Name: Esame delle vescicole sinaptiche Riciclaggio Uso FM coloranti Durante evocati, spontaneo, e miniatura Attività Synaptic (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Scopri l'uso dei coloranti FM stirilici per visualizzare il riciclaggio delle vescicole sinaptiche in terminali nervosi funzionali. Questo metodo permette di analizzare attività sinaptiche evocate e spontanee.

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Gli autori ringraziano i membri del laboratorio Harata per utili discussioni durante l&#39;esecuzione di questo lavoro. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal American Heart Association, la distonia Fondazione di ricerca medica, l&#39;Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, la National Science Foundation e la Fondazione Whitehall a NCH

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Abbiamo descritto protocolli per la colorazione e decolorazione vescicole sinaptiche in risposta evocata, attività sinaptica spontanea e miniatura, e per l&#39;imaging durante la fase di decolorazione. Oltre ai protocolli esistenti, abbiamo incluso un nuovo protocollo di osservare il decolorante FM basato su attività sinaptica miniatura. L&#39;utilizzo di questi protocolli, abbiamo precedentemente identificato anomalie nei neuroni in coltura da un modello murino della malattia movimento distonia. In confronto alle loro ...

La funzionalità di vescicole sinaptiche è un importante determinante della trasmissione sinaptica. Tali vescicole rilasciano neurotrasmettitori quando si fondono con la membrana plasmatica presinaptica (esocitosi), e sono pronte per un altro ciclo di stampa dopo essere rigenerata dalla membrana plasmatica (endocitosi) e ricaricato con neurotrasmettitore. La ricerca sulla dinamica dei meccanismi sottostanti e riciclo delle vescicole sinaptiche è stata notevolmente accelerato dall&#39;introduzione di coloranti styryl FM 1. Queste molecole anfipatiche, che hanno carica positiva gruppi di testa idrofile e code idrofobiche (più coloranti in figura 1A, stereoview di FM1-43 in Figura 1B), possono reversibilmente entrare e uscire membrane lipidiche senza permea. Gruppi di coloranti FM condividono caratteristiche simili che influenzano la gamma di luce che essi emettono. Ad esempio, FM2-10, FM1-43, e FM1-84 hanno un doppio legame tra due composti ciclici e show emissione verde. La differenza tra loro è la lunghezza della coda idrofoba, che determina la sua idrofobicità e quindi il tasso di uscita dalla membrana (departitioning). Nei casi di FM5-95 e FM4-64, tre doppi legami collegano i composti ciclici, e mostrano emissione rossa. Questi coloranti differiscono rispetto alle loro parti idrofile. In tutti i coloranti FM, l&#39;intensità di fluorescenza aumenta quando inseriti nelle membrane biologiche, a causa di un aumento della resa quantica nell&#39;ambiente idrofobo rispetto all&#39;ambiente idrofilo. Così i cambiamenti di intensità FM rappresentano le variazioni del fatturato membrana. I diversi colori (spettri di emissione) e idrofobicità rendono la FM tinge uno strumento di ricerca versatile nel riciclo delle vescicole sinaptiche. Sulla base di queste caratteristiche, i coloranti FM sono principalmente utilizzati secondo il seguente schema nell&#39;analisi riciclo delle vescicole sinaptiche (Figura 2). Neurons sono immersi in una soluzione extracellulare contenente il colorante FM, permettendogli di essere ripreso in vescicole sinaptiche (SVs), in quanto costituiscono via endocitosi (colorazione). Il colorante viene poi lavata applicando una soluzione extracellulare priva di coloranti; questo rivela terminazioni nervose funzionali, cioè solo quelli sottoposti attivamente endocitosi conterrà un cluster di vescicole sinaptiche che vengono caricati con il colorante (Figura 2 in basso). Esocitosi successiva porta alla perdita del colorante FM allo spazio extracellulare e una perdita concomitante di fluorescenza (decolorante, dovuto sia alla departitioning ad un ambiente idrofilo e diffusione lontano dal sito di esocitosi). Pertanto le variazioni di intensità di fluorescenza FM sono indicatori di vescicole sinaptiche eso-ed endocitosi. Coloranti FM sono stati utilizzati per macchiare e Destain le vescicole sinaptiche in vari organismi e preparati 2,3. Gli esempi includono neur mammifericulture onal 4-9, mammiferi fettine di cervello 10,11, giunzioni neuromuscolari 12,13, retina neuroni bipolari 14,15 e le cellule ciliate della coclea 16. Tipicamente in tali esperimenti, sia di colorazione e decolorazione sono innescati da ampiamente stimolando i neuroni (attività evocata). Recentemente, tuttavia, riciclo delle vescicole sinaptiche in risposta alla stimolazione debole è stato anche analizzato, come ha riciclo in assenza di uno stimolo esterno (attività sinaptica spontanea e miniatura) 9,17-19. Attività sinaptiche spontanee e miniaturizzati sono definiti come quelle che si verificano in assenza di stimoli esterni, le prime riguardano la scarica spontanea dei potenziali d&#39;azione (Figura 3). Queste attività sinaptiche deboli sono associati a piccoli cambiamenti nei segnali FM rispetto a quelli attivati ​​dalla stimolazione ampio. La misurazione richiede che le variazioni fl FMIntensità mento riflette accuratamente synaptic esocitosi delle vescicole o endocitosi ma le modifiche non artefatti di intensità. Una causa del manufatto è la presenza di marcatura non specifica della membrana plasmatica da coloranti FM. Washout graduale di questo componente comporti un cambiamento graduale nell&#39;intensità di fluorescenza misurata, che sarà erroneamente attribuita ad attività sinaptica. Questo fattore può essere ridotto con metodi appropriati (vedi Protocol). La causa più notevole del manufatto è il photobleaching di colorante FM trattenuto all&#39;interno vescicole sinaptiche. I cambiamenti Fotodecolorazione relativi a intensità FM devono essere piccoli in confronto ai biologiche (Synaptic) le modifiche che vengono misurati. Il recente sviluppo di telecamere sensibili, per esempio la fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica-elettroni moltiplicando (EMCCD), permette di minimizzare photobleaching accorciando il tempo di esposizione e indebolendo l&#39;intensità della luce usata per eccitare il fluoroforo. Un&#39;altra causa del manufatto è a i driftn il livello di messa a fuoco del microscopio ottico. La deriva fuoco durante una sessione di imaging può essere causato da effetti meccanici o termici, e verrà erroneamente portare ad un cambiamento nell&#39;intensità di fluorescenza misurata. Qui si descrive protocolli e apparecchiature che consentono di utilizzare coloranti FM analizzare riciclo delle vescicole sinaptiche anche nell&#39;ambito di stimolazione debole o non, in particolare, l&#39;attività sinaptica miniatura. Mostriamo esempi di colorazione e decolorazione delle vescicole sinaptiche durante gli eventi evocati e spontanei, utilizzando colture di neuroni dell&#39;ippocampo roditori, e di imaging la fase di decolorazione. Dimostriamo anche il modo di valutare il grado di FM colorante photobleaching, in assenza di eventuali perdite colorante FM a causa di attività sinaptica.

<table><tbody><tr><td>Generatore di impulsi</td><td>AMPI</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/" target="_blank"&gt;Stimolatore isolato&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Digitimer</a></td><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds3-isolated-constant-current-stimulatorstimulus-isolator/" target="_blank"&gt;DS3&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>Viene utilizzato per valutare la morfologia cellulare a basso ingrandimento.</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TiE</td><td>Viene utilizzato per l'acquisizione di immagini in fluorescenza e in luce trasmessa ad alta risoluzione, con minima deriva del fuoco.</td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Nikon</td><td></td><td>Si consiglia un obiettivo ad immersione in acqua. Un obiettivo ad immersione in olio può essere utilizzato a meno che la struttura da immagine non si trovi a grande profondità rispetto alla superficie del coprioggetto (&lt;i&gt;e.g.&lt;/i&gt; &gt;10 &amp;mu;m).</td></tr><tr><td>Cubo filtro</td><td>Nikon</td><td>77032509</td><td>490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em per FM1-43</td></tr><tr><td>Cubo filtro</td><td>Nikon</td><td>77032809</td><td>490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em per FM4-64.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Camera EMCCD</td><td>Andor Technology</td><td>iXon EM+ DU-860</td><td>Questa camera EMCCD viene utilizzata per la rilevazione ad alta sensibilità della fluorescenza.</td></tr><tr><td>Chiller a circolazione liquida</td><td>Solid State Cooling Systems</td><td>Oasis 160</td><td>Viene utilizzato per perfondere continuamente la camera con acqua refrigerata al fine di mantenere una temperatura di -80&amp;deg;C, riducendo così il rumore.</td></tr><tr><td>LED</td><td>CoolLED-Custom Interconnect</td><td>490 nm</td><td>Questa sorgente luminosa viene utilizzata per il controllo rapido di accensione/spegnimento dell'eccitazione della fluorescenza.</td></tr><tr><td>Software di acquisizione immagini</td><td>Andor Technology</td><td>Solis</td><td></td></tr><tr><td>Camera di imaging</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-21BRFS</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di perfusione rapida</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-77B</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>D,L-AP5</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0106</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotossina</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1069</td><td>Attenzione: reagente tossico. Manipolare con cautela.</td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Invitrogen</td><td>T35356</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43 fissabile con aldeidi (FM1-43FX)</td><td>Invitrogen</td><td>F35355</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64 fissabile con aldeidi (FM4-64FX)</td><td>Invitrogen</td><td>F34653</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Sale fisiologico equilibrato di Hanks&amp;rsquo;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo Essenziale Minimo</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td>Questa soluzione non contiene rosso fenolo, che potrebbe interferire con l'imaging in fluorescenza.</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Attenzione: reagente tossico. Manipolare con cautela.</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr></tbody></table>

esame delle vescicole sinaptiche riciclaggio uso fm coloranti durante evocati, spontaneo, e miniatura attività synaptic

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Vescicole sinaptiche nelle terminazioni nervose funzionali subiscono esocitosi e endocitosi. Questo riciclo delle vescicole sinaptiche può essere efficacemente analizzata utilizzando coloranti stirilico FM, che rivelano fatturato membrana. Protocolli convenzionali per l&#39;uso di coloranti FM sono stati progettati per analizzare neuroni seguente stimolata (evocati) attività sinaptica. Recentemente, protocolli sono resi disponibili per analizzare i segnali FM che accompagnano attività sinaptica deboli, come eventi sinaptici spontanei o miniatura. L&#39;analisi di queste piccole variazioni di segnali FM richiede che il sistema di imaging è sufficientemente sensibile per rivelare piccole variazioni di intensità, ma che i cambiamenti artefatti di grande ampiezza vengono soppressi. Qui si descrive un protocollo che può essere applicato a evocata, spontanea, e attività sinaptiche in miniatura, e utilizzando colture di neuroni ippocampali come esempio. Questo protocollo incorpora anche un mezzo per determinare il tasso d&#39;photobleaching di coloranti FM, in quanto questo è un significativofonte di artefatti quando di imaging piccole variazioni di intensità.

Come esempio, mostriamo risultati rappresentativi per il decorso decolorante di vescicole sinaptiche (Figura 4). Neuroni dell&#39;ippocampo in coltura sono state colorate con FM4-64 utilizzando l&#39;attività sinaptica spontanea (fase 2.3) e lavato con una soluzione priva di colorante (soluzione di risciacquo 2). La rappresentazione mostra l&#39;andamento iniziale tempo decolorante utilizzando attività spontanea (passo 5.3) (parte iniziale della linea continua, Figura 4A). Segue il deco...

Descriviamo l&#39;uso di coloranti stirilico FM per l&#39;immagine riciclo delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi funzionali. Questo protocollo può essere applicato non solo evocata, ma anche spontanea e attività sinaptiche in miniatura. Il protocollo espande la varietà di eventi sinaptici che possono essere adeguatamente valutati.

Esame delle vescicole sinaptiche Riciclaggio Uso FM coloranti Durante evocati, spontaneo, e miniatura Attività Synaptic

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

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Neuroscience

Neuroscienze

La capacità di misurare la cinetica di rilascio delle vescicole può contribuire a fornire indicazioni in alcuni dei principi fondamentali della neurotrasmissione. Qui abbiamo usato imaging in tempo reale delle vescicole etichettati con il colorante rosso fluorescente FM 4-64 per misurare la velocità di rilascio delle vescicole presinaptiche in culture neuronali dell'ippocampo.

Misurare esocitosi nei neuroni Utilizzando Etichettatura FM

Coloranti FM sono stati di enorme aiuto nella comprensione delle dinamiche sinaptiche. FM sono normalmente seguiti sotto il microscopio a fluorescenza in condizioni di stimolazione differenti. Tuttavia, fotoconversione di coloranti FM combinato con il microscopio elettronico permette la visualizzazione di diverse piscine delle vescicole sinaptiche, tra i componenti ultrastruttura altro, in boutons sinaptica.

Studiare Piscine vescicole sinaptiche con fotoconversione di coloranti Styryl

Una tecnica dal vivo imaging di fluorescenza per quantificare la ricostituzione e la mobilitazione di specifiche vescicole sinaptiche (SV) piscine in terminazioni nervose centrale è descritto. Due tornate di SV riciclaggio sono monitorati nei terminali nervosi pur prevedendo un controllo interno.

Analisi quantitativa di Replenishment pool delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni granuli cerebellari utilizzando coloranti FM

Questo video dimostra un protocollo per studiare il riciclaggio delle vescicole sinaptiche alle giunzioni neuromuscolari nelle larve di Drosophila che esprimono canalrodopsina utilizzando un colorante fluorescente. La luce blu attiva le canalrodopsine, causando l'afflusso di calcio e l'esocitosi delle vescicole sinaptiche. Il colorante si integra nelle membrane neuronali e viene internalizzato durante l'endocitosi, con conseguente miglioramento della fluorescenza. Un'ulteriore stimolazione...

Analisi del riciclaggio delle vescicole sinaptiche e dell'assorbimento del colorante fluorescente nelle larve di Drosophila

Questo articolo fornisce un metodo per studiare la dinamica delle vescicole dei neurotrasmettitori nelle cellule di neuroblastoma, utilizzando un costrutto di sinaptobrevina2-pHluorin e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Viene inoltre riportata la strategia sviluppata per l'elaborazione delle immagini e l'analisi dei dati.

TIRFM e GFP-sonde pH-sensibile per valutare Neurotransmitter Vesicle Dynamics in cellule SH-SY5Y neuroblastoma: cell imaging e analisi dei dati

Endocitosi delle vescicole sinaptiche sono rilevato da microscopia chiara di pHluorin fuso con proteine delle vescicole sinaptiche e da microscopia elettronica dell'assorbimento della vescicola.

Endocitosi delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni ippocampali di misura

Delle vescicole sinaptiche (SV) la bicicletta è il meccanismo di base della comunicazione intercellulare alle sinapsi neuronali. Rilascio e l'assorbimento della tintura di FM sono il mezzo primario di quantitativamente analizzante SV endo - ed esocitosi. Qui, mettiamo a confronto tutti i metodi di stimolazione per guidare FM1-43 ciclismo alla sinapsi Drosophila giunzione neuromuscolare (NMJ) modello.

Tintura di FM in bicicletta alla sinapsi: confronto tra alto potassio depolarizzazione, elettrica e stimolazione Channelrhodopsin

Descriviamo un test ottico per vescicole sinaptiche (SV) riciclaggio in colture di neuroni. Combinando questo protocollo con doppia transfezione di esprimere un marcatore presinaptica e la proteina di interesse ci permette di individuare siti presinaptici, loro delle vescicole sinaptiche capacità di riciclaggio e di determinare il ruolo della proteina di interesse.

Un test ottico per riciclo delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni che Overexpressing proteine presinaptiche

Sono descritti due metodi correlati per visualizzare gli eventi subcellulari necessari per la trasmissione sinaptica. Questi protocolli consentono il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche utilizzando l'imaging a cellule vive di neuroni in coltura in vitro .

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

La giunzione neuromuscolare larvale di pesce zebra è un modello interessante per lo studio della fisiologia sinaptica. È suscettibile di molte tecniche sperimentali, tra cui l'elettrofisiologia e l'imaging ottico. Qui, descriviamo un protocollo per l'imaging della trasmissione sinaptica utilizzando una sonda basata su pHluorin, sotto un microscopio a epifluorescenza verticale.

Imaging dal vivo del riciclaggio delle vescicole sinaptiche nella giunzione neuromuscolare di zebrafish larvale sezionato

Scopri l'uso dei coloranti FM stirilici per visualizzare il riciclaggio delle vescicole sinaptiche in terminali nervosi funzionali. Questo metodo permette di analizzare attività sinaptiche evocate e spontanee.

Esame delle vescicole sinaptiche Riciclaggio Uso FM coloranti Durante evocati, spontaneo, e miniatura Attività Synaptic

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