Localizzazione e quantificazione relativa dei nanotubi di carbonio in cellule con immagini multispettrali Citometria a Flusso

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di fornire un metodo nanometrologico per il monitoraggio e la quantificazione dell'assorbimento cellulare di nanotubi di carbonio in un numero statisticamente rilevante di cellule. Ciò si ottiene trattando prima le cellule con nanotubi di carbonio disperdibili in acqua, che entrano nelle cellule in modo dipendente dalla concentrazione. Questi nanotubi di carbonio vengono infine etichettati con un marcatore fluorescente.

Quindi, dopo la fissazione, ogni cellula viene ripresa nei canali del campo chiaro, del campo scuro e della fluorescenza di un flusso di imaging multispettrale. Citometro. Per visualizzare la distribuzione dei nanotubi di carbonio e il livello di assorbimento della luce, la luce diffusa e la fluorescenza, l'etichettatura dei nanotubi induce in ogni cella pixel per pixel. In definitiva, l'intrinseca assorbanza e diffusione della luce all'interno delle celle consente la localizzazione e la quantificazione dei nanotubi di carbonio.

Quindi questo metodo può aiutare a rispondere a nuove domande nei campi della nano tossicologia e della nanomedicina, come l'impatto e il destino dei materiali a base di carbonio nelle cellule viventi, e anche il potenziale dei nanotubi di carbonio come sistema di somministrazione di farmaci. Inizia disperdendo i nanotubi di carbonio eventualmente accoppiati a un'etichetta fluorescente nell'acqua di coltura cellulare. Quindi sonicare i nanotubi in un bagno d'acqua sonicare a 20 gradi Celsius per 20 minuti. Successivamente, diluire i nanotubi a concentrazioni di 0, 10, 20 e 50 microgrammi per millilitro in terreno completo, quindi incubare due millilitri di ciascuna diluizione con le cellule di interesse in 1 piastra da 25 centimetri quadrati per diluizione a 37 gradi Celsius dopo 20 ore, rimuovere il mezzo di incubazione da ciascuna piastra e sciacquare le cellule etichettate con nanotubo di carbonio con PBS.

Dopo il lavaggio, la tripsina osserva le cellule su ogni piastra e poi le risospende in mezzo DMEM completo. Quindi, trasferire ogni campione in singole provette di falco da 15 millilitri, quindi far girare le cellule per cinque minuti a 200 volte G e temperatura ambiente. Risospendere ogni pellet in 4% di para formaldeide a quattro gradi Celsius per un'ora.

Dopo il fissaggio, ruotare nuovamente le cellule verso il basso e risospendere ogni campione pellettato a 15 volte 10 fino alla quinta cellula in 150 microlitri di PBS. Quindi filtrare i campioni attraverso singoli filtri a maglie da 50 micron per acquisire immagini delle cellule con un flusso di immagini. Citometro a flusso con imaging multispettrale.

Innanzitutto, selezionare un ingrandimento adattato e quindi i campioni di immagine di interesse. Utilizzare un laser a 685 nanometri per visualizzare il campo scuro e impostare il citometro a flusso. Numero sei canali per raccogliere l'emissione del campo oscuro a un passaggio di banda da 745 a 800 nanometri.

Visualizzare i campioni nei canali numero uno in campo chiaro e numero sei in campo scuro per l'analisi delle immagini. Innanzitutto, crea un grafico a punti parametrico con un rapporto di aspetto larghezza per altezza rispetto all'area della cella. Ciò consente la discriminazione delle singole cellule che hanno un'area standard e un rapporto d'aspetto vicino a uno dagli eventi multicellulari, che hanno un'area grande e un rapporto d'aspetto piccolo, e i detriti che mostrano un'area estremamente piccola.

Dopo aver utilizzato le immagini delle celle per verificare che le singole celle siano state selezionate correttamente, impostare un diagramma a punti biparametrico per celle etichettate con nanotubi di carbonio altamente contrastate tracciando il contrasto rispetto al gradiente quadratico medio della radice per consentire l'esclusione della radice bassa, del gradiente quadratico medio, delle celle non focalizzate a basso contrasto e della selezione delle celle nel piano focalizzato. Quindi, utilizzare lo strumento di ricerca della funzione migliore per determinare il parametro che fornisce la migliore separazione statistica tra le celle etichettate e non etichettate. Ad esempio, per questo esperimento rappresentativo, la funzione dell'oggetto pixel medio è la più adatta.

Quindi tracciare questo parametro rispetto alla frequenza normalizzata per tracciare un istogramma per la quantificazione dei nanotubi assorbiti dalle cellule ad ogni concentrazione sperimentale. Ora tracciate un grafico biparametrico per l'oggetto pixel medio in campo chiaro rispetto all'intensità in campo scuro. Per verificare la correlazione tra questi due parametri, la quantificazione dei nanotubi viene valutata anche mediante la creazione di immagini sulla cella poiché i nanotubi di carbonio appaiono come macchie scure intense Nel canale Brightfield, selezionare un intervallo ristretto di pixel con una bassa intensità, ad esempio, compresa tra zero e 533 per creare la maschera di soglia, Uno che si adatta ai nanotubi scuri proprio per creare una seconda maschera indicata con la maschera due per visualizzare i nanotubi che appaiono luminosi nel canale del campo scuro.

Selezionate un intervallo di pixel ad alta intensità. Ad esempio, per questo esperimento è stato scelto un intervallo da 150 a 4.095. Quindi, utilizzando l'area della maschera di campo chiaro uno o della maschera di campo scuro due, impostare un grafico a punti per quantificare l'internalizzazione relativa dei nanotubi.

Ad esempio, tracciare l'area sul canale sei corrispondente al campo scuro con maschera due rispetto all'area sul canale uno, corrispondente al campo chiaro con maschera uno. Dopo aver determinato la correlazione lineare tra la prima e la seconda maschera, visualizzare i nanotubi all'interno del citoplasma creando prima una maschera dell'intera cellula e poi erodendo la maschera. Ora indicato erodere M 0 1 7 per sette pixel per visualizzare l'interno della cellula.

Per visualizzare i nanotubi di carbonio all'interno della membrana cellulare, utilizzare l'equazione booleana M zero uno e non erodere M 0 1 7. Cioè la maschera dell'intera cellula, sottratta dall'interno della cellula per creare una maschera della membrana solo per valutare i pixel scuri sulla membrana. Applicare la maschera per campo chiaro sulla maschera a membrana.

Applicare tutte queste maschere a più celle contemporaneamente per confermare una distinzione tra i campioni etichettati e non etichettati. Quindi seleziona i pixel neri sulla membrana con lo strumento dell'area delle caratteristiche per quantificare i nanotubi di carbonio sulla membrana cellulare. Infine, discriminare i nanotubi di carbonio che sono stati internalizzati da quelli che sono stati assorbiti sulla membrana.

Traccia, l'area nera della membrana contro l'area nera dell'intera cellula. Una volta creati tutti i grafici per una condizione sperimentale, crea un modello di report statistico. Salvare il modello come file A ST e raggruppare tutti i file di dati.

Il dispositivo a flusso di immagini produce più immagini ad alta risoluzione di ciascuna cellula nel citometro a flusso, inclusi i canali in campo chiaro, campo scuro e fluorescenza, come dimostrato qui con tre diverse celle marcate con nanotubi. Vengono mostrate anche le sovrapposizioni di questi canali. La presenza di nanotubi di carbonio induce cambiamenti sia nel contrasto che nel gradiente delle cellule marcate rispetto alle cellule non marcate.

Pertanto, la creazione di un grafico a punti biparametrico è importante per la selezione delle celle di messa a fuoco. Le cellule non focalizzate in giallo possono essere discriminate dal loro basso contrasto e dal basso gradiente quadratico medio della radice, indipendentemente dalla presenza o dall'assenza di marcatura con nanotubi. Anche le cellule di messa a fuoco non marcate mostrano un basso contrasto, ma dimostrano un alto gradiente quadratico medio di radice quando le celle di messa a fuoco sono marcate con nanotubi, tuttavia, le cellule dimostrano un alto contrasto, bassa radice, profilo di gradiente quadratico medio.

I nanotubi di carbonio internalizzati sono facilmente distinguibili, in particolare nel canale Brightfield, dove appaiono come macchie scure intense, le cui aree aumentano con la concentrazione di nanotubi. Quando vengono analizzati i segnali medi dei pixel delle immagini in campo chiaro, è possibile determinare una quantificazione relativa dell'assorbimento del nanotubo. Ad esempio, questi istogrammi dimostrano l'aumento significativo dell'assorbimento dei nanotubi che si verifica con ogni aumento della concentrazione di marcatura dei nanotubi, poiché la quantificazione dei nanotubi di carbonio è possibile anche attraverso l'uso di maschere applicate su una gamma ristretta di pixel scuri all'interno di un'immagine in campo chiaro o all'interno dei pixel ad alta intensità all'interno del campo scuro. corrispondenti alle aree in cui sono presenti i nanotubi.

Il tracciato dell'area di queste maschere consente quindi un'ulteriore quantificazione dell'assorbimento del nanotubo di carbonio. Inoltre, la correlazione tra le macchie nelle immagini in campo chiaro e scuro può essere valutata tracciando l'intensità del campo scuro rispetto al segnale medio dei pixel del campo chiaro, o tracciando l'area della maschera all'interno del campo chiaro rispetto all'area all'interno del campo scuro. In queste due figure successive, vengono mostrate le analisi dei nanotubi di carbonio localizzati all'interno della cellula.

Queste prime immagini mostrano le diverse maschere che sono state create. Si noti che la robustezza delle maschere di localizzazione basate sull'erosione della maschera di cella predefinita deve essere verificata visivamente sulla raccolta delle celle etichettate e non etichettate. Come appena dimostrato in questi grafici a punti, l'area totale delle macchie nere sulla membrana cellulare rispetto a quella dell'intera cellula è stata tracciata per determinare il punteggio di internalizzazione.

Per le cellule che sono state incubate per 20 ore a 37 gradi Celsius rispetto alle cellule che sono state incubate per due ore a quattro gradi Celsius a quattro gradi Celsius, i nanotubi di carbonio si trovano principalmente sulla membrana, mentre a 37 gradi Celsius, i nanotubi di carbonio sono internalizzati in oltre il 90% delle cellule. La fluorescenza del nanotubo di carbonio non è un buon indicatore dell'internalizzazione del nanotubo di carbonio a causa di una correlazione troppo bassa tra le macchie fluorescenti e le macchie all'interno dei canali di campo chiaro e scuro. Infatti, la correlazione tra l'intensità fitzy e il pixel medio del campo luminoso indica un coefficiente di correlazione di Pearson di meno 0,2.

Come dimostrato in queste immagini, il segnale fluorescente non corrisponde in modo affidabile con le macchie nere del campo luminoso, i nanotubi di carbonio, il confinamento e l'aggregazione all'interno dei lisosomi intracellulari hanno parzialmente spento il segnale fluorescente. Al contrario, i nanotubi dispersi possono fornire un segnale fluorescente più affidabile dopo il suo sviluppo. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della nanotecnologia e della nanomedicina per esplorare l'interazione delle cellule viventi con nanomateriali a base di carbonio o qualsiasi nanomateriale con un'elevata capacità di assorbimento e dispersione della vita utilizzando un metodo statistico di citometria ad alto rendimento.