Localizzazione e quantificazione relativa dei nanotubi di carbonio in cellule con immagini multispettrali Citometria a Flusso

L'obiettivo generale del seguente esperimento è fornire un metodo nanometrologico per monitorare e quantificare l'assorbimento cellulare di nanotubi di carbonio in un numero statisticamente rilevante di cellule. Questo risultato si ottiene trattando innanzitutto le cellule con nanotubi di carbonio disperdibili in acqua, che entrano nelle cellule in modo dipendente dalla concentrazione. Successivamente, questi nanotubi di carbonio vengono marcati con un marcatore fluorescente.

Successivamente alla fissazione, ogni cellula viene acquisita in campo chiaro, campo scuro e canali fluorescenti di un citometro a flusso con imaging multispettrale. Per visualizzare la distribuzione dei nanotubi di carbonio e il livello di assorbimento della luce, della luce diffusa e della fluorescenza indotta dall'etichettatura dei nanotubi in ogni cellula su base pixel per pixel. In definitiva, l'assorbanza intrinseca della luce e la diffusione all'interno delle cellule permettono la localizzazione e la quantificazione dei nanotubi di carbonio.

Pertanto, questo metodo può contribuire a rispondere a nuove domande nei campi della nano tossicologia e della nanomedicina, come l'impatto e il destino dei materiali a base di carbonio nelle cellule vive, e anche il potenziale dei nanotubi di carbonio come sistema di somministrazione di farmaci. Iniziare disperdendo i nanotubi di carbonio, eventualmente coniugati a un marcatore fluorescente, in acqua per colture cellulari. Successivamente, sottoporre i nanotubi a sonificazione in un bagno ad ultrasuoni a 20 gradi Celsius per 20 minuti. Poi, diluire i nanotubi a concentrazioni di 0, 10, 20 e 50 microgrammi per millilitro in mezzo completo, e incubare due millilitri di ciascuna diluizione con le cellule di interesse in una piastra da 1,25 centimetri quadrati per ogni diluizione a 37 gradi Celsius. Dopo 20 ore, rimuovere il mezzo di incubazione da ogni piastra e risciacquare le cellule marcate con i nanotubi di carbonio con PBS.

Dopo il lavaggio, la tripsina osserva le cellule su ogni piastra e quindi le risospende in mezzo DMEM completo. Successivamente, trasferire ogni campione in provette falcon individuali da 15 millilitri e centrifugare le cellule per cinque minuti a 200 ×g e a temperatura ambiente. Risospendere ogni pellet in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius per un'ora.

Dopo la fissazione, centrifugare nuovamente le cellule e risospendere ogni campione pellettato a 15 volte 10 alla quinta cellule in 150 microlitri di PBS. Quindi filtrare i campioni attraverso filtri individuali da 50 micron per acquisire immagini delle cellule con un image stream. Citometro a flusso con imaging multispettrale.

Per prima cosa, selezionare un'ingrandimento adatto e quindi acquisire le immagini dei campioni di interesse. Utilizzare un laser a 685 nanometri per acquisire il campo scuro e impostare il citometro a flusso. Impostare il canale numero sei per raccogliere l'emissione in campo scuro con un filtro passa-banda da 745 a 800 nanometri.

Acquisire le immagini dei campioni nei canali campo chiaro numero uno e campo scuro numero sei per l'analisi delle immagini. Inizialmente, creare un grafico a dispersione parametrico con rapporto larghezza/altezza rispetto all'area cellulare. Questo permette di discriminare le cellule singole, che presentano un'area standard e un rapporto larghezza/altezza prossimo a uno, dagli eventi multicellulari, che hanno un'area ampia e un rapporto larghezza/altezza ridotto, e dai detriti, che mostrano un'area estremamente piccola.

Dopo aver utilizzato le immagini delle cellule per verificare che le singole cellule siano state correttamente selezionate, impostare un grafico a dispersione biparametrico per le cellule marcate con nanotubi di carbonio ad alto contrasto, riportando il contrasto rispetto al gradiente quadratico medio, in modo da escludere le cellule sfocate con basso gradiente quadratico medio e basso contrasto, e selezionare le cellule nel piano a fuoco. Successivamente, utilizzare lo strumento "trova la caratteristica migliore" per determinare il parametro che fornisce la migliore separazione statistica tra le cellule marcate e quelle non marcate. Ad esempio, in questo esperimento rappresentativo, la caratteristica media del pixel dell'oggetto è quella più adatta.

Quindi tracciare questo parametro in funzione della frequenza normalizzata per ottenere un istogramma finalizzato alla quantificazione dei nanotubi assorbiti dalle cellule a ciascuna concentrazione sperimentale. Creare ora un grafico biparametrico del valore medio del pixel dell'oggetto in campo chiaro rispetto all'intensità in campo scuro. Per verificare la correlazione tra questi due parametri, la quantificazione dei nanotubi viene valutata anche creando sulle immagini cellulari delle maschere, poiché i nanotubi di carbonio appaiono come intensi punti scuri. Nel canale in campo chiaro, selezionare un intervallo ristretto di pixel con bassa intensità, ad esempio compreso tra 0 e 533, per creare una maschera di soglia che si adatti con precisione ai nanotubi scuri, ottenendo così una seconda maschera denominata maschera due, utile per visualizzare i nanotubi che appaiono luminosi nel canale in campo scuro.

Selezionare un intervallo di pixel con alta intensità. Ad esempio, per questo esperimento è stato scelto un intervallo da 150 a 4.095. Successivamente, utilizzando l'area ottenuta dalla maschera del campo chiaro uno o dalla maschera del campo scuro due, impostare un diagramma a punti per quantificare l'internalizzazione relativa dei nanotubi.

Ad esempio, tracciare l'area sul canale sei corrispondente al campo scuro con la maschera due rispetto all'area sul canale uno, corrispondente al campo luminoso con la maschera uno. Dopo aver determinato la correlazione lineare tra la maschera uno e la maschera due, visualizzare i nanotubi all'interno del citoplasma creando innanzitutto una maschera dell'intera cellula e quindi erodendo la maschera. Denominata ora erodere M 0 1 7 di sette pixel per visualizzare l'interno della cellula.

Per visualizzare i nanotubi di carbonio all'interno della membrana cellulare, utilizzare l'equazione booleana M zero uno e non erodere M 0 1 7. Questa è la maschera dell'intera cellula, sottratta all'interno della cellula per creare una maschera della sola membrana, al fine di valutare i pixel scuri sulla membrana. Applicare la maschera del campo chiaro uno alla maschera della membrana.

Applicare tutte queste maschere a più cellule contemporaneamente per confermare una distinzione tra i campioni marcati e non marcati. Quindi, selezionare i pixel neri sulla membrana con lo strumento di area della caratteristica per quantificare i nanotubi di carbonio sulla membrana cellulare. Infine, discriminare i nanotubi di carbonio internalizzati da quelli assorbiti sulla membrana.

Rappresentare graficamente l'area nera della membrana rispetto all'area nera dell'intera cellula. Una volta creati tutti i grafici per una condizione sperimentale, creare un modello di rapporto statistico. Salvare il modello come file A ST ed elaborare in blocco tutti i file dei dati.

Il dispositivo per lo streaming di immagini produce molteplici immagini ad alta risoluzione di ogni cellula nel citometro a flusso, incluse le modalità in campo chiaro, campo scuro e fluorescenza, come dimostrato qui con tre diversi tipi di cellule marcate con nanotubi. Sono mostrate anche le sovrapposizioni di questi canali. La presenza di nanotubi di carbonio induce cambiamenti sia nel contrasto che nel gradiente delle cellule marcate rispetto alle cellule non marcate.

Pertanto, la creazione di un diagramma a dispersione biparametrico è fondamentale per selezionare le cellule a fuoco. Le cellule sfocate in giallo possono essere discriminate per il loro basso contrasto e basso gradiente quadratico medio, indipendentemente dalla presenza o assenza di marcatura con nanotubi. Le cellule a fuoco non marcate mostrano anch'esse un basso contrasto, ma presentano un alto gradiente quadratico medio quando le cellule a fuoco sono marcate con nanotubi; tuttavia, le cellule mostrano un profilo ad alto contrasto e basso gradiente quadratico medio.

I nanotubi di carbonio internalizzati sono facilmente distinguibili, in particolare nel canale in campo chiaro, dove appaiono come punti scuri intensi, le cui aree aumentano con la concentrazione dei nanotubi. Analizzando i segnali medi dei pixel delle immagini in campo chiaro, è possibile determinare una quantificazione relativa dell'assorbimento dei nanotubi. Ad esempio, questi istogrammi mostrano l'aumento significativo dell'assorbimento dei nanotubi che si verifica con ogni incremento della concentrazione di marcatura dei nanotubi; come dimostrato, la quantificazione dei nanotubi di carbonio è inoltre possibile mediante l'uso di maschere applicate o su un intervallo ristretto di pixel scuri all'interno di un'immagine in campo chiaro, o sui pixel ad alta intensità nel campo scuro, corrispondenti alle aree in cui sono presenti i nanotubi.

La rappresentazione grafica dell'area di queste maschere consente ulteriori quantificazioni dell'assorbimento dei nanotubi di carbonio. Inoltre, la correlazione tra i punti nelle immagini in campo chiaro e in campo scuro può essere valutata riportando l'intensità in campo scuro rispetto al segnale medio dei pixel in campo chiaro, oppure confrontando l'area della maschera nel campo chiaro con quella nel campo scuro. Nelle prossime due figure sono mostrate analisi dei nanotubi di carbonio localizzati all'interno della cellula.

Queste prime immagini mostrano le diverse maschere che sono state create. Si noti che la robustezza delle maschere di localizzazione, basate sull'erosione della maschera cellulare predefinita, deve essere verificata visivamente sull'insieme delle cellule marcate e non marcate. Come appena dimostrato in questi diagrammi a punti, è stata tracciata l'area totale delle macchie nere sulla membrana cellulare rispetto a quella dell'intera cellula per determinare il punteggio di internalizzazione.

Per le cellule incubate per 20 ore a 37 gradi Celsius rispetto alle cellule incubate per due ore a quattro gradi Celsius, i nanotubi di carbonio si trovano prevalentemente localizzati sulla membrana, mentre a 37 gradi Celsius i nanotubi di carbonio sono internalizzati in oltre il 90% delle cellule. La fluorescenza dei nanotubi di carbonio non è un buon indicatore dell'internalizzazione dei nanotubi di carbonio a causa di una correlazione troppo bassa tra le macchie fluorescenti e le macchie nei canali in campo chiaro e in campo scuro. Infatti, la correlazione tra l'intensità fitzy e il valore medio dei pixel in campo chiaro indica un coefficiente di correlazione di Pearson di -0,2.

Come dimostrato in queste immagini, il segnale fluorescente non corrisponde in modo affidabile ai punti neri in campo chiaro, ai nanotubi di carbonio, al confinamento e all'aggregazione all'interno dei lisosomi intracellulari, che attenuano parzialmente il segnale fluorescente. Al contrario, i nanotubi dispersi possono fornire un segnale fluorescente più affidabile dopo il loro sviluppo. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della nanotecnologia e della nanomedicina per esplorare l'interazione tra cellule viventi e nanomateriali a base di carbonio, o qualsiasi nanomateriale con elevate capacità di assorbimento e di scattering della luce, mediante un metodo statistico di citometria ad alta capacità.