Elettroforesi su gel di DNA

L'elettroforesi su gel di DNA è una tecnica utilizzata per separare e identificare i frammenti di DNA in base alle dimensioni.

Frammenti di DNA di varie dimensioni vengono caricati in un gel poroso a base di acarosio – un carboidrato presente nelle alghe rosse.

Quando viene applicato un campo elettrico, i frammenti migreranno attraverso il gel, grazie ai gruppi fosfato caricati negativamente nei nucleotidi del DNA.

Pezzi di DNA più piccoli migreranno più facilmente attraverso il gel rispetto ai frammenti più grandi, che hanno più difficoltà a muoversi attraverso la matrice del gel.

Quando la corsa del gel è completa, la posizione dei campioni di DNA può essere confrontata con una serie di frammenti o bande di dimensioni note, chiamate scala del DNA.

La presenza del tuo frammento di interesse può quindi essere confermata in base alle sue dimensioni, che vengono determinate confrontando la posizione relativa del tuo campione di prova con i frammenti della scala.

I gel di acarosio vengono preparati utilizzando una soluzione percentuale di peso su volume. Quindi 1 grammo di agarose in 100 ml di tampone farà un gel all'1%. I gel a percentuale inferiore risolveranno meglio i frammenti più grandi e i gel con percentuale più elevata renderanno i frammenti più piccoli più facili da identificare. Per iniziare la procedura di produzione del gel, pesare la massa appropriata di agarose in un matraccio Erlenmeyer.

Aggiungere il buffer corrente al pallone, in modo che il volume del buffer non sia superiore a 1/3 della capacità del pallone. Quindi ruotare per mescolare.

Sciogliere la miscela di agarose/tampone riscaldando in un forno a microonde alla massima potenza. Ogni trenta secondi, togliere il pallone e far roteare il contenuto per mescolare bene. Ripetere fino a quando l'agarose non si è completamente dissolto.

Quindi aggiungere bromuro di etidio a una concentrazione di 0,5 mg / ml. Il bromuro di etidio è un composto aromatico che si inserisce tra le singole coppie di basi di DNA, o intercalati, e fa sì che il DNA emetta un'intensa fluorescenza arancione sotto la luce UV. È importante notare che il bromuro di etidio è cancerogeno, quindi i guanti devono sempre essere indossati quando si maneggiano gel contenenti questo composto.

Per evitare che il vassoio in gel si deformi, lasciare raffreddare l'agarose mettendolo a bagnomaria a 65ºC.

Mentre l'agarose si sta raffreddando, preparare lo stampo in gel posizionando il vassoio del gel nell'apparato di fusione. In alternativa, è possibile utilizzare il nastro adesivo per sigillare i bordi aperti del vassoio del gel per creare lo stampo. Posizionare un pettine nel gel crea i pozzezze dove viene caricato il DNA. Assicurati che il pettine crei un pozzo delle dimensioni appropriate per il tuo campione di DNA.

Versare l'agarose fuso nello stampo gel e lasciarlo indurire a temperatura ambiente.

Dopo che l'agarose si è indurito, togliere il pettine. Se il gel non verrà utilizzato immediatamente, avvolgerlo in un involucro di plastica e conservare a 4ºC fino all'uso.

Se il gel verrà utilizzato immediatamente, metterlo nella scatola del gel.

Per iniziare questa procedura, aggiungere colorante a carica di gel ai campioni di DNA da separare. Il colorante di carico è in genere realizzato a una concentrazione di 6X. Il caricamento del colorante aiuta a visualizzare e caricare i campioni nei pozzi e aiuta a determinare fino a che punto i campioni sono migrati durante l'esecuzione.

Impostare l'alimentatore sulla tensione desiderata.

Ora aggiungi abbastanza tampone in esecuzione nella scatola del gel per coprire la superficie del gel. Assicurarsi di utilizzare lo stesso buffer di funzionamento di quello utilizzato per preparare il gel.

Collegare i cavi della scatola di gel all'alimentatore e accenderlo. Ricorda che il DNA è caricato negativamente e si muoverà verso l'anodo, che è positivo e generalmente di colore rosso. Assicurarsi di non collegare il piombo nero, o catodo, al fondo della scatola di gel. Quindi non dimenticare, tieni presente che i gatti neri sono sfortunati, o negativi, e il CAThode nero è quindi negativo. Esegui il tuo gel in rosso o l'anodo. Verificare che sia la scatola di gel che l'alimentatore funzionino; l'aspetto di bolle agli elettrodi indica che la corrente sta passando attraverso.

Rimuovere il coperchio della scatola di gel. Caricare lentamente e con attenzione i campioni di DNA nel gel. Ancora una volta, il colorante di carico nel campione consente al campione di affondare nel gel e aiuterà a tenere traccia di quanto lontano il campione ha viaggiato. Un marcatore di dimensione del DNA, o scala, dovrebbe sempre essere caricato insieme ai campioni sperimentali.

Sostituire il coperchio. Ricontrollare che gli elettrodi siano collegati agli slot corretti nell'alimentatore.

Accendi l'alimentazione. Eseguire il gel fino a quando il colorante non è migrato a una distanza appropriata.

Quando l'elettroforesi è completa, spegnere l'alimentazione e rimuovere il coperchio della scatola di gel.

Rimuovere il gel dalla scatola del gel e scaricare il tampone in eccesso sulla superficie del gel. Posizionare il vassoio in gel su carta assorbente per assorbire l'eventuale buffer residuo.

Per visualizzare i frammenti di DNA, rimuovere il gel dal vassoio del gel ed esporre il gel alla luce ultravioletta.

Il frammento di DNA dovrebbe apparire come bande fluorescenti arancioni. Scatta una foto del gel.

Alla fine dell'esperimento, smaltire correttamente il gel e il buffer di funzionamento secondo i regolamenti dell'istituzione. Ancora una volta, ricorda di maneggiare sempre il gel e i tamponi da corsa con i guanti per evitare l'esposizione al bromuro di etidio.

Ora che hai visto come eseguire l'elettroforesi su gel del DNA. Diamo un'occhiata ad alcune applicazioni a valle e alle varianti di questo metodo molto utile.

Qui si vede un risultato di elettroforesi su gel di acarosio dopo la separazione dei prodotti PCR. I frammenti di DNA caricati nel gel sono visibili come bande chiaramente definite. Lo standard o la scala del DNA devono essere separati in misura tale da consentire l'utile determinazione delle dimensioni delle bande del campione. In questo esempio, i frammenti di DNA di 765 coppie di basi, 880 coppie di basi e 1022 coppie di basi sono separati su un gel di agarose all'1,5% con una scala di DNA a 2 log.

Oltre a confermare la presenza di un frammento di DNA di interesse, l'elettroforesi su gel di DNA può essere combinata con procedure di purificazione del gel. In genere una lama di rasoio viene utilizzata per ritagliare il frammento di DNA di interesse, in modo che possa essere raccolto e il campione di DNA al suo interno recuperato.

L'elettrofesi del gel di acarosio può anche essere combinata con il transfer blotting, che comporta il trasferimento del DNA, o RNA, a una membrana di cellulosa in cui le sonde radioattive possono essere utilizzate per identificare specifiche sequenze di DNA o RNA nel campione separato elettroforeticamente.

L'elettroforesi standard del GEL del DNA non è ideale per la separazione di DNA ad alto peso molecolare di dimensioni superiori a 15-20 kb, come il DNA genomico. Per separare campioni di DNA di grandi dimensioni, viene utilizzata l'elettroforesi su gel a campo di impulsi, che comporta l'assoggettamento del gel a un campo elettrico mutevole o pulsante in direzioni diverse. Questa tecnica coinvolge un apparato di corsa in gel specializzato, che ha coppie di elettrodi disposti in diversi orientamenti attorno al gel. Questo può essere usato per rilevare le differenze nelle dimensioni del genoma tra le popolazioni di organismi, come i campioni di DNA raggruppati da diverse comunità microbiche, che vedete qui che sono presi da diversi ambienti lacustri.

Hai appena visto un'introduzione all'elettroforesi su gel del DNA. Ti abbiamo mostrato il concetto alla base del metodo, come preparare il gel di agarose, come caricare i tuoi campioni, come eseguire il gel e analizzarlo e alcune applicazioni comuni dell'elettroforesi su gel di agarose. Grazie per aver guardato e buona fortuna con l'esecuzione del gel.