Name: Localizzazione e quantificazione relativa dei nanotubi di carbonio in cellule con immagini multispettrali Citometria a Flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Scopri un metodo per quantificare e localizzare i nanotubi di carbonio nelle cellule mediante citometria a flusso con imaging multispettrale. Questa tecnica avanzata consente analisi statistiche affidabili per studi di nanotossicologia e nanomedicina.

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Questo lavoro è stato supportato da ANR P2N (Nanother project 2010-NANO-008-04), dalla Region Ile de France (contratto n. E539) e dal CNRS. L'accesso aperto è stato pagato da EMD Millipore.

1. Preparazione di nanotubi di carbonio (CNT) dispersibili in acqua
<ol>
	<li>Disperdere i primi CNT nell'acqua di coltura cellulare, prima di sonicarli per 20 minuti in un sonicatore in acqua di bagno a 20 °C. Se i CNT vengono funzionalizzati con una sonda fluorescente, proteggerli il più possibile dalla luce durante l'esperimento.</li>
</ol>
2. Etichettare le celle con i CNT
<ol>
	<li>Far crescere cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) (ad esempio) su piastre di 25 cm² in terreno DMEM, contenenti il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina streptomicina.</li>
	<li>Preparare soluzioni di CNT a concentrazioni di 0, 10, 20 e 50 μg/ml in terreno completo e incubare le cellule a 37 °C per 20 ore o a 4 °C per 20 ore (2 ml di sospensione di CNT per una piastra da 25 cm²).</li>
</ol>
3. Fissazione cellulare
<ol>
	<li>Rimuovere successivamente il terreno di incubazione; sciacquare le cellule con PBS, tripsinizzare e risospendere le cellule in un terreno DMEM completo. Centrifugare per 5 minuti a 1.200 giri/min.</li>
	<li>Sostituire il terreno prima con paraformaldeide al 4% per 1 ora a 4 °C, poi con PBS per preservarli. Se necessario, le cellule possono essere conservate in questa fase del processo a 4 °C per diversi giorni fino all'analisi citometrica.</li>
	<li>Ogni campione deve contenere circa 10-6 cellule concentrate in 50 μl di PBS. Sospenderli correttamente per evitare aggregati durante l'analisi e filtrarli attraverso un coloratore a rete da 50 μm. 
	Nota: Ogni passaggio deve essere eseguito molto delicatamente per preservare le cellule.</li>
</ol>
4. Acquisizione ImageStream
Usa il citometro a flusso multispettrale ImageStream per acquisire immagini di cellule. 
Alcuni punti devono essere rispettati:
<ol>
	<li>Selezionare un ingrandimento adattato (in questo caso viene utilizzato un obiettivo 40X).</li>
	<li>Se si utilizzano fluorocromi: 
	- Preparare un campione di controllo senza fluorocromo. 
	- Preparare le celle con un controllo positivo monocolore per ogni fluorocromo utilizzato in 
	aggiunta ai tuoi campioni.</li>
	<li>Utilizzare il laser a 488 nm per eccitare il FITC e il canale 02 per raccogliere l'emissione di fluorescenza (passa-banda 480-560 nm). Inoltre, utilizzare anche i canali 01 e 06 rispettivamente per il campo chiaro (BF) e il campo scuro (DF).</li>
</ol>
5. Post Elaborazione - Software di Analisi IDEAS (Versione 4.0)
<ol>
	<li>Tra tutti gli eventi acquisiti, l'analisi deve essere prima ristretta alla popolazione di singole celle: utilizzare un grafico a punti biparametrico che rappresenta il 'rapporto d'aspetto' (cioè larghezza/altezza) rispetto all''area della cella' (parametri applicati alle celle su BF) (Figura 1). Le singole cellule incluse nella regione di interesse con un'area standard e un rapporto di aspetto vicino a 1 vengono quindi discriminate dagli eventi multicellulari (area grande e rapporto di aspetto piccolo) e dai detriti (area estremamente piccola).</li>
	<li>Per selezionare le celle nel piano focalizzato, utilizzare un grafico a punti biparametrico adattato per celle marcate con CNT ad alto contrasto: tracciare il "contrasto" rispetto al "gradiente RMS" (che misura la qualità della nitidezza di un'immagine) sull'immagine BF - consente l'esclusione di celle non focalizzate che mostrano sia un basso gradiente rms che un basso contrasto nelle loro immagini BF (Figura 1).</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Determinare il parametro che fornisce la migliore separazione statistica tra celle etichettate e non etichettate utilizzando la funzione "trova la funzione migliore". Nel nostro studio, la funzione dell'oggetto pixel medio è il parametro più adatto (Figura 2).</li>
		<li>Tracciare un istogramma utilizzando questo parametro rispetto alla frequenza normalizzata per confrontare la quantità di CNT assorbiti per le concentrazioni testate (Figura 3).</li>
		<li>Tracciare il grafico biparametrico 'mean pixel object on BF' (Notation: Mean Pixel_Object (M01,Ch01,Tight)_Ch01) rispetto a 'intensity on DF'(Intensity_MC_Ch06), al fine di studiare la correlazione tra questi due parametri (Figura 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>La quantificazione viene valutata anche mediante mascherine:
	<ol>
		<li>Poiché i CNT appaiono come macchie scure fortemente assorbenti su BF, creare prima una maschera di soglia che si adatti esattamente ad essi selezionando un intervallo ristretto di pixel con una bassa intensità compresa tra 0 e 533 in questo studio (Maschera 1, notazione: Intensità (M01, BF, 0-533)) (Figura 5). La scelta dell'intensità di soglia viene effettuata sulle celle marcate rispetto alle celle di controllo.</li>
		<li>Al contrario, creare anche una maschera che si adatti con i pixel di alta intensità (150-4095 in questo caso) del DF (Maschera 2, notazione: Intensità (M06, DF, 150-4095)) (Figura 6).</li>
		<li>Tracciare un grafico utilizzando l'area della maschera (1 o 2; (notazione: Area_Intensity(M01, BF, 0-533)per la maschera 1): fornirà una quantificazione relativa dell'internalizzazione dei CNT a diverse concentrazioni (Figura 7).</li>
		<li>Verificare il grado di correlazione tra queste due maschere (grazie al grafico biparametrico 'area della Maschera 1' rispetto ad 'area della Maschera 2') (Figura 7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Creare altre maschere per localizzare i CNT nelle cellule:
	<ol>
		<li>Una maschera che si adatta all'interno della cellula: Erode(M01, 7) - corrispondente alla maschera dell'intera cellula (M01) (Figura 8), che viene ulteriormente erosa di 7 pixel (Figura 9).</li>
		<li>Una maschera che si adatta alla membrana utilizzando solo l'equazione booleana: M01 e non Erode(M01,7) - maschera dell'intera cellula (M01) sottratta dall'interno (Erode(M01,7)) (Figura 10).</li>
		<li>Per considerare i pixel scuri sulla membrana (corrispondenti ai CNT), creare quindi la maschera: Intensità(M01 e non Erode(M01, 7), BF, 0-533) (Figura 11).</li>
		<li>Visualizza le diverse maschere applicate su una raccolta di celle per verificarne la rilevanza (Figura 12) per le celle etichettate e non etichettate.</li>
		<li>Applicare l'area caratteristica sulla maschera selezionando i pixel neri sulla membrana 'Area_Intensità (M01 e non Erode(M01, 7), BF, 0-533)' cosiddetta area nera. Permetterà la quantificazione dei CNT sulla membrana. 
		 
		Per discriminare infine i CNT che sono stati internalizzati da quelli adsorbiti solo sulla membrana, tracciare l'area nera sulla membrana rispetto all'area nera sull'intera cellula (cioè 'Intensità Area_ (M01 e non Erode(M01, 7), BF, 0-533' contro 'Intensità Area_ (M01, BF, 0-533)'). 
		 
		nota: Lo stesso tipo di procedura viene applicata con il segnale fluorescente FITC: confrontare l'aumento dell'intensità della fluorescenza FITC rispetto alla diminuzione del segnale pixel medio sul BF, o la colocalizzazione tra macchie scure su BF e intensità di fluorescenza FITC. Nel nostro caso, questo tipo di analisi non è rilevante perché il segnale di fluorescenza non corrisponde correttamente con le macchie scure su BF da un lato e con il campo chiaro su DF dall'altro, dimostrando che le proprietà intrinseche dei CNT (assorbanza e diffusione della luce) sono più appropriate del segnale relativo alla sonda di fluorescenza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Una volta creati tutti i grafici in una condizione sperimentale, creare un "modello di report statistico", salvare il modello come file .ast e raggruppare tutti i file di dati.</li>
</ol>

<ol><li>Kostarelos, K., Bianco, A., Prato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promises%2C+facts+and+challenges+for+carbon+nanotubes+in+imaging+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Promises, facts and challenges for carbon nanotubes in imaging and therapeutics.</a> Nat. Nano. 4, 627-633 (2009).</li>
<li>De La Zerda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotubes+as+photoacoustic+molecular+imaging+agents+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotubes as photoacoustic molecular imaging agents in living mice.</a> Nat. Nano. 3, 557-562 (2008).</li>
<li>Zavaleta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+Raman+Spectroscopy+in+Living+Mice+for+Evaluation+of+Tumor+Targeting+with+Carbon+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Noninvasive Raman Spectroscopy in Living Mice for Evaluation of Tumor Targeting with Carbon Nanotubes.</a> Nano Lett. 8, 2800-2805 (2008).</li>
<li>Tong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+semiconducting+and+metallic+carbon+nanotubes+in+cells+and+mice+using+transient+absorption+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy.</a> Nat. Nano. 7, 56-61 (2012).</li>
<li>Welsher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+route+to+brightly+fluorescent+carbon+nanotubes+for+near-infrared+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">A route to brightly fluorescent carbon nanotubes for near-infrared imaging in mice.</a> Nat. Nano. 4, 773-780 (2009).</li>
<li>Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+dependent+cellular+uptake+and+expusion+of+single-wall+carbon+nanotubes%3A+single+particle+tracking+and+a+generic+uptake+model+for+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Size dependent cellular uptake and expusion of single-wall carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles.</a> ACS Nano. 3, 149-158 (2009).</li>
<li>Al-Jamal, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+mechanisms+of+functionalised+multi-walled+carbon+nanotubes+by+3D+electron+tomography+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake mechanisms of functionalised multi-walled carbon nanotubes by 3D electron tomography imaging.</a> Nanoscale. 3, 2627-2635 (2011).</li>
<li>Reuel, N. F., Dupont, A., Thouvenin, O., Lamb, D. C., Strano, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Carbon+Nanotubes+within+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Carbon Nanotubes within Living Cells.</a> ACS Nano. 6, 5420-5428 (2012).</li>
<li>Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Cellular+Internalization+of+Nanoparticles+and+Bacteria+by+Multi-spectral+Imaging+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (64), e3884(2012).</li>
<li>Qian, F., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+of+Lineage-specific+Toll-like+Receptor-mediated+Signaling+in+Monocytes+and+Dendritic+Cells+from+Small+Samples+of+Human+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood.</a> J. Vis. Exp. (62), e3741(2012).</li>
<li>Marangon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+Carbon+Nanotube+Translocation+Assessed+by+Flow+Cytometry+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Intercellular Carbon Nanotube Translocation Assessed by Flow Cytometry Imaging.</a> Nano Lett. 12, 4830-4837 (2012).</li>
<li>Lacerda, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+mechanisms+of+chemically+functionalised+carbon+nanotubes+across+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Translocation mechanisms of chemically functionalised carbon nanotubes across plasma membranes.</a> Biomaterials. 33, 3334-3343 (2012).</li>
<li>Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAl-Jamal%2C+KT+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Balasubramanian, K., Burghard, M. 625, Humana Press. 123-124 (2010).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+of+Transmembranal+Mechanism+and+Subcellular+Localization+of+Noncovalently+Modified+Single-Walled+Carbon+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">New Insights of Transmembranal Mechanism and Subcellular Localization of Noncovalently Modified Single-Walled Carbon Nanotubes.</a> Nano Lett. 10, 1677-1681 (2010).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

1. Modifica e risoluzione dei problemi
In questo studio, il primo obiettivo è stato quello di valutare la quantità e la localizzazione dei CNT nelle cellule. La microscopia confocale avrebbe potuto essere a priori il metodo gold per valutare la distribuzione intracellulare dei CNT funzionalizzati con il marcatore fluorescente FITC8,14. Tuttavia, lo svantaggio principale è la limitazione all'imaging di singole cellule e, quindi, la mancanza di dati statisticamente rilevanti. L'ImageStream consente di lavorare oltre questi ostacoli: infatti, eseguendo lo screening di un gran numero di cellule (5.000-10.000) in un breve tempo (<min), produce risultati statisticamente robusti, arricchiti anche dall'imaging ad alta risoluzione che fornisce immagini per ogni cellula con una risoluzione subcellulare (0,5 μm). Rende quindi possibile l'analisi di una grande quantità di dati basati sull'analisi di singole immagini.
Rispetto alla citometria a flusso convenzionale, il vantaggio unico di ImageStream è quello di fornire immagini multispettrali di ciascuna cellula e un confronto pixel per pixel dell'intensità del segnale. Pertanto, ImageStream combina la potenza statistica della citometria a flusso ad alto rendimento con i vantaggi analitici dell'imaging confocale per ogni cellula analizzata. È fondamentale per una quantificazione e localizzazione relativa senza marcatura dei CNT nelle cellule.
2. Passaggi critici all'interno del protocollo
La fase critica consiste nella scelta dei parametri più adatti di ogni studio. Nel nostro caso, il modo migliore è stato quello di basare l'analisi sulle proprietà di assorbimento e scattering dei nanotubi: la buona correlazione tra la localizzazione delle macchie scure su BF e le macchie luminose su DF supporta che il metodo sviluppato è rilevante e affidabile - e potrebbe non essere stato possibile senza l'imaging cellulare.
3. Limiti della tecnica
Va sottolineato che la visualizzazione dei CNT nelle cellule è stata possibile solo perché tendono ad accumularsi nelle vescicole intracellulari endosomiali, per poi apparire come forti punti di assorbimento e dispersione. I singoli nanotubi non dovrebbero essere rilevati sulla base di questo metodo, mentre potrebbero essere eventualmente rilevati con la fluorescenza, il che costituisce una chiara limitazione. In secondo luogo, la quantificazione non è "assoluta" ma relativa per diverse concentrazioni di marcatura e rispetto alle cellule di controllo non marcate. Alcune caratteristiche quantitative (pixel medio, intensità, ecc.) sono parametri assoluti, mentre altre dipendono dalla scelta delle maschere (maschera di soglia, maschere di localizzazione).
4. Importanza rispetto ai metodi esistenti
Per quanto riguarda la fluorescenza, l'analisi di ImageStream evidenzia la scarsa colocalizzazione dei cluster di CNT tra il segnale luminoso FITC e le macchie sugli altri canali. Pertanto, sembra che la fluorescenza non fosse un indicatore affidabile per la quantificazione e la localizzazione dei CNT. Tuttavia, superando i limiti della citometria a flusso convenzionale, che si basa principalmente sulla quantificazione della fluorescenza, l'ImageStream multispettrale ad alto rendimento apre la strada a una quantificazione statistica senza marcatura , fornendo al contempo la localizzazione dei nanotubi di carbonio all'interno delle cellule.
5. Applicazioni future
Questo metodo di nanometrologia statistica ad alto rendimento potrebbe essere generalizzato a qualsiasi nanomateriale, che mostra un elevato assorbimento e dispersione della luce quando interagisce con le cellule. Pertanto, potrebbe avere importanti applicazioni per le indagini sulla nano-bio-interfaccia, la nanotossicologia e la nanomedicina.

Durante gli ultimi decenni, il ruolo delle nanoparticelle ha acquisito importanza in una vasta gamma di applicazioni. In particolare, i nanotubi di carbonio (CNT) sono sempre più esplorati come nanostrumenti per diverse applicazioni diagnostiche e terapeutiche; grazie alle loro particolari proprietà elettriche, termiche e spettroscopiche, i CNT possono fungere da veicoli di rilascio per vari farmaci o agenti di contrasto, o possono anche essere coinvolti nell'ingegneria tissutale1.
Tuttavia, le preoccupazioni sulla potenziale tossicità di tali nanomateriali sono ancora oggetto di dibattito, principalmente perché il destino dei CNT nell'organismo rimane molto controverso. C'è infatti una mancanza di metodi appropriati per rilevarli e quantificarli in cellule e tessuti vivi: ad esempio, sono state suggerite tecniche come la spettroscopia Raman, la fotoacustica e l'imaging in fotoluminescenza nel vicino infrarosso, ma ogni metodo mostra limitazioni a seconda del tipo di nanotubi e/o del loro ambiente2-8.
Qui, il metodo proposto potrebbe essere applicabile per il rilevamento e la quantificazione di nanoparticelle nelle cellule. Ciò è stato reso possibile dall'uso di ImageStream, un dispositivo che combina citometria a flusso e imaging ad alta risoluzione. Combina i vantaggi dell'acquisizione di un'ampia gamma di celle (fino a 5000 eventi/sec) e i vantaggi dei dati statistici e delle immagini ad alta risoluzione di ciascuna cella allo stesso tempo (risoluzione spaziale di 0,5 μm). Generalmente, le immagini vengono raccolte utilizzando una telecamera CCD e sono una rappresentazione bidimensionale in scala di grigi della cellula. La luce viene quantificata per ogni pixel dell'immagine e identifica sia l'intensità che la posizione della fluorescenza o dei componenti con una dimensione subcellulare (ad esempio in BF), consentendo così una potente capacità di discriminare le cellule in base al loro aspetto9,10. 
L'obiettivo era quello di progettare un metodo di nanometrologia che consentisse una valutazione quantitativa della distribuzione e del comportamento dei CNT nelle cellule. In particolare, questo metodo è stato sviluppato per studiare l'assorbimento cellulare, l'elaborazione e l'esocitosi dei CNT da parte delle cellule. Abbiamo evidenziato in primo luogo il complesso traffico cellulare dei CNT e in secondo luogo il trasferimento di questi nanomateriali tra le cellule: i CNT internalizzati dalle cellule fuoriescono dalle loro cellule ospiti quando stressati, si diffondono nello spazio extracellulare e vengono reinternalizzati da cellule naïve, siano esse omotipiche o eterotipiche11
.
Studio precedente ha dimostrato che diversi meccanismi di assorbimento cellulare, attivi o passivi, potrebbero verificarsi a seconda della funzionalizzazione dei CNT e dello stato di aggregazione12. Qui i CNT a parete multipla sono stati funzionalizzati attraverso cicloaddizione 1,3-dipolare e ammidazione e poi derivatizzati con una sonda fluorescente, fluorescenza in isotiocianato (FITC). Al microscopio elettronico a trasmissione, sembrano essere internalizzati dalle cellule individualmente con localizzazione citosolica o come fasci, per lo più presenti nei compartimenti endosomiale e lisosomiale11. Su ImageStream, i CNT raggruppati appaiono con un'alta correlazione come macchie scure su BF e macchie luminose su DF, consentendo una chiara distinzione tra cellule marcate con CNT e cellule di controllo. D'altra parte, la distribuzione del segnale fluorescente emesso dal marcatore fluorescente funzionalizzato con CNT non era altrettanto ben colocalizzata: infatti, probabilmente a causa di un fenomeno di quenching, le macchie fluorescenti verdi non corrispondono necessariamente alle macchie su BF e DF. Ciò indica che, in primo luogo, una sonda fluorescente non è obbligatoria per la rilevazione di CNT con ImageStream e, in secondo luogo, a maggior ragione, che non è completamente rappresentativa sia per la quantificazione che per la localizzazione dei CNT.
Oltre a fornire una quantificazione statistica relativa delle nanoparticelle, questo metodo fornisce anche informazioni riguardanti la localizzazione dei CNT nelle cellule, il che significa che discrimina, ad esempio, i CNT all'interno della cellula rispetto a quelli che sono legati alla membrana plasmatica. La capacità di localizzare i CNT sulle immagini cellulari supera chiaramente i limiti dell'analisi convenzionale della citometria a flusso13. La procedura è stata sviluppata attraverso la creazione di maschere che si adattano a specifiche regioni della cellula e selezionano anche le macchie scure corrispondenti ai CNT caricati.
In generale, questo metodo potrebbe essere applicato per una vasta gamma di esperimenti che coinvolgono la necessità di visualizzazione, o quantificazione, nelle cellule, a condizione che le nanoparticelle utilizzate siano in grado di assorbire fortemente (e/o disperdere) la luce.

<table><tbody><tr><td>ImageStream</td><td><a href="https://www.amnis.com/imagestream.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Amnis</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

localizzazione e quantificazione relativa dei nanotubi di carbonio in cellule con immagini multispettrali citometria a flusso

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

I nanomateriali a base di carbonio, come i nanotubi di carbonio (CNT), appartengono a questo tipo di nanoparticelle che sono molto difficili da discriminare dalle strutture cellulari ricche di carbonio e di fatto non esiste ancora un metodo quantitativo per valutare la loro distribuzione a livello di cellule e tessuti. Quello che proponiamo qui è un metodo innovativo che consente la rilevazione e la quantificazione di CNT nelle cellule utilizzando un citometro a flusso multispettrale (ImageStream, Amnis). Questo dispositivo di nuova concezione integra sia un'elevata produttività di cellule che immagini ad alta risoluzione, fornendo così immagini per ogni cellula direttamente nel flusso e quindi un'analisi delle immagini statisticamente rilevante. Ogni immagine cellulare viene acquisita su canali in campo chiaro (BF), campo scuro (DF) e fluorescenti, dando accesso rispettivamente al livello e alla distribuzione dell'assorbimento della luce, della luce diffusa e della fluorescenza per ciascuna cella. L'analisi consiste quindi in un confronto pixel per pixel di ogni immagine, delle 7.000-10.000 cellule acquisite per ogni condizione dell'esperimento. La localizzazione e la quantificazione dei CNT è resa possibile grazie ad alcune particolari proprietà intrinseche dei CNT: forte assorbanza e diffusione della luce; infatti i CNT appaiono come macchie scure fortemente assorbite su BF e macchie luminose su FD con una precisa colocalizzazione.
Questa metodologia potrebbe avere un impatto considerevole sugli studi sulle interazioni tra nanomateriali e cellule, dato che questo protocollo è applicabile per una vasta gamma di nanomateriali, nella misura in cui sono in grado di assorbire (e/o diffondere) la luce con sufficiente forza.

Una panoramica del principio del dispositivo ImageStream è mostrata nella Figura 1. Esso produce molteplici immagini ad alta risoluzione di ogni cellula in flusso, incluse quelle in campo chiaro (BF), in campo scuro (DF o luce laterale dispersa) e nei canali di fluorescenza, come illustrato nella Figura 2 con tre cellule diverse marcate con CNT. Sono mostrati anche gli overlay di questi canali, che a prima vista illustrano la correlazione.
Poiché tutta l'analisi di post-elaborazione si basa sull'immagine cellulare, la selezione delle cellule a fuoco è cruciale per lo studio (Figura 3). In effetti, la presenza di CNT induce variazioni sia nel contrasto che nel gradiente rispetto alle cellule non marcate: le cellule a fuoco, che hanno internalizzato una quantità significativa di CNT, tendono ad avere un gradiente rms basso (che di solito è l'unico parametro utilizzato per discriminare tra cellule a fuoco versus non a fuoco), ma anche un contrasto elevato, spiegando perché un grafico biparametrico è essenziale. Nella Figura 3 è mostrata la discriminazione tra cellule non a fuoco (area gialla) versus cellule a fuoco (area blu).
I CNT internalizzati dalle cellule sono chiaramente distinguibili, in particolare in BF, dove appaiono come punti scuri fortemente assorbenti (vedere l'effetto di diverse concentrazioni di marcatura, Figura 4). Inoltre, è stato analizzato il segnale medio dei pixel in BF, ottenendo una quantificazione relativa dell'assorbimento: i grafici nella Figura 5 mostrano un aumento significativo all'aumentare della concentrazione di marcatura dei CNT (risultati ottenuti con circa 7.000 cellule per condizione sperimentale).
In secondo luogo, la quantificazione dei CNT è possibile anche mediante l'uso di maschere, applicate o su un intervallo ristretto di pixel scuri del BF o sui pixel ad alta intensità del DF (vedi esempi in Figura 6), corrispondenti ai punti risultanti dalla presenza dei CNT. Pertanto, riportando su grafico l'area di queste maschere è possibile evidenziare anche l'aumento dell'assorbimento (illustrato in Figura 7 con l'area della maschera sul BF, selezionando pixel compresi tra 0-533).
Inoltre, la correlazione tra i punti su BF e DF può essere valutata tracciando l'intensità di DF in funzione del segnale medio dei pixel di BF (come in Figura 8) (analisi indipendente dalla maschera) oppure l'area della maschera su BF (Maschera 1) in funzione dell'area su DF (Maschera 2).
Per quanto riguarda la procedura sviluppata per la localizzazione dei CNT all'interno delle cellule, Figura 9A mostra le diverse maschere che sono state create. Si noti che la robustezza delle maschere di localizzazione (basate sull'erosione della maschera cellulare predefinita) deve essere verificata visivamente su un insieme di cellule etichettate e non etichettate. Le stesse maschere vengono utilizzate per tutti i campioni.
La rappresentazione dell'area totale delle macchie nere sulla membrana cellulare rispetto a quella su tutta la cellula fornisce un indice di internalizzazione per le cellule incubate per 20 ore a 37 °C in confronto all'incubazione di 2 ore a 4 °C (vedere Figura 9B); ciò indica che i CNT si trovano prevalentemente sulla membrana a 4 °C, mentre a 37 °C i CNT sono internalizzati in oltre il 90% delle cellule.
Infine, per quanto riguarda la fluorescenza, questo parametro non è stato utilizzato come indicatore per la quantificazione dei CNT a causa di una correlazione troppo bassa tra le macchie fluorescenti e quelle nel campo chiaro (e nel campo scuro). Infatti, la correlazione tra l'intensità di FITC e il valore medio dei pixel nel campo chiaro indica un coefficiente di correlazione di Pearson pari a -0,2. Nella Figura 10 sono illustrati due casi, in cui il segnale di fluorescenza corrisponde adeguatamente oppure no alla macchia nera nel campo chiaro.
<img alt="Schema del layout ottico di ImageStream: illustrazione della configurazione della citometria a flusso con eccitazione laser e rilevamento." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1. Panoramica del funzionamento generale di ImageStream. Il sistema di imaging multispettrale acquisisce fino a 12 immagini/cella in tre modalità diverse: campo chiaro, campo scuro e fluorescenza. La configurazione comprende 5 laser di eccitazione, con lunghezze d'onda di 405, 488, 560 e 658 nm. La luce proveniente dalle cellule in flusso nella cuvetta viene raccolta mediante diversi obiettivi (in questo studio è stato utilizzato l'obiettivo 40X) e indirizzata all'elemento di decomposizione spettrale, costituito da un insieme di filtri passa-alto disposti in configurazione angolare. La fotocamera CCD che acquisisce le immagini cellulari opera mediante una tecnica chiamata integrazione temporale ritardata (time-delay-integration) per evitare il fenomeno dello streaking delle immagini. È disponibile l'opzione di profondità di campo estesa (EDF).
<img alt="Imaging cellulare, microscopia a fluorescenza, marcatura con FITC, campo chiaro, campo scuro, scala 2 μm, analisi." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Galleria di immagini di cellule marcate con nanotubi di carbonio (50 μg/mL) acquisite mediante ImageStream attraverso diversi canali (campo chiaro (BF), campo scuro (DF), fluorescenza (FITC) e relative sovrapposizioni). I nanotubi di carbonio confinati all'interno dei lisosomi intracellulari appaiono come grandi punti neri nelle immagini a campo chiaro. Al contrario, generano punti luminosi nelle immagini a campo scuro e in quelle a fluorescenza.
<img alt="Analisi di imaging cellulare; diagrammi a dispersione di gradiente RMS rispetto al contrasto; diagramma con dati di morfologia cellulare." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Selezione delle cellule a fuoco. Un diagramma a dispersione bivariato che rappresenta il gradiente quadratico medio (rms) rispetto al contrasto nelle immagini in campo chiaro permette di escludere le cellule fuori fuoco. Nella figura, l'area gialla rappresenta le cellule fuori fuoco, mentre le cellule a fuoco sono indicate in blu. Le cellule fuori fuoco si caratterizzano per un basso contrasto e un basso valore di gradiente rms nell'immagine in campo chiaro. Oltre al gradiente rms, la caratteristica del contrasto è necessaria per discriminare le cellule a fuoco dopo la loro marcatura con nanotubi di carbonio (CNTs).
<img alt="Risposta cellulare a concentrazioni crescenti; immagine al microscopio; studio dei cambiamenti nella morfologia cellulare." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. Assorbimento dipendente dalla dose di CNT visualizzato mediante ImageStream. Il numero e l'area delle macchie nere nelle immagini in campo chiaro aumentano con la dose di CNT durante l'incubazione con le cellule (da 0 a 50 µg/ml). Si noti che le cellule di controllo sono prive di macchie nere.
<img alt="Grafico dell'intensità media dei pixel in equilibrio statico; frequenza normalizzata; risposta alla dose; analisi dei dati." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5. Quantificazione relativa dell'assorbimento di CNT basata sulle immagini in campo chiaro. Gli istogrammi della media delle caratteristiche dei pixel applicati alla maschera "oggetto", che rappresenta l'intera cellula, mostrano chiaramente un comportamento dipendente dalla dose, utilizzabile per la quantificazione. L'intervallo R9 comprende le cellule positive ai CNT.
<img alt="Immagini di microscopia in campo chiaro e in campo scuro, analisi dell'intensità della maschera, differenziazione delle strutture cellulari." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
Figura 6. Creazione di maschere per selezionare le macchie scure nelle immagini in campo chiaro e le macchie luminose in quelle in campo scuro. Poiché i nanotubi di carbonio (CNT) appaiono come macchie scure fortemente assorbenti nell'immagine in campo chiaro, viene creata una maschera con soglia per selezionare un intervallo ristretto di pixel con bassa intensità compresa tra 0-533 in questo studio (Maschera 1, notazione: Intensity(M01, BF, 0-533)). Al contrario, una maschera che seleziona i pixel ad alta intensità (150-4095 in questo caso) nell'immagine in campo scuro (Maschera 2, notazione: Intensity (M06, DF, 150-4095)) viene utilizzata per identificare le macchie luminose in campo scuro, corrispondenti a zone con elevata diffusione della luce.
<img alt="Grafico della distribuzione di frequenza dell'intensità dell'area a concentrazioni variate; controllo fino a 50 μg/mL." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 7"> 
Figura 7. L'assorbimento dose-dipendente dei CNT è dimostrato dalla quantificazione dell'area delle macchie nere nelle immagini BF. Applicando una maschera di soglia (mask 1) sull'immagine BF, è possibile quantificare l'area delle macchie nere per ogni cellula, mostrando una distribuzione dipendente dalla dose.
<img alt="Scatter plot showing pixel intensity and object area analysis for image data comparison." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 8"> 
Figura 8. I metodi di quantificazione dei CNT basati su immagini in luce brillante (assorbimento) e in luce oscura (diffusione) sono correlati. A sinistra, valore medio dei pixel nell'immagine in campo chiaro contro intensità nell'immagine DF, mostrano una buona correlazione per le cellule marcate con CNT50 µg/ml) (coefficiente di correlazione di Pearson r = -0,68). A destra, area della maschera adattata alle macchie scure in BF contro area della maschera adattata ai punti luminosi in DF per cellule marcate con CNTs (50 µg/ml). Il coefficiente di correlazione di Pearson è r = -0,83. Sono riportati i valori di 7.000 cellule.
<img alt="Diagramma di analisi cellulare con effetti della temperatura, grafici a dispersione, valutazione dell'area della membrana in diverse condizioni." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 9"> 
Figura 9. Localizzazione dei nanotubi di carbonio (CNT) nelle cellule mediante l'uso di maschere specifiche. (A) Vengono create maschere per adattarsi a una particolare localizzazione della cellula, da sinistra a destra: l'intera cellula, soltanto la membrana e l'interno della cellula. Un’altra maschera rileva le macchie nere grazie a una soglia di intensità (Maschera 1, notazione: Intensity(M01, BF, 0-533). (B) La valutazione della localizzazione dei CNT può essere ottenuta misurando l'area delle macchie nere in diverse localizzazioni cellulari, utilizzando le maschere di localizzazione descritte in A. L'incubazione con CNT (50 µg/ml) è stata eseguita sia a 37 °C che a 4 °C per inibire il percorso di internalizzazione. Il grafico che rappresenta l'area nera sulla membrana rispetto all'area nera sull'intera cellula mostra un'assorbimento dose-dipendente dei CNT sulla membrana a 4 °C, mentre l'internalizzazione completa dei CNT risulta efficace a 37 °C.
<img alt="Microscopia fluorescente, analisi cellulare, colorazione con FITC, sovrapposizione di campo chiaro e fluorescenza." fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 10"> 
Figura 10. Colocalizzazione delle macchie nere indotte dai CNT su campo chiaro (BF) con macchie luminose fluorescenti nell'immagine FITC. Le macchie luminose fluorescenti non sono sempre colocalizzate con le macchie nere su campo chiaro. La corrispondenza è corretta per le prime due cellule mostrate, ma non per le ultime due cellule.

In questo studio, lo scopo principale era monitorare l'assorbimento cellulare e l'eventuale esocitosi dei nanotubi di carbonio (CNT). Da questo punto di vista, abbiamo proposto un metodo unico che utilizza la citometria a flusso con imaging multispettrale che consente una quantificazione e localizzazione di CNT in un numero statisticamente rilevante di cellule.

Localizzazione e quantificazione relativa dei nanotubi di carbonio in cellule con immagini multispettrali Citometria a Flusso

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è fornire un metodo nanometrologico per monitorare e quantificare l'assorbimento cellulare di nanotubi di carbonio in un numero statisticamente rilevante di cellule. Questo risultato si ottiene trattando innanzitutto le cellule con nanotubi di carbonio disperdibili in acqua, che entrano nelle cellule in modo dipendente dalla concentrazione. Successivamente, questi nanotubi di carbonio vengono marcati con un marcatore fluorescente.Successivamente alla fissazione, ogni cellula viene acquisita in campo chiaro, campo scuro e canali fluorescenti di un citometro a flusso con imaging multispettrale. Per visualizzare la distribuzione dei nanotubi di carbonio e il livello di assorbimento della luce, della luce diffusa e della fluorescenza indotta dall'etichettatura dei nanotubi in ogni cellula su base pixel per pixel. In definitiva, l'assorbanza intrinseca della luce e la diffusione all'interno delle cellule permettono la localizzazione e la quantificazione dei nanotubi di carbonio.Pertanto, questo metodo può contribuire a rispondere a nuove domande nei campi della nano tossicologia e della nanomedicina, come l'impatto e il destino dei materiali a base di carbonio nelle cellule vive, e anche il potenziale dei nanotubi di carbonio come sistema di somministrazione di farmaci. Iniziare disperdendo i nanotubi di carbonio, eventualmente coniugati a un marcatore fluorescente, in acqua per colture cellulari. Successivamente, sottoporre i nanotubi a sonificazione in un bagno ad ultrasuoni a 20 gradi Celsius per 20 minuti. Poi, diluire i nanotubi a concentrazioni di 0, 10, 20 e 50 microgrammi per millilitro in mezzo completo, e incubare due millilitri di ciascuna diluizione con le cellule di interesse in una piastra da 1,25 centimetri quadrati per ogni diluizione a 37 gradi Celsius. Dopo 20 ore, rimuovere il mezzo di incubazione da ogni piastra e risciacquare le cellule marcate con i nanotubi di carbonio con PBS.Dopo il lavaggio, la tripsina osserva le cellule su ogni piastra e quindi le risospende in mezzo DMEM completo. Successivamente, trasferire ogni campione in provette falcon individuali da 15 millilitri e centrifugare le cellule per cinque minuti a 200 ×g e a temperatura ambiente. Risospendere ogni pellet in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius per un'ora.Dopo la fissazione, centrifugare nuovamente le cellule e risospendere ogni campione pellettato a 15 volte 10 alla quinta cellule in 150 microlitri di PBS. Quindi filtrare i campioni attraverso filtri individuali da 50 micron per acquisire immagini delle cellule con un image stream. Citometro a flusso con imaging multispettrale.Per prima cosa, selezionare un'ingrandimento adatto e quindi acquisire le immagini dei campioni di interesse. Utilizzare un laser a 685 nanometri per acquisire il campo scuro e impostare il citometro a flusso. Impostare il canale numero sei per raccogliere l'emissione in campo scuro con un filtro passa-banda da 745 a 800 nanometri.Acquisire le immagini dei campioni nei canali campo chiaro numero uno e campo scuro numero sei per l'analisi delle immagini. Inizialmente, creare un grafico a dispersione parametrico con rapporto larghezza/altezza rispetto all'area cellulare. Questo permette di discriminare le cellule singole, che presentano un'area standard e un rapporto larghezza/altezza prossimo a uno, dagli eventi multicellulari, che hanno un'area ampia e un rapporto larghezza/altezza ridotto, e dai detriti, che mostrano un'area estremamente piccola.Dopo aver utilizzato le immagini delle cellule per verificare che le singole cellule siano state correttamente selezionate, impostare un grafico a dispersione biparametrico per le cellule marcate con nanotubi di carbonio ad alto contrasto, riportando il contrasto rispetto al gradiente quadratico medio, in modo da escludere le cellule sfocate con basso gradiente quadratico medio e basso contrasto, e selezionare le cellule nel piano a fuoco. Successivamente, utilizzare lo strumento "trova la caratteristica migliore" per determinare il parametro che fornisce la migliore separazione statistica tra le cellule marcate e quelle non marcate. Ad esempio, in questo esperimento rappresentativo, la caratteristica media del pixel dell'oggetto è quella più adatta.Quindi tracciare questo parametro in funzione della frequenza normalizzata per ottenere un istogramma finalizzato alla quantificazione dei nanotubi assorbiti dalle cellule a ciascuna concentrazione sperimentale. Creare ora un grafico biparametrico del valore medio del pixel dell'oggetto in campo chiaro rispetto all'intensità in campo scuro. Per verificare la correlazione tra questi due parametri, la quantificazione dei nanotubi viene valutata anche creando sulle immagini cellulari delle maschere, poiché i nanotubi di carbonio appaiono come intensi punti scuri. Nel canale in campo chiaro, selezionare un intervallo ristretto di pixel con bassa intensità, ad esempio compreso tra 0 e 533, per creare una maschera di soglia che si adatti con precisione ai nanotubi scuri, ottenendo così una seconda maschera denominata maschera due, utile per visualizzare i nanotubi che appaiono luminosi nel canale in campo scuro.Selezionare un intervallo di pixel con alta intensità. Ad esempio, per questo esperimento è stato scelto un intervallo da 150 a 4.095. Successivamente, utilizzando l'area ottenuta dalla maschera del campo chiaro uno o dalla maschera del campo scuro due, impostare un diagramma a punti per quantificare l'internalizzazione relativa dei nanotubi.Ad esempio, tracciare l'area sul canale sei corrispondente al campo scuro con la maschera due rispetto all'area sul canale uno, corrispondente al campo luminoso con la maschera uno. Dopo aver determinato la correlazione lineare tra la maschera uno e la maschera due, visualizzare i nanotubi all'interno del citoplasma creando innanzitutto una maschera dell'intera cellula e quindi erodendo la maschera. Denominata ora erodere M 0 1 7 di sette pixel per visualizzare l'interno della cellula.Per visualizzare i nanotubi di carbonio all'interno della membrana cellulare, utilizzare l'equazione booleana M zero uno e non erodere M 0 1 7. Questa è la maschera dell'intera cellula, sottratta all'interno della cellula per creare una maschera della sola membrana, al fine di valutare i pixel scuri sulla membrana. Applicare la maschera del campo chiaro uno alla maschera della membrana.Applicare tutte queste maschere a più cellule contemporaneamente per confermare una distinzione tra i campioni marcati e non marcati. Quindi, selezionare i pixel neri sulla membrana con lo strumento di area della caratteristica per quantificare i nanotubi di carbonio sulla membrana cellulare. Infine, discriminare i nanotubi di carbonio internalizzati da quelli assorbiti sulla membrana.Rappresentare graficamente l'area nera della membrana rispetto all'area nera dell'intera cellula. Una volta creati tutti i grafici per una condizione sperimentale, creare un modello di rapporto statistico. Salvare il modello come file A ST ed elaborare in blocco tutti i file dei dati.Il dispositivo per lo streaming di immagini produce molteplici immagini ad alta risoluzione di ogni cellula nel citometro a flusso, incluse le modalità in campo chiaro, campo scuro e fluorescenza, come dimostrato qui con tre diversi tipi di cellule marcate con nanotubi. Sono mostrate anche le sovrapposizioni di questi canali. La presenza di nanotubi di carbonio induce cambiamenti sia nel contrasto che nel gradiente delle cellule marcate rispetto alle cellule non marcate.Pertanto, la creazione di un diagramma a dispersione biparametrico è fondamentale per selezionare le cellule a fuoco. Le cellule sfocate in giallo possono essere discriminate per il loro basso contrasto e basso gradiente quadratico medio, indipendentemente dalla presenza o assenza di marcatura con nanotubi. Le cellule a fuoco non marcate mostrano anch'esse un basso contrasto, ma presentano un alto gradiente quadratico medio quando le cellule a fuoco sono marcate con nanotubi; tuttavia, le cellule mostrano un profilo ad alto contrasto e basso gradiente quadratico medio.I nanotubi di carbonio internalizzati sono facilmente distinguibili, in particolare nel canale in campo chiaro, dove appaiono come punti scuri intensi, le cui aree aumentano con la concentrazione dei nanotubi. Analizzando i segnali medi dei pixel delle immagini in campo chiaro, è possibile determinare una quantificazione relativa dell'assorbimento dei nanotubi. Ad esempio, questi istogrammi mostrano l'aumento significativo dell'assorbimento dei nanotubi che si verifica con ogni incremento della concentrazione di marcatura dei nanotubi; come dimostrato, la quantificazione dei nanotubi di carbonio è inoltre possibile mediante l'uso di maschere applicate o su un intervallo ristretto di pixel scuri all'interno di un'immagine in campo chiaro, o sui pixel ad alta intensità nel campo scuro, corrispondenti alle aree in cui sono presenti i nanotubi.La rappresentazione grafica dell'area di queste maschere consente ulteriori quantificazioni dell'assorbimento dei nanotubi di carbonio. Inoltre, la correlazione tra i punti nelle immagini in campo chiaro e in campo scuro può essere valutata riportando l'intensità in campo scuro rispetto al segnale medio dei pixel in campo chiaro, oppure confrontando l'area della maschera nel campo chiaro con quella nel campo scuro. Nelle prossime due figure sono mostrate analisi dei nanotubi di carbonio localizzati all'interno della cellula.Queste prime immagini mostrano le diverse maschere che sono state create. Si noti che la robustezza delle maschere di localizzazione, basate sull'erosione della maschera cellulare predefinita, deve essere verificata visivamente sull'insieme delle cellule marcate e non marcate. Come appena dimostrato in questi diagrammi a punti, è stata tracciata l'area totale delle macchie nere sulla membrana cellulare rispetto a quella dell'intera cellula per determinare il punteggio di internalizzazione.Per le cellule incubate per 20 ore a 37 gradi Celsius rispetto alle cellule incubate per due ore a quattro gradi Celsius, i nanotubi di carbonio si trovano prevalentemente localizzati sulla membrana, mentre a 37 gradi Celsius i nanotubi di carbonio sono internalizzati in oltre il 90% delle cellule. La fluorescenza dei nanotubi di carbonio non è un buon indicatore dell'internalizzazione dei nanotubi di carbonio a causa di una correlazione troppo bassa tra le macchie fluorescenti e le macchie nei canali in campo chiaro e in campo scuro. Infatti, la correlazione tra l'intensità fitzy e il valore medio dei pixel in campo chiaro indica un coefficiente di correlazione di Pearson di -0,2.Come dimostrato in queste immagini, il segnale fluorescente non corrisponde in modo affidabile ai punti neri in campo chiaro, ai nanotubi di carbonio, al confinamento e all'aggregazione all'interno dei lisosomi intracellulari, che attenuano parzialmente il segnale fluorescente. Al contrario, i nanotubi dispersi possono fornire un segnale fluorescente più affidabile dopo il loro sviluppo. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della nanotecnologia e della nanomedicina per esplorare l'interazione tra cellule viventi e nanomateriali a base di carbonio, o qualsiasi nanomateriale con elevate capacità di assorbimento e di scattering della luce, mediante un metodo statistico di citometria ad alta capacità.

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