Bloccare Registrazioni patch da cellule embrionali Zebrafish Mauthner

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di registrare le proprietà sinaptiche e di eccitabilità delle cellule embrionali di pesce zebra che mettono in bocca le loro cellule. Ciò si ottiene sezionando prima l'embrione di pesce zebra per esporre la superficie ventrale del cervello posteriore. Il secondo passo consiste nel posizionare la preparazione sezionata sul tavolino di un microscopio patch clamp e identificare la bocca nelle loro cellule.

Prossima patch. Fissare le cellule M utilizzando la modalità di registrazione appropriata e registrare l'attività sinaptica e le proprietà di eccitabilità. Il passaggio finale consiste nell'analizzare i dati registrati per accertare le proprietà sinaptiche o di eccitabilità.

In definitiva, il patch clamping di queste cellule viene utilizzato per mostrare le proprietà dei recettori sinaptici in un organismo in via di sviluppo. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno due principali aree di difficoltà. La prima è la dissezione.

La seconda formazione della scena dei concerti può essere impegnativa. Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando ho deciso di lavorare su una preparazione di pesce zebra in cui il cervello posteriore era attaccato al midollo spinale, dimostrando che la procedura sarà Burram Roy, uno studente laureato di dottorato nel mio laboratorio, Iniziare questa procedura preparando il piatto di dissezione rivestito di Sard. Per prima cosa, fissare le rondelle alla slitta con grasso.

Quindi aggiungere il liquido al centro della lavatrice. La sarda di solito stagiona durante la notte e forma un piccolo letto circolare sul vetrino, che diventa la base del piatto di dissezione. Dopo aver posizionato un vetrino coprioggetto sul vetrino, posizionare il vetrino nella camera di registrazione in modo che funga da base per la dissezione.

Successivamente, prepara le soluzioni richieste. Le soluzioni extracellulari devono essere lasciate a temperatura ambiente mentre le soluzioni intracellulari devono essere mantenute sterili. Si può anche aggiungere lo 0,1% sciolto per il giallo alla soluzione intracellulare, in modo che la visualizzazione della morfologia delle cellule M possa essere eseguita alla fine dell'esperimento per confermare l'identità cellulare.

Successivamente, allevare gli embrioni di pesce zebra di tipo selvatico in acqua d'uovo a 28,5 gradi Celsius e raccoglierli e metterli in scena secondo la pubblicazione precedente. Per la dissezione, trasferire gli embrioni nella piastra di dissezione che funge anche da camera di registrazione. Quindi anestetizzarli per sette-10 minuti.

In una soluzione salina anestetizzante che si avvicina molto alla soluzione fisiologica, si può determinare se sono adeguatamente anestetizzati esaminando la risposta a un leggero pizzicamento della coda. Successivamente, fissare gli embrioni attraverso l'accordo e sul piatto della linea di protezione SIL con un filo di tungsteno da 0,001 pollici sotto un microscopio da dissezione con ingrandimento 25x. Regolare l'ingrandimento del cannocchiale da dissezione a 40-50 x per eseguire la dissezione.

Ora, rimuovi la mascella, gli occhi e il proencefalo usando un bel paio di pinze. Staccare delicatamente il rombencefalo dal cordone linfonodale sottostante lavorando con cura la pinza tra il cordone nodale e il cervello. Quindi capovolgere delicatamente il cervello posteriore in modo che la superficie ventrale sia rivolta verso l'alto.

Questo posizionamento fornisce un buon accesso alle cellule M, che di solito si trovano entro 5-10 micrometri dalla superficie ventrale negli embrioni giovani e da 20 a 50 micrometri nelle larve più vecchie. Quindi, spostare con cautela la preparazione nella configurazione di registrazione in cui è possibile eseguire l'esperimento di patch clamp. Le cellule M vengono visualizzate con contrasto interferenziale differenziale, sebbene possano essere utilizzate anche altre modalità di imaging per prepararsi al patch clamping.

Iniziare tirando alcune pipette CLA patch con vetro silicato bo a parete sottile. In una pipetta a trazione orizzontale, i diametri della punta sono di circa 0,2-0,4 micrometri dopo la lucidatura a fuoco fino a un bordo liscio e la conicità del gambo è lunga circa quattro millimetri. Riempire il puntale della pipetta con la soluzione intracellulare immergendo il puntale nel liquido intracellulare.

Quindi inserire un ago per siringa nella pipetta ed espellere delicatamente la soluzione intracellulare dalla siringa. Per completare il riempimento della pipetta, collegare la pipetta allo stadio della testina dell'amplificatore Nella configurazione dell'elettrofisiologia, è importante mantenere lo stadio della testa a un angolo di circa 45 gradi rispetto all'asse orizzontale in quanto ciò garantisce un angolo di ingresso per la pipetta adatto alla formazione di guarnizioni ad alta resistenza con la bocca nella loro cella subito prima che la pipetta si abbassi nella soluzione del bagno, Applicare una piccola quantità di pressione positiva sulla pipetta per ridurre la possibilità di blocco del puntale. Continuare ad avvicinarsi alla cellula M con una piccola quantità di pressione positiva nella pipetta.

La pressione positiva spinge delicatamente la cellula da un lato all'altro e, quando viene posizionata immediatamente sopra la cellula, forma una piccola fossetta sulla membrana cellulare. Lasciare ora la pipetta in posizione per alcuni secondi per pulire delicatamente la superficie cellulare in modo da poter formare una forte tenuta tra la pipetta e la membrana. Quindi rilasciare la pressione positiva nella pipetta per avviare la sigillatura.

Una piccola quantità di pressione negativa unita a un potenziale di pipetta negativo provoca la formazione di sigilli giga in pochi secondi. Successivamente, modificare il potenziale di tenuta nell'amplificatore a meno 60 millivolt. Rompere la membrana cellulare con una serie di brevi impulsi di aspirazione.

Quindi registrare immediatamente i potenziali di membrana e ridurre al minimo gli artefatti di capacità. Compensare la capacità della cella e la resistenza di accesso dal 70 all'85%La resistenza di accesso deve essere monitorata ogni 30 secondi o un minuto e, se c'è una variazione del 20% o più, interrompere l'esperimento. Una volta terminato l'esperimento e acquisiti dati sufficienti, sacrificare l'embrione rimuovendo il cervello posteriore con un paio di pinze.

Questa figura mostra le registrazioni rappresentative delle correnti eccitatorie del recettore A MPA e NMDA ottenute da 48 embrioni HPF. Ecco le PSC spontanee A MPA ME registrate da una cella M con un potenziale di mantenimento di meno 60 millivolt. E questa è la media dei PSC ME.

Ecco le PSC spontanee A, MPA e NMDA, me, registrate da una cella M a un potenziale di mantenimento di 40 millivolt. E questa è la media ME, le PSC di glutammato me, le PSC sono state registrate in presenza di un TTX micromolare per bloccare i potenziali d'azione, cinque micromolari rigorosi nove e 100 ritossina micromolare per bloccare la glicina e l'occorrenza di G mostrata. Ecco le PSC MI spontanee registrate da una cella M con un potenziale di mantenimento di meno 60 millivolt.

E le PSC MI medie sono state registrate in presenza di un TTX micromolare per bloccare i potenziali d'azione. Un millimolare di acido chimerico per bloccare l'attività del recettore del glutammato e 10 micromolari di Qing per bloccare l'insorgenza del GABA. Questi sono i potenziali d'azione registrati da una cellula M in questa particolare cellula.

Uno stimolo di soglia SRA di 0,48 nano ampere ha suscitato diversi potenziali d'azione, ma uno stimolo alla soglia si traduce solo nella produzione di un singolo potenziale d'azione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o quattro ore se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare patch clamp record da cellule M e altri neuroni spinali reticolari in embrioni di zebrafish.