Cella della morte associata a mitosi anomalo osservato da Imaging confocale in cellule vive di cancro
21 agosto 2013
L'attività citotossica della fenantridina PJ-34 in cellule tumorali in mitosi è stata documentata in tempo reale dai confocale vivo. PJ-34 sradicato cancro al seno umano MDA-MB-231 cellule che ospitano in più-centrosomi nella mitosi. A differenza della normale mitosi bi-focale, l'extra-centrosomi non sono stati raggruppati in due poli del fuso in presenza di PJ-34.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare l'effetto citotossico del derivato philanthr PJ 34 durante la mitosi in cellule tumorali umane multicentrosomiali. Questo viene ottenuto etichettando i centrosomi con GFP tubulina gamma e i cromosomi con H two B rosso mediante trasfezione. L'obiettivo della trasfezione è consentire il tracciamento della migrazione e del raggruppamento dei centrosomi e dell'assetto dei cromosomi durante la mitosi in cellule tumorali umane multicentrosomiali vive.
Come secondo passaggio, alcune delle cellule trasfettate vengono trattate con PJ 34, una molecola che agisce come agente aggiuntivo per l'eliminazione degli extra-centrosomi. Successivamente, le cellule tumorali vive trasfettate vengono analizzate mediante microscopia confocale al fine di catturare gli eventi associati alla migrazione di centrosomi e cromosomi durante la mitosi. Le immagini sequenziali rielaborate o raggruppate mostrano gli effetti di eliminazione degli extra-centrosomi e quelli citotossici del trattamento con PJ 34 nelle cellule tumorali durante la mitosi, basati sull'imaging confocale di cellule vive.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono a una terapia oncologica mirata, in grado di eliminare esclusivamente le cellule tumorali autosomiche durante la mitosi. La dimostrazione di questa tecnica sarà effettuata dal nostro collaboratore, il Dott. Asher Castillo del Centro di Ricerca sul Cancro del Centro Medico Sheba, e dal Dott. Leonid Middleman dell'unità di imaging della Sacko School of Medicine dell'Università di Telaviv. Per preparare le cellule tumorali del seno M-D-A-M-B 231 per l'immagine confocale in tempo reale, seminare due volte 10 alla quinta cellule in piatti colturali da 35 millimetri di diametro con fondo in vetro rivestito di poli-lisina, in due millilitri di mezzo completo; incubare in un'atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius.
La coltura cellulare è pronta per la trasfezione quando raggiunge una confluenza del 60-70%. Le cellule verranno trasfettate con due plasmidi, uno codificante la tubulina gamma, GFP per il rilevamento fluorescente dei centrosomi e l'altro codificante l'istone rosso per il rilevamento fluorescente dei cromosomi; la trasfezione viene eseguita utilizzando il reagente di trasfezione liposomiale jet PI seguendo il protocollo del produttore. Lavare le cellule una volta con PBS, quindi sostituire il mezzo cellulare con due millilitri di DMEM caldo privo di additivi. Aggiungere delicatamente la miscela di trasfezione alle cellule in DMEM, quindi reinserire le cellule nell'incubatore per otto ore; trascorse otto ore.
Sostituire il DMEM con due millilitri di mezzo completo e incubare le cellule nell'incubatrice per 24 ore. Dopo la trasfezione, sostituire il mezzo con due millilitri di mezzo completo contenente 20 micromolar di PGA 34.
Incubare le cellule per ulteriori 18 ore prima dell'acquisizione confocale in tempo reale. Di seguito sono riportati i parametri tecnici delle impostazioni dello scanner per l'acquisizione confocale in tempo reale: modalità di scansione XYZT, pinhole airy 1,00, zoom 3,5, risoluzione otto bit, laser DPSS 561 nanometri, laser visibile a argon 488 nanometri, laser visibile a elio-neon 633 nanometri.
Obiettivo H-C-X-P-L-A-P-O-C-S 63 volte 1,40 Oil UV apertura numerica 1,4. Velocità di scansione, 700 hertz e indice di rifrazione 1,52. Sottoporre le cellule a imaging confocale in tempo reale per almeno 16 ore in una camera per imaging, mantenendo le cellule al 5% di anidride carbonica e a 37 gradi Celsius.
L'efficacia della trasfezione verrà valutata mediante microscopia a fluorescenza. Iniziare questa procedura seminando due volte 10 alla quinta cellule MDA MB 231 in una piastra a sei pozzetti contenente un'ansa per pozzetto in due millilitri di mezzo completo. Trasfettare le cellule nello stesso modo di prima utilizzando il reagente di trasfezione liposomiale jet PI seguendo il protocollo del produttore.
36 ore dopo la trasfezione. Rimuovere il mezzo da ogni pozzetto dopo aver lavato le cellule trasfettate montate su un cover slip con PBS. Fissare le cellule mediante incubazione in una soluzione fredda di metanolo e acetone in rapporto uno a uno per sette minuti a meno 20 gradi Celsius.
Dopo sette minuti, aspirare la soluzione di fissazione e lasciare asciugare il coprioggetto con le cellule fissate in una cappa chimica per 30 minuti. Successivamente, applicare il reagente antiossidante prolungato con DPI e lasciare asciugare il coprioggetto al buio per sei ore. Esaminare il vetrino al microscopio a fluorescenza e calcolare la percentuale di cellule trasfettate con segnali rossi e verdi.
Dalla popolazione totale di cellule, la percentuale desiderata di trasfezione è circa dal 20 al 40% quando vengono contate da 100 a 200 cellule. Per iniziare questa procedura, seminare due volte 10 alla quinta cellule di carcinoma mammario M-D-A-M-B 231 su coprislide di vetro in una piastra a sei pozzetti con due millilitri di mezzo completo. Aggiungere il PJ 34 al mezzo e incubare le cellule per il periodo richiesto.
Al termine del periodo di incubazione, lavare le lamelle una volta con PBS e fissare le cellule mediante incubazione in una soluzione di metanolo e acetone ghiacciati in rapporto uno a uno per sette minuti a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, aspirare la soluzione di fissazione e lasciare asciugare le lamelle in una cappa chimica per 30 minuti. Lavare le lamelle una volta con PBST per permeabilizzare le membrane cellulari, quindi bloccare le cellule con siero di donkey normale al 10% in PBST per un'ora a temperatura ambiente.
Preparare la prima miscela di anticorpi aggiungendo gli anticorpi primari antitubulina e anti-gamma tubulina alla soluzione di blocco e vortexando. Quindi applicare 100 microlitri di miscela di anticorpi per ogni coprislitta su un piatto a sei pozzetti. Capovolgere delicatamente il coprislitta e posizionarlo delicatamente sulla goccia di anticorpo, incubando per due ore.
Aggiungere a temperatura ambiente. Questo colorerà i fusi e i centrosomi. Rimettere i coverslip nelle pozzette e lavare le cellule tre volte con PBST.
Quindi aggiungere gli anticorpi secondari, LOR 488 e LOR 568, aggiungendo una goccia per ogni coprislitta in una piastra a sei pozzetti. Successivamente, posizionare i coprislitta con la faccia verso il basso sulle gocce di anticorpi e incubare per un'ora a temperatura ambiente al buio. Al termine dell'incubazione con gli anticorpi secondari, riposizionare i coprislitta nei pozzetti e lavare le cellule tre volte con PBST.
Infine, montare i coprioggetti utilizzando il reagente antiossidante prolungato gold con incubazione in dappy, lasciando incubare tutta la notte a temperatura ambiente al buio prima di procedere all'analisi delle cellule fissate mediante microscopia confocale. PJ 34 è un composto di fenantridina stabile e solubile in acqua che in precedenti osservazioni si è dimostrato in grado di eradicare esclusivamente le cellule tumorali con multi-centrosomi, senza alterare le cellule normali che subiscono mitosi con due centrosomi e fusi bifocali. In questo studio, l'attività citotossica di PJ 34 è stata esaminata impiegando cellule vive di carcinoma mammario umano M-D-A-M-B 231, che presentano un'elevata frequenza di centrosomi extra.
Le cellule sono state trasfettate con GFP della tubulina gamma per etichettare i fuochi della tubulina gamma e con istone H due B rosso per etichettare i cromosomi. L'analisi delle cellule M-D-A-M-B 231 per almeno 16 ore mediante microscopia confocale ha rivelato un raggruppamento bifocale dei centrosomi, che rappresenta un raggruppamento bifocale di centrosomi extra nella maggior parte delle cellule in mitosi, come illustrato nei seguenti video. Questo primo video mostra una cellula vivente selezionata casualmente durante la mitosi, con i centrosomi etichettati in verde dalla tubulina gamma.
Il GFP nel secondo video mostra il riarrangiamento cromosomico durante la mitosi in una cellula M-D-A-M-B 231 scelta casualmente e trasfettata con istone H two B rosso. Questo terzo video mostra una cellula MDA MB 231 in fase di mitosi in cui i fuochi verdi di centrosomi extrafocali raggruppati sono etichettati in verde e i cromosomi in rosso. Al contrario, centrosomi non raggruppati e un'organizzazione cromosomica anomala sono stati rilevati in cellule M-D-A-M-B 231 trasfettate e mantenute in vita in presenza di 20 micromolare di PJ 34, e la mitosi in queste cellule si è conclusa con la morte cellulare, come mostrato in questo filmato.
Questa documentazione in tempo reale della morte cellulare durante la mitosi supporta fortemente una correlazione positiva precedentemente definita tra il numero di cellule tumorali umane con fusi multipolari in mitosi e la percentuale di morte cellulare nelle cellule incubate con PJ 34. Poiché PJ 34 agisce come un potente inibitore della PARP uno, è stata indagata la possibilità che l'inibizione della PARP uno causi la morte cellulare associata al fallimento mitotico. L'attività citotossica di concentrazioni crescenti di PJ 34 è stata testata in fibroblasti embrionali di topo normali e carenti di PARP uno e i risultati sono mostrati qui.
Il grafico a sinistra mostra la percentuale di fusi multifocali calcolata nei fibroblasti embrionali di topo normali, rappresentati dalla linea nera, e nei fibroblasti carenti di PARP1, rappresentati dalla linea grigia, incubati per 48 ore con PJ 34 alle concentrazioni indicate. Queste percentuali sono state calcolate su un totale di 20 fusi rilevati in tre esperimenti diversi. Il grafico a destra mostra la sopravvivenza dei fibroblasti embrionali di topo normali e carenti di PARP1 incubati per 72 ore con 20 micromolari.
La sopravvivenza delle cellule PJ 34 è stata valutata mediante la produzione di ATP cellulare. Sono riportati i valori medi di quattro misurazioni per ciascuna linea cellulare effettuate in tre esperimenti diversi. Questi risultati mostrano che le dosi di PJ 34 provocano in modo dipendente dalla concentrazione alterazioni dei fusi mitotici e morte cellulare nei fibroblasti embrionali di topo carenti di PARP-1, ma non nei fibroblasti normali.
Il fatto che PJ 34 abbia eliminato le cellule deficienti di PARP1 nonostante la loro carenza di PARP1 e la correlazione tra la formazione di fusi multifocali e l'eliminazione cellulare in fibroblasti embrionali di topo deficienti di PARP1 incubati con PJ 34 a concentrazioni superiori a quelle necessarie per l'inibizione di PARP1 non è coerente con un legame causale tra la riorganizzazione dei centrosomi nei fibroblasti embrionali di topo deficienti di PARP1 e l'inibizione di PARP1. Queste immagini confocali mostrano fibroblasti embrionali di topo normali e deficienti di PARP1 in mitosi, fissati, permeabilizzati e marcanti mediante immunomarcazione per tubulina alfa e gamma, che hanno evidenziato rispettivamente i fusi in verde e i centrosomi in rosso. I cromosomi sono stati marcati in blu con il reagente DPI.
Le cellule sono state lasciate non trattate oppure incubate con PJ 34 per 48 ore alle concentrazioni indicate. Sono stati osservati focolai di gamma tubulina non aggregati, fusi distorti e morte cellulare nei fibroblasti embrionali murini carenti di PARP uno trattati con PJ 34, ma non nei fibroblasti embrionali murini normali trattati con PJ 34. Alcune delle colture cellulari esaminate sono state trattate con due potenti inibitori non areni di PARP uno, ABT 888 e AG 01469, che inibiscono l'attività enzimatica di PARP uno.
Nessuno dei due inibitori di PARP1 testati ha compromesso i fibroblasti embrionali murini normali alle concentrazioni in grado di inibire l'attività di PARP1. Questi inibitori di PARP1 non hanno inoltre influenzato il raggruppamento dei centrosomi nei fibroblasti embrionali murini carenti di PARP1. Questi risultati indicano che l'attività citotossica di PJ 34 sulle cellule con multipli centrosomi non è condivisa da altri potenti inibitori di PARP1, una volta acquisita.
Questa tecnica può essere utilizzata in altri tipi di cellule viventi per una varietà di proposte.
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Panoramica
Questo studio analizza gli effetti citotossici del derivato della fenantridina PJ-34 sulle cellule tumorali del seno umano durante la mitosi. Mediante imaging confocale in tempo reale, la ricerca evidenzia come PJ-34 influenzi il raggruppamento dei centrosomi nelle cellule tumorali con centrosomi extra.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia del cancro
- Biologia cellulare
Sfondo
- I centrosomi svolgono un ruolo fondamentale nella divisione cellulare.
- I centrosomi extra possono portare a una mitosi anomala.
- PJ-34 è noto per le sue proprietà citotossiche nelle cellule tumorali.
- Le tecniche di imaging in tempo reale permettono l'osservazione in tempo reale dei processi cellulari.
Scopo dello studio
- Osservare gli effetti di PJ-34 sulle cellule tumorali in mitosi.
- Analizzare il comportamento dei centrosomi durante il trattamento.
- Documentare l'attività citotossica in tempo reale.
Metodi Utilizzati
- Trasfezione di cellule tumorali con GFP gamma tubulina e H2B per l'analisi mediante imaging.
- Esposizione delle cellule trasfettate a PJ-34.
- Microscopia confocale in tempo reale per acquisire gli eventi mitotici.
- Acquisizione sequenziale di immagini per analizzare la dinamica dei centrosomi e dei cromosomi.
Risultati principali
- PJ-34 ha eliminato efficacemente le cellule tumorali MDA-MB-231 durante la mitosi.
- Le centrosomi extra non si sono aggregati ai poli del fuso in presenza di PJ-34.
- L'immagine in tempo reale ha rivelato effetti citotossici significativi.
- È stato osservato un disassemblaggio dei centrosomi durante il trattamento.
Conclusioni
- PJ-34 dimostra un potenziale come agente terapeutico contro le cellule tumorali con numero anomalo di centrosomi.
- L'analisi in tempo reale fornisce informazioni preziose sulle dinamiche della mitosi nelle cellule tumorali.
- Sono necessari ulteriori studi per esplorare i meccanismi alla base degli effetti di PJ-34.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo studio dimostra un approccio mirato per eliminare le cellule tumorali con numero anomalo di centrosomi, interferendo con il raggruppamento dei centrosomi durante la mitosi, offrendo così una strategia basata su meccanismi per ridurre i rischi associati ai bersagli in oncologia. L'uso dell'immagine confocale in tempo reale consente la validazione in tempo reale degli effetti citotossici, sostenendo la fiducia predittiva nella validazione precoce dei bersagli e nei flussi di lavoro di schermatura fenotipica. Ciò colloca il metodo come uno strumento per identificare composti che compromettono selettivamente la fedeltà mitotica in sistemi pertinenti alla malattia, informando così le decisioni di proseguimento o interruzione nella fase di identificazione dei composti promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche che collegano il declusterizzazione del centrosoma al fallimento mitotico e alla morte delle cellule tumorali.
- Valore operativo: Fornisce una piattaforma per l'immagine in tempo reale su cellule vive per validare funzionalmente i bersagli coinvolti nell'integrità del centrosoma e nella formazione del polo mitotico.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico confermando che gli effetti citotossici si verificano specificamente in cellule tumorali con multi-centrosomi, e non in cellule normali diploidi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative e risolte nel tempo dello stato di aggregazione dei centrosomi e delle aberrazioni cromosomiche come endpoint fenotipici.
- Valore operativo: Stabilisce un sistema saggio riproducibile che utilizza la gamma-tubulina e l'istone H2B marcati fluorescentemente per l'immagine in tempo reale ad alto contenuto.
- Valore scientifico: Fornisce informazioni meccanicistiche sulla catastrofe mitotica indotta da composti, permettendo di discriminare tra meccanismi citostatici e citotossici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Utilizza un modello rilevante per la patologia (carcinoma mammario MDA-MB-231) con elevata prevalenza di extra-centrosomi per rispecchiare la biologia tumorale clinica.
- Valore operativo: Permette una continuità dal riscontro del bersaglio alla validazione preclinica documentando in tempo reale l'insuccesso mitotico e la morte cellulare.
- Valore scientifico: Facilita l'allineamento dei biomarcatori correlando la perdita di aggregazione della gamma-tubulina e la scorretta segregazione cromosomica con l'esito citotossico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto guida, in cui l'immagine in tempo reale della dinamica mitotica funge da lettura funzionale degli effetti fenotipici indotti dal composto in sistemi rilevanti per il cancro.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi collegando il trattamento con il composto al declusterizzazione dei centrosomi, alla formazione di fusi multipolari e alla catastrofe mitotica.
- Screening: Garantisce prontezza del saggio grazie a trasfezione standardizzata, imaging in tempo reale e valutazione quantitativa dei fenotipi dei centrosomi e dei cromosomi.
- Analisi: Permette il confronto tra condizioni di trattamento mediante parametri quantitativi come la percentuale di cellule con fuochi di gamma-tubulina declusterizzati e allineamento aberrante dei cromosomi.
- Ricerca traslazionale: Collega i fenotipi mitotici precoci a rilevanza preclinica utilizzando una linea cellulare tumorale con instabilità genomica nota e rilevanza terapeutica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging riutilizzabile, applicabile ad altri composti e modelli tumorali con amplificazione dei centrosomi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva dimostrando esiti fenotipici associati al target in un contesto cellulare vivente.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione attraverso protocolli definiti di trasfezione, parametri di imaging e criteri di valutazione fenotipica.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento/cessazione identificando composti che inducono selettivamente un fallimento mitotico in cellule malate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio delle serie chimiche sulla base della riduzione del rischio meccanicistica della fedeltà mitotica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'immagine confocale di cellule vive, nella trasfezione di proteine fluorescenti e nella biologia cellulare mitotica.
- Dipende dall'accesso a sistemi di microscopia confocale dotati di controllo ambientale per l'acquisizione prolungata di immagini in tempo reale (37°C, 5% CO2).
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda l'efficienza di trasfezione, l'espressione del plasmide e le procedure di analisi delle immagini.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si applica il modello ad altri tipi di cancro o a cellule primarie con diversa efficienza di trasfezione.
- È limitato dalla necessità di un'espressione fluorescente stabile e dalla gestione della fototossicità durante sessioni di acquisizione prolungate.
