Passivazione della superficie per singola molecola proteica Studi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre una superficie di scorrimento in quarzo di qualità superiore. Ciò si ottiene pulendo prima i vetrini di quarzo forati e i vetrini coprioggetti con acqua e acetone. Quindi il vetrino viene inciso con idrossido di potassio e la soluzione piranha per migliorare la qualità della superficie.

Successivamente, i vetrini e i vetrini coprioggetti vengono funzionalizzati con gruppi amminici seguiti da due cicli di superficie utilizzando un polimero per rendere inerte la superficie del vetro. Il passaggio finale consiste nell'assemblare la camera microfluidica dal vetrino e dal vetrino coprioggetto con le superfici rivestite di polietilenglicole o pegilate una di fronte all'altra. In definitiva, una nuova strategia di trattamento della superficie con molecole peg su due cicli migliora notevolmente la qualità della passivazione osservata dalla microscopia a fluorescenza a singola molecola.

Il vantaggio principale di questa tecnica o delle tecniche esistenti come il rivestimento polimerico dopo l'incisione con ossido di potassio è che questa tecnica garantisce una qualità superiore. Le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà poiché devono essere eseguiti più trattamenti di servizio. Per iniziare il trapano, il quarzo scivola come dettagliato nel protocollo di testo.

Pulire i vetrini mettendoli in un barattolo di vetro. In genere è possibile inserire da cinque a 15 vetrini in un singolo barattolo. Quindi sciacquare i vetrini con acqua UE dopo aver ripetuto il risciacquo tre volte, sonicare i vetrini con acqua UE per cinque minuti per rimuovere lo sporco, smaltire l'acqua e sciacquare i vetrini altre tre volte con acqua UE.

Successivamente, sostituire l'acqua UE con acetone e sonicare i vetrini con acetone per 20 minuti o più, scartare l'acetone e sciacquare i vetrini con acqua Milli Q per rimuovere eventuali residui di acetone. Quindi, sostituire l'acqua con un idrossido di potassio molare e sonicare i vetrini per 20 minuti o più. Un'eccessiva mordenzatura migliorerà la qualità della superficie, ma introdurrà graffi che potrebbero interferire con l'imaging a fluorescenza.

Sciacquare i vetrini con acqua Milli Q tre volte per rimuovere le tracce di idrossido di potassio per eseguire l'incisione dei piranha. Trasferisci i vetrini in un supporto per diapositive Duran o in un supporto in teflon su misura e posizionali in un bicchiere da un litro che si trova in una cappa chimica. Riempi il becher con 450 millilitri di acido solforico.

Quindi aggiungere 150 millilitri di perossido di idrogeno per un rapporto di tre a uno tra acido solforico e perossido di idrogeno. Mescolare la soluzione per una corretta miscelazione e lasciare il bicchiere indisturbato per 20 minuti. Togliete i vetrini dalla soluzione piranha e metteteli in un supporto per vetrini contenente millieu di acqua.

Nel frattempo, gettare la soluzione di piranha in una bottiglia di rifiuti designata Una volta raggiunta la temperatura ambiente, sciacquare i vetrini tre volte con acqua UE dopo la pulizia del vetrino coprioggetti. Sostituire l'acqua UE nelle vaschette di colorazione con metanolo. Conservare i vetrini e i vetrini coprioggetti nel metanolo.

Nel frattempo, preparare la soluzione di isolazione degli ammino versando 100 millilitri di metanolo nel pallone. Quindi aggiungere cinque millilitri di acido acetico e tre millilitri di tre amminopropili, trimetile e mescolare delicatamente agitando. Sostituire il metanolo nelle vaschette di colorazione contenenti i vetrini e i vetrini coprioggetti con la miscela di reazione di siloizzazione amminica.

Incubare per 20-30 minuti durante l'incubazione, sonicare una volta per un minuto. Successivamente, sostituisci la reazione di isolazione dell'ammino con metanolo. Quindi scartare il metanolo e aggiungere una soluzione di metanolo fresco.

Ripetere questa procedura tre volte per il primo giro di superficie Utilizzando prima il polimero, asciugare i vetrini e i vetrini coprioggetti utilizzando azoto gassoso. Quindi metterli in scatole per pipette pulite parzialmente riempite con acqua milli Q in modo tale che il lato, che deve essere pegilato, sia rivolto verso l'alto. Quindi, aggiungere 64 microlitri del tampone di reazione appena preparato a una soluzione peg preparata.

Pipettare la miscela su e giù per scioglierla completamente. Quindi centrifugare a 16, 100 g per un minuto. Per rimuovere le bolle d'aria, far cadere 70 microlitri della miscela di pegilazione su un vetrino di quarzo essiccato.

Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti asciutto sulla soluzione, incubare i vetrini in un ambiente buio e umido per due ore o durante la notte per conservare i vetrini pegilati e i vetrini coprioggetti. Smontare con cura il vetrino e il vetrino coprioggetti facendo scorrere il vetrino coprioggetti su un lato e sciacquandoli con acqua UE prima di asciugarli con azoto gassoso. Posizionare un paio di vetrini e vetrini coprioggetti in un tubo da 50 millilitri in modo che le superfici pegilate siano rivolte l'una verso l'altra.

Chiudere parzialmente la provetta e aspirarla prima di riempirla di azoto gassoso e avvitare saldamente il coperchio. Conservalo a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Questi passaggi aiutano a preservare la superficie pegilata per un lungo periodo di tempo.

Eseguire un secondo ciclo di pegilazione come descritto nel protocollo di testo immediatamente prima di utilizzare il vetrino per assemblare una camera microfluidica. Posiziona un vetrino di quarzo su una superficie piana con il lato pegilato rivolto verso l'alto. Crea un canale in diagonale sulla superficie pegilata mettendo del nastro biadesivo sopra il vetrino.

Assicurarsi che i fori siano posizionati al centro del canale. Quindi posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti pegilato sulla parte superiore per completare la camera. Con il lato pegilato rivolto verso il basso.

Sigillare la camera premendo il vetrino coprioggetto sulle aree in cui è posizionato il nastro biadesivo. Fallo delicatamente ma accuratamente in modo che la camera diventi sigillata a tenuta stagna. Infine, chiudere i bordi della camera con colla epossidica.

Procedere all'immobilizzazione della streptavidina o della neut travain e aggiungere molecole biotinilate biotinilate per l'imaging di singole molecole come descritto nel protocollo di testo, se l'azione di superficie è stata eseguita con successo, ci sono meno di 10 proteine non specificamente assorbite per area di imaging osservata. Quando da uno a 10 nanomolari di proteine marcate in fluorescenza vengono aggiunte nella camera, quando una qualsiasi delle fasi di pulizia o reazione non è stata eseguita correttamente, il numero di proteine assorbite in modo non specifico aumenta in modo significativo. Ad esempio, se l'incisione del piranha viene saltata, si osserva un assorbimento non specifico 100 volte superiore.

La natura superiore della doppia pegilazione è qui mostrata in modo prominente. È stato osservato che i segnali di fondo delle molecole fluorescenti e della soluzione erano molto più deboli quando veniva utilizzata la doppia pegilazione, come mostrato nel pannello di sinistra. Ciò indica che le proteine vengono respinte in modo più efficace dallo strato doppiamente pegilato.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se eseguita correttamente. Non dimenticare che lavorare con AYA può essere estremamente pericoloso, precauzioni come guanti, occhiali e grembiule adeguati dovrebbero essere sempre presi durante l'esecuzione di questa procedura.