono identificabili dal loro colore arancione scuro. L'isolamento dei neuroni PVC e BSC produce quattro piastre di coltura contenenti cluster di neuroni. Due parabole contenenti cluster BSC e due parabole contenenti cluster in PVC.

Scartare il resto dei gangli e mettere da parte il piatto di dissezione da 100 millimetri per dissociare i gruppi di cellule. Posizionare un piatto di coltura contenente cellule sul tavolino del microscopio a bassa potenza e rimuovere il coperchio. Muovere delicatamente il fondo della piastra di coltura adiacente al gruppo di cellule.

Con un perno di dissezione sottile tenuto in una pinza, possono essere necessari da cinque a 10 colpi per dissociare completamente le cellule. Quindi ripetere con altri piatti di cultura. Quindi, posizionare le piastre di coltura contenenti isole di terreno con le cellule dissociate in un grande contenitore che consenta la circolazione dell'aria, come una capsula di Petri rotonda di plastica da 150 x 25 millimetri.

E metti questo piatto in un'incubatrice impostata a 17 gradi Celsius. Successivamente, posizionare un piatto d'acqua aperto come fonte di umidità nella camera e lasciarli indisturbati durante la notte per consentire alle cellule di aderire al rivestimento di polilisina al centro del piatto. Il giorno successivo, inondate delicatamente le piastre con 2,5 millilitri di acqua di mare artificiale e penicillina streptomicina, esaminate e contate le cellule utilizzando un microscopio per colture cellulari invertito.

Ecco i neuroni BSC vivi dopo un giorno di coltura, le cellule BSC sono generalmente più grandi delle cellule in PVC a 40 micron. Qui è mostrato un neurone PVC vivo dopo una settimana in coltura che mostra la crescita del processo. Qui c'è una corrente eccitatoria trasportata dagli ioni sodio in risposta a un impulso di glutammato di AL, e qui c'è una corrente in risposta al D aspartato.

Le correnti attivate da NMDA sono generalmente di ampiezza inferiore rispetto a quelle attivate dagli altri agonisti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non danneggiare i neuroni durante la dissociazione. Un vantaggio di questa tecnica è che crea due colture da ciascun ganglio, in modo che una possa essere utilizzata come controllo di corrispondenza per la coltura sperimentale.

Questa tecnica può essere utilizzata per creare colture primarie di neuroni provenienti da plegia o altri invertebrati marini. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i neuroni sensoriali della plegia mediante digestione enzimatica dei gangli, seguita da un'attenta dissociazione delle cellule di interesse.