Passivazione della superficie per singola molecola proteica Studi

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere una superficie di vetrino in quarzo funzionalizzata di qualità superiore. Questo risultato si ottiene innanzitutto pulendo i vetri in quarzo forati e i coverslip con acqua e acetone. Successivamente, il vetrino viene attaccato con idrossido di potassio e con la soluzione piranha per migliorare la qualità della superficie.

Successivamente, i vetrini e i coprioggetti vengono funzionalizzati con gruppi amminici, seguiti da due cicli di attivazione della superficie mediante un polimero per rendere inerte la superficie del vetro. L'ultimo passaggio consiste nell'assemblare la camera microfluidica a partire dal vetrino e dal coprioggetto, con le superfici rivestite di polietilenglicole o pegilate poste una di fronte all'altra. In definitiva, una nuova strategia che prevede il trattamento della superficie con molecole di peg in due cicli migliora notevolmente la qualità della passivazione, come osservato mediante microscopia a fluorescenza a singola molecola.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come il rivestimento polimerico dopo l'incisione con ossido di potassio, è che questa tecnica garantisce una qualità superiore. Le persone alle prime armi con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà, poiché è necessario eseguire diversi trattamenti successivi. Per iniziare la foratura, si utilizzano le lamelle di quarzo come descritto nel protocollo testuale.

Pulire i vetrini posizionandoli in un barattolo di vetro per colorazioni. Tipicamente, da cinque a quindici vetrini possono essere collocati in un singolo barattolo. Risciacquare quindi i vetrini con acqua UE dopo aver ripetuto il risciacquo tre volte, sottoporre i vetrini a sonificazione con acqua UE per cinque minuti per rimuovere lo sporco, smaltire l'acqua e risciacquare i vetrini ulteriori tre volte con acqua UE.

Successivamente, sostituire l'acqua UE con acetone e sottoporre a sonica i vetrini con acetone per 20 minuti o più a lungo, scartare l'acetone e risciacquare i vetrini con acqua Milli Q per rimuovere eventuali residui di acetone. Successivamente, sostituire l'acqua con idrossido di potassio 1 M e sottoporre a sonica i vetrini per 20 minuti o più a lungo. Un'incisione eccessiva migliorerà la qualità della superficie, ma introdurrà graffi che potrebbero interferire con l'immagine di fluorescenza.

Risciacquare le vetture con acqua Milli Q per tre volte per rimuovere tracce di idrossido di potassio prima di eseguire l'incisione piranha. Trasferire le vetture in un porta-vetture Duran o in un porta-vetture in teflon su misura e posizionarle in un becher da un litro situato all'interno di una cappa chimica. Riempire il becher con 450 millilitri di acido solforico.

Quindi aggiungere 150 millilitri di perossido di idrogeno per ottenere un rapporto di tre a uno tra acido solforico e perossido di idrogeno. Mescolare la soluzione per una corretta omogeneizzazione e lasciare il becher indisturbato per 20 minuti. Rimuovere i vetrini dalla soluzione piranha e posizionarli in un portavetrini contenente acqua millieu.

Nel frattempo, smaltire la soluzione di piranha in un apposito contenitore per rifiuti. Una volta raggiunta la temperatura ambiente, risciacquare i vetrini tre volte con acqua UE dopo la pulizia dei coprioggetti. Sostituire l'acqua UE nelle vaschette di colorazione con metanolo. Mantenere i vetrini e i coprioggetti in metanolo.

Nel frattempo, preparare la soluzione di silanizzazione amminica versando 100 millilitri di metanolo nel flacone. Aggiungere quindi cinque millilitri di acido acetico e tre millilitri di tre amino propile, trimetile, e mescolare delicatamente agitando. Sostituire il metanolo nelle vaschette di colorazione contenenti i vetrini e i coprioggetti con la miscela di reazione per la silanizzazione amminica.

Incubare per 20-30 minuti; durante l'incubazione, sottoporre a sonicazione una volta per un minuto. Successivamente, sostituire la reazione di aminoisililazione con metanolo. Quindi scartare il metanolo e aggiungere una soluzione fresca di metanolo.

Ripetere questa procedura tre volte per il primo ciclo di attivazione della superficie. Dopo aver utilizzato il polimero, asciugare le lamelle e i coverslip con gas azoto. Successivamente, posizionarli in scatole per pipette pulite parzialmente riempite con acqua milli Q, in modo che il lato da peghilare sia rivolto verso l'alto. Quindi, aggiungere 64 microlitri del buffer di reazione appena preparato a una soluzione di peg precedentemente preparata.

Pipettare la miscela su e giù per scioglierla completamente. Quindi centrifugare a 16.100 G per un minuto. Per rimuovere le bolle d'aria, depositare 70 microlitri della miscela di peghilazione su un vetrino di quarzo asciutto.

Posizionare delicatamente un'ampolla asciutta sulla soluzione, quindi incubare i vetrini in un ambiente buio e umido da due ore a tutta la notte per conservare i vetrini e le ampolle peghilati. Smontare con attenzione il vetrino e l'ampolla facendo scivolare quest'ultima di lato e risciacquandoli con acqua UE prima di asciugarli con gas azoto. Posizionare una coppia composta da vetrino e ampolle in un tubo da 50 millilitri in modo che le superfici peghilate siano rivolte l'una lontano dall'altra.

Chiudere parzialmente il tubo ed esporlo al vuoto prima di riempirlo con gas azoto e avvitare saldamente il coperchio. Conservarlo a meno 20 gradi Celsius. Questi passaggi contribuiscono a preservare la superficie peghilata per un lungo periodo di tempo.

Eseguire un secondo ciclo di peghilazione come descritto nel protocollo testuale immediatamente prima di utilizzare il vetrino per assemblare una camera microfluidica. Posizionare un vetrino di quarzo su una superficie piana con il lato peghilato rivolto verso l'alto. Creare un canale in diagonale sulla superficie peghilata applicando del nastro adesivo doppio su un lato sul vetrino.

Assicurarsi che i fori siano posizionati al centro del canale. Quindi posizionare delicatamente un'immersione rivestita con pegilato sulla parte superiore per completare la camera, con il lato pegilato rivolto verso il basso.

Sigillare la camera premendo il vetrino coprioggetto sulle aree in cui è posizionato il nastro biadesivo. Eseguire l'operazione delicatamente ma accuratamente, in modo che la camera risulti perfettamente sigillata e impermeabile. Infine, chiudere i bordi della camera con colla epossidica.

Procedere all'immobilizzazione della streptavidina o della neutrauvina e aggiungere molecole biologiche biotinilate per l'analisi di singole molecole come descritto nel protocollo testuale. Se la funzionalizzazione della superficie è stata eseguita con successo, si osservano meno di 10 proteine assorbite in modo non specifico per area di imaging. Quando viene aggiunta una proteina marcata con un fluorocromo alla concentrazione di uno a 10 nanomolari nella camera, se uno qualsiasi dei passaggi di pulizia o di reazione non è stato eseguito correttamente, il numero di proteine assorbite in modo non specifico aumenta significativamente. Ad esempio, se si salta l'incisione con piranha, si osserva un assorbimento non specifico 100 volte maggiore.

La natura superiore della doppia pegilazione è chiaramente evidente in questo caso. I segnali di fondo provenienti dalle molecole fluorescenti e dalla soluzione risultano molto più deboli quando viene utilizzata la doppia pegilazione, come mostrato nel pannello sinistro. Ciò indica che le proteine vengono respinte in modo più efficace dallo strato doppiamente pegilato.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se svolta correttamente. Non dimenticare che lavorare con AYA può essere estremamente pericoloso; precauzioni come l'uso di guanti, occhiali protettivi e grembiule adeguati devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.