Name: Generazione di sottocutaneo e intraepatica umane carcinoma epatocellulare xenotrapianti in topi immunodeficienti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-25T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Impara a generare xenotrapianti di carcinoma epatocellulare umano in topi immunodeficienti mediante frammenti tumorali o sospensioni cellulari. Questo metodo consente di studiare la biologia tumorale e le risposte terapeutiche in vivo.

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Questo lavoro è stato supportato da una Canadesi Institutes of Health Research Fase 1 Clinico-Scientist Award (AG) e una sovvenzione di funzionamento dal Cancer Research Society (AG). Gli autori sono grati al Dr. John Dick per il suo sostegno di questo progetto.

Una panoramica schematica del protocollo è presentata nella Figura 1. 1. Elaborazione di HCC umano Campioni Ottenere campioni di HCC umano primarie con il consenso scritto del paziente e con l&#39;approvazione del comitato etico della ricerca istituzionale. Questi protocolli sono stati eseguiti presso il nostro istituto, con l&#39;approvazione del Comitato Etico Research University Health Network in conformità a tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano. Prelevare i campioni di HCC freschi appena possibile dopo l&#39;intervento chirurgico campioni, una volta adeguate sono state prese per scopi clinici. Idealmente questo dovrebbe avvenire entro 30 minuti dopo la rimozione del tessuto dal paziente. Come illustrato nella Figura 2, un campione di almeno 1 cm 3 ottenuto dalla periferia del tumore è ottimale, in quanto la porzione centrale del tumore può essere necrotico.Tumori che non hanno ricevuto alcun trattamento prima della resezione come radioterapia, chemioterapia o l&#39;ablazione sono preferiti al fine di massimizzare la possibilità che le cellule tumorali sono vitali. Maneggiare tessuti umani primari in conformità con i protocolli di protezione personali standard per materiale a rischio biologico. Eseguire tutte le manipolazioni di laboratorio di tessuti tumorali e preparazioni di cellule in un armadio di sicurezza biologica di classe II con tecniche asettiche. <ol><li> Collocare il campione HCC fresca in 10-25 ml Modified F12 Eagle Medium / Ham &#39;s Dulbecco privo di siero a 4 ° C e trasferire sul ghiaccio al laboratorio per l&#39;elaborazione immediata e la preparazione di frammenti e / o cellule di tessuto per xenotrapianto in topi. </li><li> Utilizzando pinze sterili, collocare il campione di tumore in un x 20 mm piastra di Petri 100 mm o altra superficie di lavoro sterile adatto. Dividere il campione del tumore in frammenti di circa 2-3 mm 3 usando un bisturi chirurgico No.10. A questo punto, considerare scatto di congelamento o formalina fissa some frammenti di tumore di altri esperimenti o analisi come richiesto. </li><li> Per xenotrapianto di frammenti di tumore, posizionare alcuni dei frammenti HCC in uno o più tubi microcentrifuga contenenti Matrigel sufficiente per permettere ai frammenti di rimanere sommersi. Mantenere questi tubi sul ghiaccio. </li><li> Per la preparazione di una sospensione di cellule tumorali, utilizzare il bisturi chirurgico per tritare il rimanente tessuto HCC quanto possibile e mescolare con 5-10 ml di DMEM-F12 in una provetta da 50 ml a seconda del volume del tessuto tritato. </li><li> Aggiungi collagenasi di tipo IV e dispasi II a concentrazioni finali di 200 unità / ml e 0,8 unità / ml. Pipettare la miscela su e giù bene con una pipetta 25 ml. </li><li> Sigillare la provetta e incubare la miscela dal punto 1.6 a 37 ° C in un incubatore a biossido di carbonio 5% per 30-60 min a seconda della morbidezza del tessuto tumorale. Pipettare la miscela su e giù un paio di volte ogni 10 min per valutare i progressi della digestione enzimatica. </li><li> Dopo digestion è completa, passare la soluzione di tumore attraverso un colino a 100 cellule micron. Schiacciare delicatamente il tessuto rimanente sul filtro cella utilizzando una punta di pipetta 25 ml per consentire il massimo numero di cellule tumorali di passare attraverso. Raccogliere la sospensione cellulare tesa in un tubo da 15 ml. </li><li> Centrifugare la sospensione di cellule tumorali a 1.200 giri per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Decantare delicatamente il surnatante. A seconda delle dimensioni del pellet, aggiungere 2-5 ml di ghiaccio freddo 1x globuli rossi (RBC) tampone di lisi e pipettare delicatamente su e giù per risospendere il pellet. Tenere in ghiaccio per 5 min. </li><li> Aggiungere DMEM-F12 ad un volume totale di 15 ml e centrifugare a 1000 rpm per 5 minuti a 4 ° C per lavare il tampone di lisi RBC. </li><li> Decantare delicatamente il surnatante e risospendere il tumore pellet RBC-libero delle cellule in DMEM-F12. </li><li> Contare le cellule vitali mediante trypan blu manualmente o con un contatore automatico cella. </li><li> Aliquote di cellule tumorali centrifuga contenenti il ​​numbe desiderator di cellule iniettabile come sopra descritto, risospendere il pellet cellulare risultante in 30 ml di ghiacciata Matrigel, e memorizzare su ghiaccio. </li></ol> Optional: Dopo il punto 1.11, abbiamo regolarmente impiegare una CD45 + cellule umane (leucociti) dalla sospensione massa di cellule tumorali e / o purifichiamo sottoinsiemi di cellule tumorali in citometria a flusso o sfere immunomagnetiche. Protocolli dettagliati per queste tecniche sono ben descritti da parte dei produttori degli anticorpi pertinenti, perline e citometri a flusso. Nota: Il protocollo descritto sopra può essere usato per trattare tumori umani raccolti da topi al fine di eseguire il trapianto seriale, sostituendo il tessuto xenotrapianto per il tessuto HCC umano primario nel passaggio 1.1. In questa situazione, dopo passo 1.11, abbiamo quotidianamente impiegare una infiltrante cellule murine dalla sospensione cellulare utilizzando un anticorpo contro l&#39;antigene del mouse istocompatibilità H2K. 2.Xenotrapianto Eseguire tutte le procedure animali in conformità con i protocolli approvati dal comitato cura degli animali istituzionale. Le procedure qui descritte siano stati compiuti sotto uno specifico protocollo di uso di animali, approvato dal comitato Animal Care University Health Network in conformità e il rispetto di tutte le agenzie pertinenti normative e istituzionali, normative e linee guida. Attrezzature per la consegna di anestetici volatili inalatori ai piccoli animali deve essere utilizzato in base alle procedure operative standard della struttura animale e istituto di ricerca. Eseguire tutte le procedure chirurgiche che utilizzano tecniche asettiche e strumenti sterili in un armadio biosicurezza di classe II. Utilizzare diabetici non obesi immunodeficienza combinata grave (NOD / SCID) o NOD / SCID / interleuchina 2 recettore gamma catena nulli (GFN) ceppi di topi di entrambi i sessi a 6-8 settimane di età (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 9,10. Questetopi deve essere ospitato e mantenuto in una struttura in grado di fornire condizioni di assenza di patogeni adatti per gli animali immunodeficienti. Preparare topi per la chirurgia in una camera di alimentazione 5% (v / v) inalato isoflurano in 1 L / min di ossigeno. Mantenere l&#39;anestesia finché vi è perdita di riflesso corneale e punta nell&#39;animale (s). Per xenotrapianto sottocutanea, radere una o più piccole aree sul dorso dell&#39;animale (s) e pulire la pelle con il 70% di etanolo. Per xenotrapianto intraepatica, radere il torace e l&#39;addome ventrale dell&#39;animale (s) dal ascelle fino alla regione inguinale e detergere la pelle con il 70% di etanolo. 2.1 impianto sottocutaneo di frammenti di tumore <ol><li> Posizionare il mouse anestetizzato prona, mantenendo l&#39;anestesia inalatoria isoflurano (2% (v / v) in 1 L / min O 2) con un boccaglio. Applicare strappo-Gel per proteggere gli occhi dell&#39;animale da lesione traumatica. </li><li> Sterilizzare l&#39;area rasata dorsale (s) con Betadinescrub chirurgico seguito da etanolo al 70% e, infine, con una soluzione di povidone-iodio. </li><li> Effettuare una incisione cutanea 5 millimetri usando forbici affilate sterili. </li><li> Inserire una forbice smussato chiuso delicatamente nello spazio sottocutaneo e diffondere delicatamente per sviluppare una tasca abbastanza grande per ospitare un frammento di tumore. </li><li> Inserire il frammento di tumore preparato nella fase 1.3 nella tasca sottocutanea utilizzando sterili pinza sottile. </li><li> Chiudere l&#39;incisione cutanea con suture o clip. </li><li> Fornire assistenza postoperatoria per il mouse come descritto di seguito. </li></ol> 2.2 L&#39;iniezione sottocutanea di cellule tumorali <ol><li> Preparare l&#39;animale come descritto nei passi 2.1.1 e 2.1.2. </li><li> Caricare la sospensione di cellule tumorali in Matrigel preparati nel passo 1.13 in una siringa da insulina con un 29 G 1/2 in dell&#39;ago. </li><li> Inserire l&#39;ago nello spazio sottocutaneo e scaricare il contenuto della siringa. Avanzando l&#39;ago diversi millimetri lungo il piano sottocutaneo lontano from il sito di puntura pelle impedisce la fuoriuscita della sospensione di cellule tumorali dal sito di puntura sul ritiro dell&#39;ago. </li><li> Fornire assistenza postoperatoria per il mouse come descritto di seguito. </li></ol> 2.3 Impianto intraepatica di frammenti di tumore <ol><li> Utilizzando un 27 G 1/2 in ago su un siringa da 1 ml, somministrare 350 ml di sterile normale soluzione salina per via sottocutanea nel dorso del collo dell&#39;animale anestetizzato per compensare le perdite di fluido intraoperatorie. Per analgesia, somministrare 350 ml di sterile normale soluzione salina contenente buprenorfina (0,1 mg / kg) per via sottocutanea sul fianco dell&#39;animale, utilizzando un 1/2-in ago 27 G in una siringa da 1 ml. </li><li> Posizionare il mouse su una supina tampone pre-riscaldata con il naso e la bocca posizionata all&#39;interno del boccaglio per fornire manutenzione anestesia inalatoria isoflurano (2% (v / v) in 1 L / min O 2). </li><li> Estendere le membra e fissarli con nastro adesivo alla superficie operativa per ottimizzare l&#39;esposizione dil&#39;addome ventrale e del torace. </li><li> Eseguire la procedura sotto una lampada di ingrandimento per ottimizzare la visualizzazione. </li><li> Sterilizzare la pelle rasata sull&#39;addome ventrale e del torace con Betadine scrub chirurgico seguito da etanolo al 70% e, infine, con una soluzione di povidone-iodio. </li><li> Utilizzando forbici affilate sterili, fare un traverso un&#39;incisione cutanea sottocostale bilaterale e dividere gli strati muscolari per entrare nella cavità peritoneale per consentire una adeguata esposizione di tutto il fegato. </li><li> Collocare un punto nella pelle sopra il processo xifoideo e fissarlo al boccaglio con nastro al fine di consentire una migliore esposizione del fegato e strutture circostanti. </li><li> Utilizzare due applicatori di cotone con punta adiacenti e posteriore al fegato per stabilizzarlo. </li><li> Fare un&#39;incisione 3 mm di lunghezza e profondità sulla superficie del fegato con un ago sterile No. 10 bisturi. </li><li> Applicare immediatamente Surgicel e leggera pressione sul sito di incisione per ottenere l&#39;emostasi; rimuovere dopo 60-90 sece procedere solo se completa emostasi è stato raggiunto. </li><li> Posizionare un frammento di tumore passo 1.3 nell&#39;incisione fegato con sterili pinza sottile o con un ago da 18 G. </li><li> Applicare un piccolo pezzo di Surgicel sopra l&#39;incisione fegato per impedire lo spostamento del frammento di tumore e assicurare la continua emostasi. </li><li> Chiudere l&#39;incisione con suture o clip. </li><li> Fornire assistenza postoperatoria come descritto di seguito </li></ol> 2.4 Impianto intraepatica di cellule tumorali tramite iniezione diretta nel fegato <ol><li> Preparare il mouse come descritto nei punti da 2.3.1 a 2.3.7 sopra. </li><li> Caricare la sospensione cellulare tumorale (preparato nella fase 1.13) in una siringa da insulina con un 29 G 1/2 in dell&#39;ago. </li><li> Con il fegato stabilizzato con un cotton-tip, inserire l&#39;ago della siringa di insulina nel fegato e far avanzare la punta di qualche millimetro oltre il punto di prelievo lungo un piano subcapsular. </li><li> Scarica delicatamente il contenuto della siringa e tgallina rimuovere l&#39;ago dal fegato. </li><li> Posto Surgicel sul sito della puntura e applicare una leggera pressione con un applicatore con punta di cotone per evitare perdite di sospensione cellulare tumorale e realizzare la completa emostasi. </li><li> Chiudere l&#39;incisione con suture o clip e fornire cure post-operatorie come descritto di seguito. </li></ol> 2.5 xenotrapianto intraepatica di cellule tumorali tramite iniezione nel Milza <ol><li> Preparare il mouse come descritto nei punti da 2.3.1 a 2.3.5 sopra. </li><li> Utilizzando forbici affilate sterili, fanno un 1 cm a sinistra incisione sottocostale per entrare nella cavità peritoneale. </li><li> Usare un applicatore con punta di cotone per riflettere lo stomaco craniale e al lato destro dell&#39;animale al fine di esporre la milza. </li><li> Gestendo i tessuti adiposi circostanti con sterili pinza sottile atraumatica, consegnare la milza nell&#39;incisione e mettere un applicatore con punta di cotone dietro la milza per stabilizzarlo. </li><li> Utilizzo di 5-0 sutura di seta, postoun sciolto nodo pre-legato intorno alla milza di sopra del polo inferiore. </li><li> Caricare la sospensione cellulare tumorale (preparato nella fase 1.13) in una siringa da insulina con un 29 G 1/2 in dell&#39;ago. </li><li> Inserire la siringa di insulina nel polo inferiore della milza e avanzare oltre il livello del nodo allentato pre-legato. </li><li> Scaricano lentamente il contenuto della siringa, rimuovere l&#39;ago dalla milza, e stringere il nodo per evitare fughe di sospensione cellulare tumorale iniettato. </li><li> Sostituire la milza nella cavità peritoneale. </li><li> Chiudere l&#39;incisione con suture o clip e fornire cure post-operatorie come descritto di seguito. </li></ol> 2.6 epatectomia parziale per facilitare intraepatica Engraftment di tessuto tumorale umano <ol><li> Preparare il mouse come descritto nei punti da 2.3.1 a 2.3.7. </li><li> Con forbici affilate sterili, dividere il legamento falciforme attaccato al lobo mediano del fegato. </li><li> Usando un applicatore con punta di cotone, di mobilitareil lobo sinistro del fegato e della posizione di un nodo sciolto pre-legato di 5-0 sutura di seta intorno al lobo sinistro. Avanzare il nodo allentato il più vicino possibile verso il peduncolo bilio-vascolare del lobo sinistro e stringere il nodo. </li><li> Asportare il lobo distale sinistra alla legatura con le forbici sterili, lasciando un piccolo moncone per evitare lo slittamento del nodo e la successiva emorragia. </li><li> Utilizzando una tecnica simile, legare e resecare la maggioranza del lobo mediano del fegato, evitando la cistifellea. </li><li> Uso Surgicel e leggera pressione con un applicatore con punta di cotone lungo le superfici di taglio del parenchima epatico realizzare la completa emostasi. </li><li> Per xenotrapianto intraepatica di un frammento tumore o cellule tumorali, procedere con gradini 2.3.8 a 2.3.11 o 2.4.2 a 2.4.5 come descritto sopra. </li><li> Per xenotrapianto intraepatica di cellule tumorali mediante iniezione milza, utilizzare applicatori di cotone con punta di riflettere delicatamente lo stomaco craniale e al lato destro dell&#39;animale, exposing la milza. Procedere con i punti 2.5.4 a 2.5.9 come descritto sopra. </li><li> Chiudere l&#39;incisione con suture o clip e fornire cure post-operatorie come descritto di seguito. </li></ol> 2.7 Cura postoperatoria <ol><li> Rimuovere il mouse dalla anestesia inalatoria boccaglio. </li><li> Posizionare il mouse in una gabbia sotto una lampada di calore per circa 20 minuti fino a quando recuperato da anestesia e mobilitare pienamente. </li><li> Ripetere la dose di buprenorfina ogni 8-12 ore durante i primi 2-3 giorni postoperatori. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Abbiamo descritto una varietà di tecniche per stabilire sottocutanea e intraepatiche xenotrapianti HCC umano in topi immunodeficienti che può essere applicata a una vasta gamma di domande e saggi sperimentali. Mentre xenotrapianti sottocutanei sono stati ampiamente utilizzati per studiare vari aspetti della biologia HCC, xenotrapianti intraepatiche sono raramente descritti in letteratura. Inoltre, la maggior parte degli studi che descrivono l&#39;uso di xenotrapianti hanno generato questi da linee cellulari ben consolid...

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è il quinto tumore più comune al mondo e la più rapida crescita causa di morte per cancro in Nord America. Il fattore di rischio prevalente per HCC è la cirrosi epatica, più frequentemente si verificano a causa di epatite cronica virale, l&#39;abuso di alcol, malattie autoimmuni o disturbi metabolici ereditari 1. Nonostante il carico di malattia pesante imposto dalla HCC sulle popolazioni mondiali, la fisiopatologia di HCC è relativamente poco compresa in confronto ad altri tumori comuni come colon, seno, o cancro alla prostata. Ad esempio, gli eventi molecolari e cellulari specifici di guida tumorigenesi ancora essere chiaramente definiti 2. Come la maggior parte altri tumori epiteliali solidi, approcci genomici hanno rivelato l&#39;eterogeneità delle aberrazioni connesse con HCC 3. Un certo numero di studi hanno rivelato attività disordinata di una varietà di vie di segnalazione coinvolte nella proliferazione cellulare, sursopravvivenza, differenziazione, e l&#39;angiogenesi 4. Inoltre, il ruolo delle cellule staminali del cancro in HCC pathobiology Rimane da chiarire 5. Con una comprensione limitata di HCC fisiopatologia, l&#39;armamentario di terapie efficaci per HCC è rimasta relativamente limitato. Pazienti in fase iniziale con tumori confinati al fegato sono candidati per la terapia curativa con ablazione del tumore o la resezione chirurgica, anche se la ricorrenza è comune. Nei pazienti con malattia più avanzata, la chemioterapia e le radiazioni sono di efficacia limitata e sono utilizzati principalmente per il controllo delle malattie con intento palliativo 6. Alta qualità in vivo modelli sperimentali di HCC umano così fornire una valida piattaforma per la ricerca di base tanto necessaria nella fisiopatologia del carcinoma epatocellulare umano, nonché per la valutazione di nuovi approcci terapeutici. Rispetto all&#39;uso di linee cellulari o modelli murini altamente definiti, xenotrapianti di pritumori umani in topi immunodeficienti mary sono emersi come strumenti preziosi per tali studi, in quanto sono in grado di ricapitolare malattia umana con alta fedeltà e di cogliere l&#39;eterogeneità che è presente all&#39;interno e tra i diversi pazienti 7,8. A questo scopo, abbiamo sviluppato una varietà di metodi per stabilire xenotrapianti HCC umani in topi immunodeficienti. Mentre la maggior parte degli studi pubblicati che coinvolgono xenotrapianti HCC descrivono l&#39;uso di linee cellulari di carcinoma epatico umano affermati per questo scopo, ci siamo concentrati su come ottimizzare le nostre analisi per generare xenotrapianti da campioni di HCC primari ottenuti subito dopo la resezione chirurgica di pazienti. Diverse tecniche di xenotrapianto può essere richiesto per le diverse applicazioni di ricerca. Ad esempio, xenotrapianti sottocutaneo generati da frammenti tumorali sono generati rapidamente, sono facilmente monitorati e potrebbero essere più appropriato per l&#39;amministrazione locale di nuove terapie con comodomonitoraggio della risposta tumorale. Xenotrapianti intraepatiche possono essere più rilevanti per gli studi relativi al ruolo del microambiente epatica in HCC biologia. Xenotrapianti generati da sospensioni di cellule tumorali sono necessarie per l&#39;identificazione e la caratterizzazione delle sottopopolazioni di cellule tumorali iniziare o per esperimenti che richiedono manipolazioni in vitro di cellule tumorali prima xenotrapianto. Abbiamo così sviluppato e validato i seguenti protocolli di stabilire per via sottocutanea o xenotrapianti intraepatiche da sospensioni di cellule o frammenti tumorali derivati ​​da campioni di HCC umani primari.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#8217; s Mod. Aquila Medium/Ham&#8217; s F12 50/50 Miscela x1(DMEM-F12) </td><td>WISENT Bioproducts</td><td>319-075-CL</td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi di tipo IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td> Dispase II </td><td>Stemcell Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td> Matrice Matrigel</td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td> Soluzione di formalina tamponata al 10 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>0,9 % Soluzione salina Soluzione (NaCl), sterile</td><td>House Brand</td><td>1011-L8001</td><td></td></tr><tr><td>Scrub chirurgico Betadine</td><td>Purdue Pharma</td><td>NPN 00158313</td><td></td></tr><tr><td> Buprenorfina (Temegesic) NR 0,3 mg/ml</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane USP, 99,9 %, anestetico per inalazione</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td>M60302</td><td></td></tr><tr><td>Tear-Gel </td><td>Novartis Pharmaceuticals</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Composto per sezioni congelate </td><td>VWR</td><td>95057-838</td><td></td></tr><tr><td> Cryomold, Tissue -Tek </td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td> Precision Glide Needle 18G 1 &#189; </td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td> Ago di Precisione 27G &#189; </td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td> Siringa da insulina, 3/10 cc U-100, 29G&#189; </td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td> Lama chirurgica No.10</td><td>Feather Safety Razor Co.</td><td>08-916-5A</td><td></td></tr><tr><td> #5-0 Sutura chirurgica in seta morbida, ago a punta conica da 3/8" </td><td>Syneture</td><td>VS-880</td><td></td></tr><tr><td> Nastro chirurgico transporoso</td><td>3M Health care</td><td>1577-1</td><td></td></tr><tr><td> Applicatore in cotone </td><td>Medpro</td><td>018-425</td><td></td></tr><tr><td> Chirurgicel, cellulosa rigenerata ossidata</td><td>Ethicon</td><td>1951</td><td></td></tr><tr><td> Filtro cellulare 100 &#956; m nylon</td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td> Illuminazione di ingrandimento con base mobile</td><td>Benson medical Industries Inc.</td><td>modello: RLM-CLT-120V</td><td></td></tr><tr><td>Petridish sterile 100x20 mm </td><td>Sarstedt</td><td>821474</td><td></td></tr><tr><td> Pinza per tessuti, 1x2 denti, 4-1/2"</td><td>Almedic</td><td>A10-302</td><td></td></tr><tr><td> Pinza per medicazione Adson 4-3/4"</td><td>Almedic</td><td>A10-220</td><td></td></tr><tr><td> Pinza per medicazione per occhi, seghettata, diritta, 4" </td><td>Almedic</td><td>A19-560</td><td></td></tr><tr><td> Pinza emostatica Hartman, curva, 3-1/2" </td><td>Almedic</td><td>A12-142</td><td></td></tr><tr><td> Forbice iride, curva, 4-1/4"</td> <td>Almedic</td><td>A8-690</td><td></td></tr><tr><td> Forbice iride, diritta, 4-1/2" </td><td>Almedic</td><td>A8-684</td><td></td></tr><tr><td> Cacciavite ad ago Olsen-Hegan, 5-1/2" </td><td>Almedic</td><td>A17-228</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di sottocutaneo e intraepatica umane carcinoma epatocellulare xenotrapianti in topi immunodeficienti

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo modelli sperimentali di carcinoma epatocellulare (HCC) che ricapitolano la malattia umana forniscono una valida piattaforma per la ricerca in fisiopatologia della malattia e per la valutazione preclinica di nuove terapie. Presentiamo una varietà di metodi per generare sottocutaneo o ortotopico xenotrapianti HCC umano in topi immunodeficienti che potrebbe essere utilizzato in una varietà di applicazioni di ricerca. Con un focus sull&#39;uso del tessuto tumorale primario da pazienti sottoposti a resezione chirurgica come punto di partenza, si descrive la preparazione di sospensioni di cellule tumorali o frammenti di xenotrapianto. Descriviamo tecniche specifiche per xenotrapianto questi tessuti i) per via sottocutanea, oppure ii) intraepaticamente, mediante impianto diretto di cellule tumorali o frammenti nel fegato, o indirettamente mediante iniezione di cellule nella milza mouse. Noi descriviamo anche l&#39;uso di resezione parziale del fegato di topo nativo al momento di xenotrapianto come strategia perindurre uno stato di rigenerazione epatica attiva nel topo ricevente che può facilitare l&#39;attecchimento intraepatica di cellule primarie tumorali umane. I risultati attesi di queste tecniche sono illustrate. I protocolli descritti sono stati convalidati usando campioni di HCC umani elementari e xenotrapianti, che in genere svolgono meno robusto rispetto alle linee cellulari di HCC umano consolidate che sono ampiamente utilizzati e frequentemente citati nella letteratura. In confronto con linee cellulari, discutiamo i fattori che possono contribuire alla relativamente bassa probabilità di attecchimento primaria HCC in modelli di xenotrapianto e commentare su questioni tecniche che possono influenzare la cinetica della crescita xenotrapianto. Suggeriamo anche i metodi che devono essere applicate per garantire che xenotrapianti ottenuti ricordano con precisione i tessuti di HCC genitore.

Figura 3 illustra l&#39;aspetto tipico di un sottocutanea xenotrapianto HCC umano e il corrispondente aspetto istopatologico del tumore. Lo sviluppo e la crescita degli xenotrapianti sottocutanee possono essere facilmente monitorati dal quotidiano esame di topi riceventi. L&#39;intervallo di tempo tra xenotrapianto e lo sviluppo di un tumore può variare notevolmente a seconda del tipo di tessuto (tumore frammento vs sospensione cellulare), fonte di tessuto (campione primario paziente, xenotrapianto dive...

Xenotrapianti tumorali umani in topi immunodeficienti sono strumenti preziosi per studiare biologia del cancro. Sono descritti i protocolli specifici per generare xenotrapianti sottocutanei e intraepatiche da cellule di carcinoma epatocellulare umani o frammenti di tumore. Rigenerazione epatica indotta da epatectomia parziale in topi riceventi si presenta come una strategia per facilitare l&#39;attecchimento intraepatica.

Generazione di sottocutaneo e intraepatica umane carcinoma epatocellulare xenotrapianti in topi immunodeficienti

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare xenoattecchimenti sottocutanei o intraepatici di carcinoma epatocellulare umano, o HCC, in topi immunodepressi. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto frammenti tumorali o una sospensione cellulare monocellulare a partire da un campione umano fresco di HCC, da impiantare nei topi per xenoattecchimenti sottocutanei. Il passo successivo consiste nell'iniettare cellule tumorali o impiantare frammenti tumorali in una tasca dorsale sottocutanea per xenoattecchimenti intraepatici.Il passo successivo consiste nell'iniettare cellule tumorali nella milza o nel fegato, oppure nell'implantare frammenti tumorali direttamente nel fegato nell'ultima fase. Gli animali vengono osservati per diverse settimane fino allo sviluppo dei tumori. Alla fine, i xenotrapi umani di carcinoma epatocellulare (HCC) possono essere utilizzati per studiare numerosi aspetti della biologia tumorale, inclusi i meccanismi di tumorigenesi e le risposte a nuove terapie.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'uso esclusivo di linee cellulari o xenotrapianti sottocutanei, è che con questa tecnica i campioni primari di cancro epatico umano e gli xenotrapianti intraepatici derivati dal paziente forniscono un modello biologico più realistico del carcinoma epatocellulare umano. A dimostrare la procedura sarà Sharif Ahmed, un ricercatore post-dottorato del mio laboratorio. Per l’impianto sottocutaneo dei frammenti tumorali, posizionare innanzitutto il topo anestetizzato in posizione prona, mantenendo l’anestesia inalatoria con isoflurano mediante un boccaglio.Applicare un gel lacrimale per proteggere gli occhi dell'animale da lesioni traumatiche, quindi sterilizzare l'area dorsale rasata con soluzione chirurgica di Betadine, seguita da etanolo al 70% e infine da soluzione di iodopovidone. Successivamente, utilizzare forbici affilate per praticare un'incisione di cinque millimetri nel tessuto cutaneo. Inserire la punta di un paio di forbici smussate chiuse nello spazio sottocutaneo, quindi aprirle delicatamente per creare una tasca sufficientemente ampia da contenere un frammento tumorale.Quindi utilizzare un paio di pinzette fini per inserire il frammento tumorale nella tasca sottocutanea, usando clip per chiudere l'incisione dopo aver posizionato il frammento appena prima dell'iniezione della sospensione di cellule tumorali in matrigel in una siringa per insulina dotata di un ago da 29 gauge per mezzo pollice. Inserire quindi l'ago nello spazio sottocutaneo di un animale anestetizzato e depilato, avanzando l'ago di alcuni millimetri lungo il piano sottocutaneo allontanandosi dal sito di puntura e rilasciando il contenuto della siringa. Per preparare l'animale all'impianto di tessuto tumorale umano, iniziare somministrando per via sottocutanea 350 microlitri di soluzione salina sterile con un ago da 27 gauge per mezzo pollice montato su una siringa da un millilitro, nel dorso del collo di un animale anestetizzato, al fine di compensare preventivamente qualsiasi perdita di liquidi intraoperatoria.Successivamente, dopo aver anestetizzato il topo in posizione supina su un tappetino preriscaldato, estendere gli arti dell'animale e fissarli con del nastro alla superficie operatoria per ottimizzare l'esposizione dell'addome e del torace ventrali. Posizionare una lampada con lente d'ingrandimento sopra l'animale, quindi sterilizzare la cute rasata dell'addome e del torace ventrali come appena dimostrato. Utilizzando forbici a punta, praticare un'incisione cutanea subcostale bilaterale trasversale e quindi dividere i piani muscolari per esporre completamente il fegato.Posizionare un punto di sutura nella cute sopra il processo xifoidale e fissarlo al boccaglio con del nastro adesivo per permettere una migliore esposizione del fegato e delle strutture circostanti. Successivamente, stabilizzare il fegato con due applicatori di cotone posizionati adiacenti e posteriori al tessuto. Quindi utilizzare un paio di forbici affilate per dividere il legamento falciforme attaccato al lobo mediano del fegato.Mobilizzare il lobo sinistro del fegato con un applicatore di cotone e posizionare un laccio leggero inizialmente allentato in filo di seta 5-0 intorno al lobo. Avanzare il laccio il più vicino possibile al peduncolo vascolare del lobo sinistro, quindi stringerlo. Successivamente, utilizzare un paio di forbici per asportare il lobo a valle del legamento, lasciando un piccolo moncone per prevenire lo scivolamento del laccio e un'emorragia successiva.Utilizzando una tecnica simile, legare ed escindere la maggior parte del lobo medio del fegato, quindi applicare Surgicel ed esercitare una pressione delicata con un applicatore a punta di cotone lungo le superfici tagliate del parenchima epatico per ottenere un'emostasi completa. Infine, eseguire un'impianto xenotrapiantato intraepatico di un frammento tumorale o di cellule tumorali, oppure uno xenotrapianto intraepatico di cellule tumorali mediante iniezione splenica come illustrato nelle sezioni seguenti. Per l'impianto intraepatico di frammenti tumorali, utilizzare una lama di bisturi numero 10 per effettuare innanzitutto un'incisione lunga e profonda tre millimetri sulla superficie del fegato.Applicare quindi immediatamente Surgicel ed esercitare una pressione delicata sulla sede dell'incisione per 60-90 secondi al fine di ottenere l'emostasi. Una volta raggiunta un'emostasi completa, utilizzare una pinzetta fine per posizionare un frammento tumorale all'interno dell'incisione epatica. Successivamente, applicare un piccolo pezzo di Surgicel sull'incisione per l'impianto epatico delle cellule tumorali mediante iniezione diretta nel fegato. Inserire l'ago di una siringa per insulina caricata con sospensione di cellule tumorali nel fegato esposto e avanzare la punta di alcuni millimetri oltre il sito di puntura lungo il piano sottocapsulare.Rilasciare delicatamente il contenuto della siringa e rimuovere l'ago dal fegato. Quindi posizionare del Surgicel sul sito di puntura e applicare una pressione leggera con un applicatore di cotone per prevenire la fuoriuscita della sospensione di cellule tumorali e ottenere un'emostasi completa per il xenotrapianto intraepatico di cellule tumorali mediante iniezione nella milza. Posizionare i topi in decubito laterale destro e utilizzare forbici affilate per praticare un'incisione subcostale sinistra di un centimetro per accedere alla cavità peritoneale.Quindi utilizzare un applicatore di cotone per spostare lo stomaco verso il lato destro dell'animale. Per esporre la milza manipolando i tessuti adiposi circostanti con pinze fini e atraumatiche, portare la milza all'interno dell'incisione e posizionare un applicatore di cotone dietro la milza per stabilizzare il tessuto. Ora utilizzare un punto di sutura in seta 5-0 per eseguire un nodo lasso intorno alla milza, posizionandolo al di sopra del polo inferiore.Inserire l&#39;ago della siringa carica con sospensione di cellule tumorali al polo inferiore della milza ed avanzare oltre il livello del nodo allentato. Quindi rilasciare lentamente il contenuto della siringa, rimuovere l&#39;ago dalla milza e stringere il nodo per prevenire qualsiasi fuoriuscita della sospensione cellulare iniettata. Infine, riposizionare la milza all&#39;interno della cavità peritoneale.In questa immagine è mostrato un campione di resezione epatica proveniente da un paziente con carcinoma epatocellulare (HCC) che non aveva ricevuto alcuna terapia adiuvante per il tumore. Il riquadro bianco indica una porzione vitale del tumore situata in prossimità della periferia, prelevata per l'innesto eterologo. Lo sviluppo e la crescita di innesti eterologhi sottocutanei possono essere facilmente monitorati mediante esame giornaliero dei topi riceventi.Ad esempio, vengono mostrate l'aspetto tipico di un xeno innesto sottocutaneo di carcinoma epatocellulare umano, visivamente distinto dai tessuti circostanti, e l'aspetto istopatologico corrispondente del tumore. L'istologia del tumore evidenzia le caratteristiche tipiche del carcinoma epatocellulare, tra cui cellule simili agli epatociti con atipia nucleare e alto rapporto nucleo-citoplasmatico, assenza di tracce portali e trabecole alterate con aumento dello spessore delle lamine epatocellulari. In queste immagini, vengono mostrati gli aspetti tipici di uno xeno innesto intraepatico di carcinoma epatocellulare umano ottenuto tramite impianto diretto di tessuto tumorale nel fegato, così come quello ottenuto mediante iniezione di cellule tumorali nella milza, con i tumori intraparenchimali indicati dalla freccia nera in ciascuna immagine.Questa sezione di istologia attraverso il margine di un innesto xog intraepatico mostra le caratteristiche tipiche del carcinoma epatocellulare umano e quelle del fegato murino normale adiacente. La tabella riassume i tassi di attecchimento tumorale ottenuti dopo l'innesto di tessuti primari di carcinoma epatocellulare umano in topi immunodepressi. Utilizzando le diverse tecniche precedentemente illustrate per ciascun metodo di innesto, il denominatore del tasso di attecchimento tumorale riflette un campione unico di HCC umano.Questi dati dimostrano che, per tessuti di carcinoma epatocellulare umano primario, i tassi di innesto sottocutaneo sono inferiori rispetto ai tassi di innesto intraepatico ottenuti mediante iniezione intrasplenica di cellule tumorali o impianto di frammenti tumorali intraepatici, e che un'epatectomia parziale sembra migliorare l'innesto intraepatico. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare una tecnica sterile e di ottenere un'emostasi completa, poiché topi immunocompromessi di soli sei-otto settimane sono suscettibili a infezioni e potrebbero non sopravvivere anche a una modesta quantità di sanguinamento postoperatorio.

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Questo video mostra un test per generare un modello murino di xenotrapianto umanizzato. A un topo immunocompromesso viene iniettata ciclofosfamide per causare la deplezione delle cellule immunitarie. Le cellule tumorali derivate dal paziente mescolate con cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) in un idrogel vengono iniettate per via sottocutanea nel topo, formando un tumore con cellule T infiltranti.

Una tecnica per generare un modello murino di xenotrapianto umanizzato innestato con PBMC umano

La diffusione metastatica del cancro è la principale causa di decessi correlati al cancro. Forniamo una descrizione approfondita della nostra metodologia chirurgia sopravvivenza per stabilire un modello di sistema ortotopico singenici mouse "paziente-tipo" per lo studio dei meccanismi di metastatizzazione dei tumori di organi solidi.

A &quot;paziente-Like&quot; ortotopico Singenico modello murino della carcinoma epatocellulare Metastasi

Qui, presentiamo un nuovo modello di fegato di topo umanizzato generato in topi knockout cellulare mediato dal recettore della tossina Alb (TRECK)/SCID a seguito del trapianto di cellule staminali epatiche umane immature ed espandibili.

Generazione di un umanizzato mouse Fegato Utilizzando epatici umani cellule staminali

Abbiamo descritto un protocollo per l'esecuzione di epatectomia parziale (PHx) e trapianto di cellule via della milza nel cenno del capo. SCID (CENNO DEL CAPO. CB17-Prkdcscid/j) topi. In questo protocollo, un'incisione è fatta per esporre e resecare il lobo sinistro del fegato seguito da un'altra incisione per il trapianto di cellule intrasplenic.

Intrasplenic trapianto di epatociti dopo epatectomia parziale in NOD. Topi SCID

Qui, presentiamo un protocollo per generare un modello del mouse chimerici del fegato umano di hypercholesterolemia familiare facendo uso degli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane. Si tratta di un modello valido per testare nuove terapie per ipercolesterolemia.

Un modello di Mouse chimerici del fegato umano di ipercolesterolemia familiare facendo uso degli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte

Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per stabilire topi umanizzati sia con il sistema immunitario umano che con le cellule epatiche. I topi immunodeficienti contemporanei ricostituiti ottenuti tramite iniezione intrasplessica di epotociti umani e CD34- cellule staminali ematopoietiche sono suscettibili di infezione da virus immunodeficienza umana-1 e ricapitolano i danni al fegato osservati pazienti affetti da HIV.

Istituzione del modello murino TK-NOG dualizzato per la patogenesi del fegato associata all'HIV

Qui, descriviamo lo sviluppo di un modello murino clinicamente rilevante del cancro al fegato che riassume le caratteristiche immunitarie tipiche del cancro epatocellulare (HCC).

Un modello di topo ortotopico oncogenico indotto dall'epatocito del cancro epatocellulare in aumento nell'impostazione dell'infiammazione epatica e della fibrosi

I modelli murini xenoma uvea-hettale del fegato umano ortotopico sono stati creati utilizzando tecniche di impianto ortotopico chirurgico con pezzi tumorali derivati dal paziente e tecniche di iniezione di aghi con linee cellulari di melanoma uveale umano coltivate.

Generazione di una piattaforma di Melanoma Uvenoma Uvenoft umano del fegato in topi immunodeficienti

Qui, presentiamo un protocollo per creare xenotrapianti di carcinoma epatocellulare ortotopico con e senza legatura dell'arteria epatica ed eseguire la tomografia ad emissione di positroni (PET) non invasiva dell'ipossia tumorale utilizzando [18 F]Fluoromisonidazolo ([18 F]FMISO) e [18 F]Fluorodesossiglucosio ([18F]FDG).

Imaging PET/RM non invasivo in un modello murino ortotopico di carcinoma epatocellulare

Gli organoidi generati dai tumori dei pazienti vengono iniettati ortotopicamente nel fegato del topo. La resezione del tessuto epatico non tumorale porta a un ambiente rigenerativo nel tessuto epatico in cui si trova il tumore.

Un modello di xenotrapianto di organoidi derivato da pazienti con carcinoma epatocellulare per studiare l'impatto della rigenerazione epatica sulla crescita del tumore

Impara a generare xenotrapianti di carcinoma epatocellulare umano in topi immunodeficienti mediante frammenti tumorali o sospensioni cellulari. Questo metodo consente di studiare la biologia tumorale e le risposte terapeutiche in vivo.

Generazione di sottocutaneo e intraepatica umane carcinoma epatocellulare xenotrapianti in topi immunodeficienti

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