Isolamento Manuale di cellule staminali derivate da tessuto adiposo da lipoaspirato umani

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di isolare le cellule staminali di derivazione adiposa dal grasso ottenuto sotto forma di lipoaspirato. Ciò si ottiene rimuovendo prima la soluzione chirurgica e lavando l'aspirato dai globuli rossi contaminanti. Il secondo passo consiste nel rilasciare le cellule staminali attraverso la digestione enzimatica del lipoaspirato lavato con collagenasi.

Successivamente, le cellule rilasciate sotto forma di frazione vascolare stromale o SVF vengono raccolte mediante centrifugazione. Il passaggio finale consiste nel rimuovere il surnatante e la piastra, le cellule SVF per la selezione e la coltura delle ASC aderenti. In definitiva, l'induzione in vitro di queste ASC in coltura verso l'osso, il grasso e la cartilagine.

I lignaggi possono essere utilizzati per confermare la presenza di queste cellule all'interno della coltura, oltre a confermare la loro multipotenzialità. In generale, le persone nuove a questo metodo avranno difficoltà a causa della logistica di lavorare con grandi volumi di lipo aspirina prima del prelievo cellulare. Preparare una soluzione sterile di collagenasi di tipo uno e un terreno di controllo sterile.

Raccogliere l'aspirato di lippo in un contenitore di aspirazione. Decantare con cura l'aspirato lippo in un altoparlante di vetro sterile da un litro. Quando gli strati di aspirato lippo si sono separati per gravità, aspirare lo strato superiore di olio se presente.

Inoltre, rimuovere l'inate inferiore. Valutare il volume dello strato di tessuto adiposo risultante. Aggiungere un volume uguale di XPBS sterile e mescolare con la pipetta utilizzata per l'aspirazione.

Quando i due strati si sono depositati, aspirare l'inato utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri. Continuare a lavare la frazione di tessuto adiposo con PBS fino a quando lo strato adiposo non assume un colore giallo oro. Aspirare l'inato un'ultima volta, lasciando la frazione di tessuto adiposo.

Nell'altoparlante di vetro. Lasciare riposare gli strati di aspirazione lippo per cinque minuti dopo l'ultimo lavaggio e prima dell'aspirazione finale. In un'unità filtrante, preparare una soluzione sterile di collagenasi.

Aggiungere un volume pari a quello della frazione adiposa e del filtro sterile. Quindi versare con cura la frazione adiposa lavata nella soluzione di collagenasi e chiudere bene il flacone. Quindi incubare la miscela adiposa di collagenasi in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30 minuti con un leggero vortice ogni 5-10 minuti, valutare lo strato di tessuto adiposo per un aspetto più liscio man mano che la digestione procede e, se necessario, aumentare il tempo di reazione per sciogliere eventuali pezzi solidi di grasso.

Sterilizzare l'unità filtrante contenente la miscela adiposa di collagenasi digerita con etanolo al 70% e riporla nella camera di biosicurezza. Pipettare ora aliquote da 25 millilitri dell'inato contenente la frazione vascolare stromale in provette da centrifuga sterili da 50 millilitri. Aggiungere 25 millilitri di terreno di controllo in ciascuna provetta e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti per inattivare la collagenasi.

Quindi centrifugare per 10 minuti a 1.200 volte G per raccogliere la frazione vascolare stromale sotto forma di pellet nella cabina di biosicurezza. Aspirare il surnatante da ciascuna provetta. Assicurarsi che lo strato superiore di olio e tutti gli adipociti galleggianti siano aspirati con questo surnatante.

Quindi, combinare i pellet SVF in un'unica provetta da centrifuga utilizzando 30 millilitri di terreno condizionato e dividere equamente su due nuove provette da centrifuga da 50 millilitri dopo la centrifugazione, aspirare i surnatanti dai due pellet. Se si desidera la lisi dei globuli rossi, questi due pellet possono essere risospesi in 10 millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi e incubati a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare i surnatanti per produrre pellet della frazione vascolare stromale.

Combina questi due pellet in una nuova provetta da centrifuga. Utilizzando da cinque a 10 millilitri di mezzi di controllo, le particelle di tessuto di grandi dimensioni possono essere filtrate utilizzando un filtro a maglie da 100 micron posizionato sopra una nuova provetta da centrifuga da 50 millilitri. Ora aliquotare la frazione filtrata contenente le cellule staminali adipose su piastre di coltura tissutale.

Quindi integra ogni piatto con un volume di controllo appropriato. Cultura dei media. Le cellule per tre o quattro giorni senza cambiare il terreno aspirano la coltura, il terreno e lavano le cellule una volta con PBS sterile per rimuovere eventuali globuli rossi contaminanti, quindi reintegrano il terreno e continuano la coltura quando si utilizza questo enzimatico manuale per l'isolamento di una frazione vascolare stromale da un campione di aspirato di lippo di grande volume.

La popolazione di A SC in coltura risultante è relativamente omogenea nell'aspetto e comprende cellule simili a fibroblasti come mezzo di convalida più popolare. L'induzione in vitro della popolazione di A SC utilizzando condizioni di coltura definite, determina la loro differenziazione in linee mesodermiche, ectodermiche ed endodermiche. Mentre il potenziale del tri strato germinale in vitro ha portato all'uso di ASC per un'ampia varietà di sistemi modello rigenerativi.

La differenziazione in cellule adipogeniche, osteogeniche e congeniche è generalmente sufficiente per identificare l'A SC e confermare la sua multipotenza. Inoltre, le ASC possono anche essere differenziate in cellule miogeniche scheletriche e cellule miogeniche lisce della linea ectodermica o cellule epatiche endodermiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare una frazione vascolare stromale da Lipos.

Ai fini di Turing, si tratta di un componente SC.