2.5: Separazione delle proteine con SDS-PAGE

SDS-PAGE è una tecnica utilizzata da molti ricercatori per separare le miscele di proteine in base alle dimensioni. Il completamento con successo di questa tecnica è un primo passo essenziale per molti metodi di analisi delle proteine, come l'immunoblotting. Di per sé, è uno strumento utile per valutare le dimensioni e la purezza delle proteine.

Per comprendere la tecnica SDS-PAGE, è necessario prima comprenderne i componenti principali. SDS-PAGE è l'acronimo di Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis. Sodio-Dodecil solfato, la prima parte di questo, o ? SDS?, è un detergente anionico. Ciò significa che è composto da un gruppo idrofilo con carica negativa netta e da una lunga catena idrofobica con carica neutra.

La catena idrofobica ricopre le proteine in proporzione alla loro massa a un tasso di 1,4 grammi di SDS per grammo di proteine. Ciò fornisce alle proteine la forza motrice necessaria per la separazione guidata dalle dimensioni in un campo elettrico.

L'elettroforesi su gel di poliacrilammide utilizza un idrogel a base di poliacrilammide. La poliacrilammide è un polimero che forma una matrice molto regolare attraverso la quale le proteine possono muoversi. Più il gel è concentrato, più lentamente le proteine lo attraverseranno quando esposte a un campo elettrico. Il processo di utilizzo di un campo elettrico spazialmente uniforme per influenzare il movimento di un oggetto è noto come elettroforesi.

SDS-PAGE viene eseguito su proteine isolate da molte fonti diverse, tra cui cellule in coltura, tessuti, sangue, urine e lieviti.

Le proteine provenienti da queste varie fonti devono prima essere separate da altri componenti cellulari utilizzando tecniche che includono l'omogeneizzazione e la centrifugazione, spesso seguite dall'uso di tamponi di lisi.

Una volta isolata la proteina, la sua concentrazione viene spesso misurata, per garantire un carico uniforme dei campioni, confrontando la quantità di proteine nel campione con gli standard di albumina in un test colorimetrico dell'acido bicinconinnico, o BCA.

Un passaggio importante da ricordare è l'aggiunta del buffer di caricamento. Il buffer di caricamento ha 3 funzioni principali. In primo luogo, grazie alla SDS e ad altri agenti riducenti, denatura le proteine, il che significa sostanzialmente che trasforma le strutture proteiche complesse in una catena lineare di amminoacidi. In secondo luogo, contiene glicerina, che assicura che il campione non galleggi via quando viene caricato nei pozzetti del gel. Infine, la maggior parte dei tamponi di carico commerciali include un colorante, come il blu di bromofenolo, che può essere monitorato per misurare l'avanzamento della fase di elettroforesi.

Dopo aver aggiunto il tampone di caricamento, i campioni devono essere miscelati e quindi fatti bollire per 5 minuti. Ciò consente di rompere i forti legami disolfuro nelle proteine con l'aiuto di un agente riducente come il beta-mercaptoetanolo. Una volta che tutti i legami disolfuro sono rotti, l'SDS può rivestire più uniformemente le proteine.

Successivamente, i campioni vengono rapidamente centrifugati e sono quindi pronti per essere caricati nel sistema su gel per l'elettroforesi.

Prima che i campioni possano essere caricati, il sistema in gel deve essere assemblato. Questo inizia con l'acquisto o la fabbricazione di un gel di poliacrilammide. I gel preconfezionati stanno diventando sempre più popolari perché l'acrilimide è neurotossica e può causare danni cerebrali. La cassetta del gel contiene pozzetti che vengono utilizzati per caricare i campioni.

Una volta che i gel sono fissati in posizione, le camere interne ed esterne vengono riempite con un tampone che contiene la stessa concentrazione di ioni utilizzata per produrre i gel. Questo crea un circuito elettrico che passa senza soluzione di continuità dal catodo, attraverso il gel e nell'anodo.

Successivamente, le scale di peso molecolare vengono tipicamente caricate nel gel, seguite dai campioni. Mentre il gel scorre, la scala si diffonderà e creerà bande proteiche visibili di dimensioni note. Nelle fasi finali, queste bande possono essere utilizzate per calcolare la dimensione di ciascuna proteina.

Una volta caricati tutti i campioni, i terminali positivo e negativo sulla scatola del gel vengono collegati a una fonte di alimentazione in grado di mantenere una tensione costante per un lungo periodo di tempo. I gel vengono in genere avviati a circa 60 V fino a quando l'intero campione non è entrato nella regione del gel chiamata "gel impilabile". Quindi, la tensione viene aumentata a circa 200 V per 30 minuti a 1 ora a seconda delle dimensioni e della concentrazione del gel e delle dimensioni della proteina di interesse.

Al termine dell'elettroforesi, la cassetta viene rimossa e aperta per esporre il gel. Il gel può quindi essere colorato con una tipica colorazione proteica, come la colorazione blu coomassie o argento, per visualizzare le bande proteiche all'interno del gel. La colorazione Coomassie può rilevare bande con un minimo di 50 nanogrammi di proteine, mentre la colorazione d'argento può rilevare bande con un minimo di 1 nanogrammo di proteine.

Nell'elettroforesi su gel bidimensionale, i campioni sono separati da due proprietà separate sui gel, una dimensione alla volta. In primo luogo, i campioni vengono caricati e disposti in base ai loro punti isoelettrici su strisce di gradiente di pH localizzate. Le proteine nella striscia vengono quindi denaturate e poste sopra un tipico gel di poliacrilammide dove vengono fissate in posizione con una soluzione di gel fresco. Quindi, la separazione della seconda dimensione viene eseguita da SDS-PAGE.

Sebbene la messa a fuoco isoelettrica non sia l'unica opzione per l'elettroforesi su gel 2D, è la più comune. L'elettroforesi su gel bidimensionale è uno strumento prezioso che fornisce informazioni sui complessi proteici e sull'organizzazione dei sottoorganelli.

Dopo aver eseguito il gel, un passo successivo molto comune è quello di trasferire le proteine dal gel su una membrana in PVDF o nylon per l'analisi. È quindi possibile utilizzare anticorpi specifici per sondare la membrana e cercare le proteine di interesse. Di seguito sono riportati i risultati tipici dell'immunoblot in cui il ricercatore ha utilizzato 3 diverse tecniche di amplificazione del segnale per determinare quale mostra meglio la presenza della proteina Pit-1 attraverso una serie di diluizioni seriali.

Hai appena visto il video di JoVE sulla separazione delle proteine utilizzando SDS-PAGE. A questo punto è necessario comprendere i passaggi necessari per risolvere una proteina in base alle dimensioni utilizzando questa potente tecnica. Come sempre, grazie per la visione!