Name: Isolamento, la purificazione e della dicitura del mouse Bone Marrow neutrofili per studi funzionali ed Esperienze trasferimento adottivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Impara a isolare e marcare neutrofili dal midollo osseo di topo per studi funzionali e trapianti adottivi. Questo metodo utilizza centrifugazione a gradiente di densità e coloranti CellTracker per ottenere cellule pure e tracciabili.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Divisione di ricerca intramurale del Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive (NIAID), National Institute of Health (NIH), Stati Uniti d&#39;America. Tutti i topi sono stati mantenuti ad una Associazione americana per l&#39;accreditamento del Laboratorio stabulario accreditato cura degli animali presso l&#39;Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive (NIAID) e alloggiati in conformità con le procedure descritte nella Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio sotto gli auspici di un protocollo approvato dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo del NIAID.

1. Isolamento del midollo osseo di topo cellule <ol><li> Euthanize topo, utilizzando il protocollo di cura degli animali dell&#39;istituzione comitato-approvato e spruzzare la superficie degli animali con il 70% di etanolo. </li><li> Fare una incisione della pelle nella metà addome e togliere la pelle dalla parte distale del topo compresa la pelle che copre le estremità inferiori. </li><li> Tagliare i muscoli delle estremità inferiori con le forbici e dislocare attentamente dell&#39;acetabolo dall&#39;articolazione dell&#39;anca, evitando di rompere la testa del femore. </li><li> Togliere i muscoli rimanenti dal femore e tibia con un bisturi e forbici e separare il femore dalla tibia al ginocchio cura esercizio congiunto per non rompere le estremità delle ossa. Posizionare le ossa in una capsula di Petri contenente ghiacciata RPMI 1640 supplementato con 1X 10% FBS e 1% di penicillina / streptomicina. </li><li> Procedere con i seguenti passi sotto una cappa di coltura di tessuti. Prendere precauzioni extra per mantenere severe tecniche sterili per evitare neutrophil attivazione. </li><li> Lavare ogni osso con etanolo al 70% (entro una capsula Petri) seguito da tre successivi lavaggi in ghiacciata PBS sterile (entro piastre Petri) per risciacquare l&#39;etanolo dalla superficie delle ossa. </li><li> All&#39;interno di un piatto pulito sterile Petri, tagliare le epifisi delle ossa e tenerli da parte. </li><li> Utilizzare un ago calibro 25 e una siringa 12 cc riempito con RPMI supplementato con 10% FBS e 2 mM EDTA, e lavare le cellule del midollo osseo da entrambe le estremità degli alberi su un osso ml vite tubo superiore 50 Falcon equipaggiato di 100 pm filtrare. Al fine di rimuovere efficacemente tutte le cellule, raschiare la superficie interna delle ossa utilizzando l&#39;ago calibro 25. </li></ol> NOTA: imbiancamento delle ossa indica che le cellule sono state sufficientemente raschiate. Nota: utilizzare circa 10 ml di mezzi per irrigare un femore / tibia coppia. Aggiunta di EDTA al mezzo è essenziale per evitare grumi delle cellule. <ol start="9"><li> Tagliare le epifisi delle ossain piccoli 0,5-1 mm 3 pezzi con un bisturi e sfondare il filtro 100 micron con il back-end di un 2,5 ml Eppendorf Biopur Combitip plus punta della pipetta. </li><li> Centrifugare a 1400 rpm per 7 minuti a 4 ° C. </li><li> Lisare i globuli rossi da risospendere il pellet cellulare in 20 ml di NaCl 0,2% per circa 20 secondi, seguita da aggiunta di 20 ml di 1,6% NaCl. (Critico: non superare il 20-30 sec di lisi ipotonica per evitare la morte delle cellule del midollo osseo si raccomanda l&#39;uso di ipotonica di NaCl per lisi più buffer di lisi ACK perché quest&#39;ultimo ha la possibilità di attivare i neutrofili.). </li><li> Centrifugare per 7 min a 1400 rpm a 4 ° C per raccogliere le cellule. </li><li> Lavare le cellule con 1X RPMI 1640 supplementato con 10% FBS e 2 mM EDTA e centrifugare come al punto 1.12. </li><li> La resa di cellule del midollo osseo che utilizzano questo metodo è circa 60-80 milioni di euro non infetto 8-12 settimane di età C57BL / 6 del mouse. </li></ol> 2. Separazione dei neutrofilidalla centrifugazione in gradiente di densità <ol><li> Contare le cellule del midollo osseo e risospendere in 1 ml di ghiacciata PBS sterile. </li><li> Aggiungere 3 ml di Histopaque 1119 (densità 1,119 g / ml) in una provetta conica da 15 ml. </li><li> Sovrapposizione 3 ml di Histopaque 1077 (densità, 1,077 g / ml) sulla 3 ml di Histopaque 1119. </li></ol> NOTA: Histopaque il 1119 e il 1077 Histopaque deve essere portata a 18-26 ° C prima dell&#39;uso. Fase critica: Preparare gradienti immediatamente prima dell&#39;uso come preparare il gradiente in anticipo comporterà diffusione tra i due strati e non ottimale purezza neutrofili e recupero. Critical Passo: Sovrapposizione Histopaque 1077 oltre 1119 deve essere fatto lentamente in modo da evitare di mescolare le due densità, che impedisca la separazione delle cellule durante la centrifugazione. <ol start="4"><li> Sovrapporre il midollo osseo sospensione cellulare in cima alla Histopaque 1077. </li></ol> Critical Passo: OVERLaying midollo osseo sospensione cellulare sopra Histopaque 1077 deve essere fatto lentamente per evitare di disturbare l&#39;interfaccia tra le cellule e HISTOPAQUE 1077. NOTA: La risospensione cellule di midollo osseo da un mouse non infetti in 1 ml di PBS produce purezza neutrofili&gt; 90%. Tuttavia, pool molti campioni di midollo osseo compromette purezza neutrofili, per esempio, risospendere 300 x 10 6 cellule in 3 ml di PBS riduce purezza neutrofili da&gt; 90% a ~ 80%. Pertanto, gli investigatori dovrebbero eseguire esperimenti pilota per identificare il conteggio / volume delle cellule condizioni ideali per le loro specifiche esperienze <ol start="5"><li> Centrifugare per 30 min a 2000 rpm a 25 ° C senza freno. </li></ol> NOTA: La centrifugazione del gradiente a temperatura ambiente è fondamentale ed essenziale per una efficace separazione dei neutrofili. <ol start="6"><li> Raccogliere i neutrofili a livello di interfaccia del Histopaque il 1119 e il 1077 Histopaque strati. </li&gt; <li> Lavare i neutrofili raccolti due volte con RPMI 1640 supplementato con 10 1X% FBS e 1% di penicillina / streptomicina e centrifugare a 1400 rpm per 7 minuti a 4 ° C. </li><li> Contare i neutrofili e determinare la loro vitalità. </li></ol> NOTA: I neutrofili sono tipicamente&gt; 95% vitali e&gt; 90% puro, come determinato mediante analisi FACS. La resa tipica di neutrofili dal midollo osseo (cioè 2 femore e tibia ossa 2) di una non infetta 8-12 settimane di età C57BL / 6 mouse è ~ 6-12.000.000 cellule. Questo numero è notevolmente maggiore quando i neutrofili sono raccolte dal midollo osseo di animali infetti. Quindi, ~ 30-40 milioni di neutrofili / topo sono stati recuperati quando i topi con infezione da Candida sono stati utilizzati per la raccolta di cellule 6. 3. Etichettatura dei neutrofili utilizzando coloranti CellTracker <ol><li> Risospendere le neutrofili a 5 x 10 6 cellule / ml in PBS preriscaldato a 37 ° C. </li><li> Aggiungi un colorante CellTracker ad un concent finalerazione di 5 micron. </li></ol> NOTA: CellTracker Verde (CMFDA (5 Chloromethylfluorescein Diacetato) e CellTracker Orange (CMTMR (5 - (e-6)-4-Chloromethyl benzoile Tetramethylrhodamine Amino) è stato utilizzato in questo protocollo per etichettare in modo differenziale neutrofili da wild-type e gene-carente topi. NOTA: Preparare una soluzione stock di 10 mM di CellTracker Verde e CellTracker Arancione, aliquota, e conservare a -80 ° C fino a quando il giorno dell&#39;esperimento. <ol start="3"><li> Incubare neutrofili con 5 pM del colorante CellTracker corrispondente per 10 min a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua nel buio. </li><li> Lavare le cellule due volte con ghiacciata RPMI 1640 supplementato con 1X 10% FBS e 1% di penicillina / streptomicina. </li></ol> NOTA: Un lavaggio efficace delle cellule dopo il passo di etichettatura con il colorante CellTracker è essenziale per evitare la contaminazione incrociata colorante prima della miscelazione popolazioni neutrofili differenzialmente etichettati per bassitream studi ripopolamento competitivi. 4. Trasferimento adottivo di neutrofili in Mouse e analisi dei neutrofili trasferiti mediante citometria a flusso <ol><li> Neutrofili Risospendere in PBS freddo ad una concentrazione di 25 x 10 6 cellule / ml e iniettare 200 microlitri della sospensione nella vena caudale laterale in modo che 5 x 10 6 neutrofili sono trasferiti per topo. Per gli studi di neutrofili ripopolamento competitivi, mescolare neutrofili wild-type e gene-carente in un rapporto di 1:1 e iniettare un totale di 5 x 10 6 neutrofili per topo come sopra. </li></ol> NOTA: almeno fino a 10 x 10 6 neutrofili possono essere adoptively trasferiti per il mouse senza evidente tossicità immediate agli animali. <ol start="2"><li> In tempi diversi dopo trasferimento adottivo (ad esempio 1, 2, 3 o 4 ore post-transfer), eutanasia topi e sangue raccolto, e / o midollo osseo e / o di altro organo bersaglio (s) di interesse. </li><li> Preparare SIsospensioni cellulari NGLE di questi tessuti per l&#39;analisi quantitativa e qualitativa dei neutrofili etichettati adoptively trasferiti utilizzando pubblicato protocolli 6,15. </li><li> Seguendo vivo / morto colorazione viabilità e blocco Fc, etichettare le cellule con CD45 (clone 30-F11), Ly6G (clone 1A8) e CD11b (M1/70 clone) e porta sul vivo CD45 + Ly6G + CD11b + neutrofili. I neutrofili in questo cancello includono neutrofili nativi del mouse destinatario, nonché i neutrofili etichettati adoptively trasferiti, che sono + FITC (se etichettato con CellTracker verde) o PE + (se etichettato con Cell Tracker arancione). </li></ol> NOTA: I neutrofili possono essere rintracciati nel sangue, midollo osseo e rene di topi Candida-infettati per almeno 4 ore post-trasferimento. NOTA: Fissaggio con 2% paraformaldeide in PBS non alterino la media intensità di fluorescenza dei neutrofili etichettati con CellTracker Green o CellTracker Arancione per almeno 48 ore.

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Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.

Qui vi presentiamo un semplice protocollo affidabile, veloce ed economico per l&#39;isolamento di un gran numero di neutrofili dal midollo osseo di topi con elevata purezza e vitalità utilizzando un approccio di centrifugazione in gradiente di densità. Quando questo protocollo è eseguita correttamente, ~ 6-12 × 10 6 neutrofili possono essere recuperati da un mouse non infetto e fino a ~ 30-40 × 10 6 neutrofili possono essere isolati da un topo dopo l&#39;infezione 6. I neutrofili isolati...

I neutrofili sono i leucociti più abbondanti nell&#39;uomo. Essi sono la principale componente cellulare del sistema immunitario innato e ad agire come una prima linea di difesa contro l&#39;invasione dei microrganismi. I pazienti con neutropenia acquisita e immunodeficienze primarie che interessano i numeri dei neutrofili e / o funzione di sviluppare infezioni invasive potenzialmente letali batteriche e fungine, mettendo in evidenza l&#39;importanza di queste cellule in serie della difesa 1. Riconoscimento immune di patogeni nel sito dell&#39;infezione dai loro cognate di riconoscimento di recettori risultati nella induzione di una risposta immunitaria innata orchestrato, che porta alla secrezione di fattori chemiotattici che generano un gradiente chemiotattico capace di reclutare neutrofili dal sangue nel tessuto infiammato 2 . Dopo neutrofili entrano nel sito dell&#39;infezione, diventano attivate, che porta a citochine e chemochine, assorbimento patogeno, e uccidendo via ossidativa e non ossidativa mechanisms 3. Oltre al loro ruolo ben riconosciuto nella immunità innata, i neutrofili sono stati anche recentemente dimostrato di svolgere ruoli importanti come iniziatori di efficaci risposte immunitarie adattative 4. D&#39;altra parte, a prescindere dai loro ruoli protettivi nell&#39;immunità, neutrofili possono anche mediare il danno tissutale e immunopatologia causa di un eccessivo accumulo e / o l&#39;attivazione ai siti di infiammazione, come mostrato in una varietà di malattie infettive e autoimmuni 5-7. Nonostante il ruolo indispensabile dei neutrofili nel montaggio efficaci risposte immunitarie innate e le loro funzioni effettrici pleiotropici in diverse malattie infettive e le condizioni infiammatorie, difficoltà tecniche con la gestione di queste cellule e la mancanza di protocolli sperimentali affidabili ha ostacolato la ricerca con neutrofili nel corso degli ultimi decenni. Pertanto, l&#39;uso di test riproducibili per l&#39;isolamento dei neutrofili dovrebbe facilitare ulteriormente la ricerca sui mediato dai neutrofili immunologicigica funzioni ex vivo e in vivo. Ad oggi, diversi metodi sono stati descritti per l&#39;isolamento dei neutrofili come la densità centrifugazione in gradiente di sangue umano e mouse o midollo osseo 8,9, arricchimento immunomagnetico positivo o negativo di neutrofili dal sangue o midollo osseo del mouse 10,11, e raccolta di neutrofili dalla cavità peritoneale di topi dopo iniezione intraperitoneale di tioglicolato o altri agenti infiammatori 12. Sebbene neutrofili possono essere facilmente isolati in gran numero da sangue umano, questo metodo è subottimale nei topi a causa delle ridotte dimensioni di sangue topo che preclude l&#39;isolamento dei neutrofili sufficienti per studi funzionali o esperimenti trasferimento adottivo 13. Inoltre, anche se la resa di tioglicolato-suscitato cellule dalla cavità peritoneale è maggiore rispetto a quella del sangue topo, la purezza dei neutrofili nel lavaggio peritoneale infiammatoria varia tra60-90%, ed i neutrofili isolati esibiscono un fenotipo attivato. Così, le cellule raccolte mediante questo metodo può essere utilizzato solo per l&#39;esecuzione di studi funzionali di attivazione, ma non di neutrofili non stimolati, come la cavità peritoneale del mouse ha pochi neutrofili alla stato stazionario 12. Invece, il midollo osseo è un serbatoio per la raccolta conveniente tantissimi sia non stimolate o attivati ​​neutrofili 11,14, che possono poi essere utilizzati per studi funzionali valle come fagocitosi, uccisione e degranulazione, o per il trasferimento adottivo in topi riceventi. Qui descriviamo un semplice e veloce (circa 2 ore) il protocollo, che prevede un alto rendimento (~ 6-12 × 10 6 neutrofili / topo infetto, o fino a 30-40 × 10 6 neutrofili / topo infetto) di puro (80 -95%) con neutrofili&gt; 95% della vitalità dal midollo osseo. Questo metodo utilizza commercialmente disponibile Histopaque, che sono cellule gradiente di densità sepasupporti razione composto da Ficoll e diatrizoato sodio, per separare i neutrofili dal midollo osseo di topi. Questo metodo fornisce significativamente più grande numero di neutrofili per topo rispetto al sangue o cavità peritoneale, può essere utilizzata per raccogliere neutrofili da topi sia in stato stazionario o dopo l&#39;infezione, ed è più facile strato rispetto al metodo di centrifugazione in gradiente di densità che utilizza discontinuo gradienti percoll composto da 55% / 65% / 75% Percoll in PBS 9. Inoltre, il tempo e le risorse necessarie per raccogliere i neutrofili puri sono significativamente diminuiti rispetto all&#39;isolamento dei neutrofili mediante Fluorescence-Activated cella Ordinamento. Inoltre, poiché questo metodo non comporta un passaggio di arricchimento immunomagnetico, è più conveniente, ed evita l&#39;esposizione delle cellule a colonna magnetica e anticorpi, diminuendo così la probabilità di attivazione dei neutrofili. Oltre a eseguire studi funzionali di neutroph isolatoils ex vivo e il trasferimento adottivo di cellule in topi riceventi, questo protocollo descrive anche un metodo per l&#39;etichettatura dei neutrofili isolati utilizzando diversi coloranti CellTracker. Etichettatura differenziale dei neutrofili da topi di vari background genetico può essere adattato in studi ripopolamento competitivi per il monitoraggio dei neutrofili trasferiti nei tessuti di topi riceventi tramite citometria a flusso, che può fornire la comprensione meccanicistica sul ruolo diretto di geni specifici nel traffico di neutrofili dal sangue in bersaglio organi infiammati 6.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><forte>Reagenti</forte></td></tr><tr><td>RPMI 1640 1X con L-glutammina e 25 mM HEPES</td><td>Cellgro</td><td>10-041-CV</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Siero Fetale Bovino (Inattivato a Caldo)</td><td>GemCell</td><td>100500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina (10.000 unità di penicillina / 10.000 mg/ml di streptococco)</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Qualità Biologica Inc</td><td>351-027-101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio 0,2% e 1,6%</td><td>JT Baker</td><td>3624</td><td>Soluzioni di cloruro di sodio preparate utilizzando acqua distillata e filtrate sterili</td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>Histopaque 1077 deve essere portato a 18-26 gradi &deg; C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Sterile filtrato Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Histopaque 1119 deve essere portato a 18-26 gradi C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza calcio e magnesio</td><td>Cellgro</td><td>210-40-CV</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alcool etilico (200 proof)</td><td>The Warner Graham Company</td><td>64-17-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CellTracker Green (CMFDA, 5-clorometilfluoresceina diacetato)</td><td>Invitrogen</td><td>C-7025</td><td>Preparare soluzioni stock di 10 mM in DMSO, aliquotare e conservare a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>CellTracker Orange (CMTMR, 5-(e 6)-4-Clorometil benzoile ammino tetrametilrodamina)</td><td>Invitrogen</td><td>C-2927</td><td>Produrre soluzioni madre di 10 mM in DMSO, aliquotare e conservare a -80 gradi; C</td></tr><tr><td>Anti-topo CD45 (Clone 30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>170451-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-topo Ly6G (Clone 1A8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>551461</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-topo Ly6G (Clone 1A8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>560599</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-topo CD11b (Clone M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>47-0112-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-topo CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td>Utilizzare a diluizione 1:100</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit di colorazione di cellule morte blu fissabili</td><td>Sonde molecolari</td><td>L-23105</td><td>Utilizzo a diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide, 4% in PBS</td><td>USB Corporation</td><td>19943</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabella 1. Reagenti per l'isolamento, l'etichettatura e il monitoraggio dei neutrofili trasferiti in modo adottivo.</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Materiali</td></tr><tr><td>C57BL/6 mouse</td><td>Taconic</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 15 ml</td><td>Corning</td><td>430053</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipette sierologiche da 25 ml</td><td>Celltreat</td><td>229225B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipette sierologiche da 10 ml</td><td>Celltreat</td><td>229210B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipette sierologiche da 5 ml</td><td>Celltreat</td><td>229205B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur (3 ml)</td><td>BD Falcon</td><td>357575</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Siringhe da 12 ml Kendall</td><td>monoject</td><td>512878</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>25 G x 5/8 pollici Aghi (aghi di scorrimento di precisione)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtri per celle da 100 mm</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastre di Petri battericida</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Combitips Plus Biopur</td><td>Eppendorf</td><td>2249608-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Strumenti per la dissezione di topi (forbici, pinze, bisturi)</td><td>Strumenti di ricerca biomedica</td><td>10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000</td><td>Strumenti sterilizzati prima dell'uso</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Cappa per coltura tissutale</td><td>The Baker Company</td><td>SG403</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>75004521</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>37 gradi C agitazione bagno d'acqua</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>3166721</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabella 2. Elenco dei materiali e delle attrezzature utilizzate in questo protocollo.</td></tr></tbody></table>

isolamento, la purificazione e della dicitura del mouse bone marrow neutrofili per studi funzionali ed esperienze trasferimento adottivo

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrofili sono cellule critiche effettrici del sistema immunitario innato. Sono rapidamente reclutati ai siti di infiammazione acuta e esercitano effetti protettivi o patogeni seconda del milieu infiammatorio. Tuttavia, nonostante il ruolo indispensabile dei neutrofili nel sistema immunitario, la comprensione dettagliata dei fattori molecolari che mediano gli effetti effettrici e immunopatogenici neutrofili &#39;in diverse malattie infettive e le condizioni infiammatorie che ancora manca, in parte a causa della loro breve emivita, le difficoltà con la gestione di questi celle e la mancanza di protocolli sperimentali affidabili per ottenere un numero sufficiente di neutrofili per studi funzionali a valle e gli esperimenti di trasferimento adottivo. Pertanto, metodi semplici, veloci, economici e affidabili sono altamente desiderabile per la raccolta di un numero sufficiente di neutrofili del mouse per valutare funzioni quali la fagocitosi, l&#39;uccisione, la produzione di citochine, degranulazione e il traffico. A tal fine,vi presentiamo un protocollo riproducibile gradiente di densità centrifugazione a base, che può essere adattato in qualsiasi laboratorio per isolare un gran numero di neutrofili dal midollo osseo di topi con elevata purezza e vitalità. Inoltre, vi presentiamo un semplice protocollo che utilizza coloranti CellTracker per etichettare i neutrofili isolati, che possono poi essere trasferiti adoptively in topi riceventi e monitorati in diversi tessuti per almeno 4 ore post-trasferimento in citometria a flusso. Usando questo approccio, l&#39;etichettatura differenziale dei neutrofili da topi wild-type e gene-deficienti con diversi coloranti CellTracker può essere impiegato con successo per eseguire studi di ripopolamento della concorrenza per valutare il ruolo diretto di geni specifici nel traffico di neutrofili dal sangue nei tessuti bersaglio in vivo .

Questo protocollo è ottimizzato per la raccolta di cellule di midollo osseo di topo e la successiva separazione di neutrofili dal queste cellule mediante centrifugazione in gradiente di densità utilizzando commercialmente disponibili mezzi di separazione cellulare HISTOPAQUE. Neutrofili isolati usando questo metodo può essere utilizzato per una varietà di valle studi ex vivo e funzionale per esperimenti trasferimento adottivo in topi riceventi. La resa tipica di raccolta delle cellu...

Si descrive un protocollo per l&#39;isolamento e la purificazione di neutrofili dal midollo osseo di topo per centrifugazione in gradiente di densità e di etichettatura neutrofili utilizzando coloranti CellTracker. Questo rappresenta un metodo semplice e veloce, riproducibile ed economico per ottenere un gran numero di neutrofili per studi funzionali a valle o di trasferimento ed inseguimento esperimenti adottive.

Isolamento, la purificazione e della dicitura del mouse Bone Marrow neutrofili per studi funzionali ed Esperienze trasferimento adottivo

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare ed etichettare i neutrofili dal midollo osseo di topo per successivi studi funzionali ed esperimenti di trasferimento adottivo. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo le cellule del midollo osseo dai femori e dalle tibie di topo. Nel secondo passaggio, i globuli rossi vengono lisi osmoticamente sospesi in modo sequenziale in soluzioni di cloruro di sodio allo 0,2% e all'1,6% rispettivamente.Successivamente, i neutrofili vengono isolati mediante centrifugazione su gradiente di densità. Nell'ultimo passaggio, i neutrofili vengono marcati con coloranti tracker per cellule. Infine, la citometria a flusso può essere utilizzata per determinare il numero di neutrofili trasferiti adottivamente reclutati in diversi tessuti murini.Il vantaggio principale dell'isolamento dei neutrofili murini dal midollo osseo rispetto al sangue o al peritoneo è che un elevato numero di cellule, sufficiente per studi funzionali successivi ed esperimenti di trasferimento adottivo, può essere ottenuto dal midollo osseo sia in condizioni di stato stazionario che dopo un'infezione. Il vantaggio dell'utilizzo della tecnica di centrifugazione su gradiente per l'isolamento dei neutrofili murini rispetto alla selezione immunomagnetica o al sorting cellulare attivato da fluorescenza è che è rapida, economica e evita l'etichettatura dei neutrofili con anticorpi, che potrebbe indurre l'attivazione dei neutrofili. A dimostrare la procedura sarà Muca Swami Us, un tecnico del mio laboratorio, dopo aver spruzzato un topo eutanasizzato con etanolo al 70%.Eseguire un'incisione nella regione addominale mediale del tessuto cutaneo dell'animale, quindi rimuovere il tessuto cutaneo dalla parte distale dell'animale, comprese le estremit&agrave; inferiori. Successivamente, utilizzare le forbici per tagliare i muscoli degli arti posteriori dell'animale e quindi dislocare con attenzione l'articolazione coxo-femorale dall'articolazione dell'anca, evitando di fratturare la testa del femore. Quindi utilizzare le forbici come bisturi per rimuovere il tessuto muscolare residuo da femore e tibia.Separare le ossa delle zampe all'articolazione del ginocchio, avendo cura di non rompere le estremità delle ossa, quindi posizionare le ossa in una piastra di Petri contenente RPMI 1640 freddo su ghiaccio. Introdurre FBS e antibiotici. Trasferire la piastra in una cappa a flusso laminare e sterilizzare l'esterno di ciascun osso con etanolo al 70% in una nuova piastra di Petri.Dopo circa 10-15 secondi, risciacquare l'etanolo dalla superficie di ciascun osso con tre lavaggi successivi in PBS sterile freddo di ghiaccio. Quindi tagliare e posizionare l'epifisi di ciascun osso in una nuova piastra di Petri sterile. Successivamente, applicare un ago da 25 gauge a una siringa da 12 cc riempita con 10 millilitri di RPMI.Integrare con FBS ed EDTA. Quindi, lavare le cellule del midollo osseo da entrambe le estremità della diafisi di ciascuna coppia femore-tibia in un tubo Falcon da 50 millilitri con tappo a vite, filtrando attraverso un filtro da 100 micrometri per rimuovere tutte le cellule. Raschiare le superfici interne delle ossa con la punta dell'ago.Quando le ossa appaiono sbiancate, le cellule sono state rimossi in modo sufficiente. Ora utilizzare un bisturi per tagliare le epifisi ossee in piccoli pezzi quadrati di 0,5-1 millimetro e quindi usare l'estremit&agrave; posteriore di una pipetta da 2,5 millilitri con punta einor comb pi&ugrave; BioPure per frantumarli attraverso un filtro da 100 micrometri. Dopo aver centrifugato le cellule raccolte per sette minuti a 427 &times;g e a 4 gradi Celsius, lisare i globuli rossi in 20 millilitri di cloruro di sodio allo 0,2% per circa 20 secondi.Quindi arrestare la lisi con 20 millilitri di cloruro di sodio allo 1,6%, centrifugare le cellule e successivamente risospendere il pellet in RPMI 1640 integrato con FBS ed EDTA. Contare le cellule e, dopo averle centrifugate nuovamente, risospendere il pellet lavato in non più di 100 × 10⁶ cellule per un millilitro di PBS sterile freddo. Ora distribuire tre millilitri di soluzione opaca 1119 a una temperatura di 18-26 °C in un tubo conico da 15 millilitri, quindi sovrapporre lentamente tre millilitri di soluzione opaca 1119 a una temperatura di 18-26 °C.Il suo opaco 1 0 7 7. Evitare di mescolare le due densità immediatamente dopo aver preparato l'opaco; stratificare con attenzione la sospensione di cellule del midollo osseo sopra l'opaco 1 0 7 7, centrifugare il gradiente di densità per 30 minuti a 834 ×g e 25 °C senza frenata, quindi raccogliere i neutrofili all'interfaccia tra gli strati opaco 1 1 1 9 e 1 0 7 7. Dopo aver lavato i neutrofili raccolti due volte in RPMI 1 6 40 con FBS e antibiotici, risospendere le cellule a una concentrazione di 5 × 10⁶ cellule per millilitro in PBS preriscaldato a 37 °C.Dopo aver contato le cellule, riservare un piccolo aliquota di ciascun campione sperimentale per determinare la purezza e la vitalità mediante citometria a flusso, quindi etichettare i neutrofili rimanenti con un colorante tracker cellulare a una concentrazione finale di cinque micromolari per 10 minuti a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua agitato al buio. Infine, lavare le cellule due volte con RPMI 1 6 4 0 freddo integrato con FBS e antibiotici per evitare contaminazione incrociata del colorante prima di mescolare le popolazioni di neutrofili diversamente etichettate per studi successivi di ripopolamento competitivo. In questo pannello vengono mostrati grafici rappresentativi di citometria a flusso di neutrofili isolati dal midollo osseo mediante separazione su gradiente di densità ottenuti da un topo C 57 black six non infetto. La selezione iniziale utilizzata per le cellule del midollo osseo raccolte dall'interfaccia tra histopaque 1 1 1 9 e histopaque 1 0 7 7.Utilizzando la diffusione anteriore e laterale, si dimostra che i neutrofili separati mediante gradiente di densità sono puri per oltre il 90% e vitali per oltre il 95% per almeno quattro ore dopo il trasferimento adottivo con tracciante cellulare. I neutrofili marcati con DIA possono essere tracciati mediante citometria a flusso in diversi tessuti murini. Ad esempio, nel sangue, nel midollo osseo e nei reni del topo ricevente infetto da Candida, ceppo C57BL/6, mostrato in questo esperimento, selezionando le cellule vive CD45 Ly6G CD11b negative, questi neutrofili rappresentativi trasferiti adottivamente e marcati con CMTMR possono essere differenziati dai neutrofili nativi del topo ricevente, negativi per CMTMR e PE, grazie all'espressione di PE.Una volta acquisita padronanza, l'isolamento e la marcatura dei neutrofili del midollo osseo del mouse può essere completato in tre ore.

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Immunologia e Infezioni

Il trapianto di midollo osseo fornisce un modo per modificare il genotipo delle cellule del midollo osseo derivate. Se il gene di interesse viene espresso in cellule di midollo osseo sia derivati ​​e non le cellule del midollo osseo derivate, trapianto di midollo osseo può modificare le cellule del midollo osseo derivate da un genotipo diverso senza cambiare la non-genotipo delle cellule del midollo osseo derivate.

Differenziare i ruoli funzionali di espressione genica di cellule immunitarie e non immunitarie in Colite mouse da trapianto di midollo osseo

Qui presentiamo un protocollo che genera grandi quantità di monociti murini da midollo osseo eterogeneo per applicazioni traduzionali. Rispetto ad altri, questo nuovo metodo aiuta a ridurre il numero di animali sacrificati e abbassa i costi evitando metodi costosi come la separazione cellulare magnetica ad alto gradiente (MACS).

Isolamento e iniezione endovenosa di Murine derivate dal midollo osseo monociti

Questo manoscritto fornisce una procedura tecnica che può essere utilizzato per caratterizzare colture cellulari C1498 in vitro e la leucemia acuta indotta nei topi dopo l'iniezione. Fenotipiche e funzionali analisi vengono eseguite utilizzando citometria a flusso, microscopia a immunofluorescenza, citochimica e maggio-Grünwald Giemsa.

Un protocollo dettagliato per caratterizzare la linea cellulare murina C1498 e il suo modello associato leucemia mouse

Nuovi protocolli sono descritti qui per isolare e caratterizzare microparticelle derivate dall'essere umano e del mouse neutrofili. Questi protocolli utilizzano ultracentrifugazione, citometria a flusso e tecniche di immunoblotting per analizzare il contenuto di microparticelle, e sono utilizzabili per studiare il ruolo delle microparticelle derivate da vari tipi di cellule nella funzione cellulare.

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Dimostriamo come identificare e isolare 6 sottoinsiemi dei progenitori mieloidi dal midollo osseo murino utilizzando una combinazione di magnetico e fluorescenza ordinamento (MACS e FACS). Questo protocollo può essere usato per analisi di RNA/proteine, in vivo gli esperimenti di trasferimento adottivo e saggi di cultura in vitro (colture di metilcellulosa o liquido).

Identificazione e isolamento di Oligopotent e dei progenitori mieloidi Lineage-commesso dal midollo osseo del topo

Qui, presentiamo un protocollo per la determinazione in vivo dell'ingenuo T CD4 delle cellule (cellule T) attivazione, proliferazione e differenziazione Th1, indotta da GM-CSF midollo osseo (BM)-derivato le cellule dendritiche (DCs). Inoltre, questo protocollo descrive isolamento BM e T-cell, generazione di DC e DC e T-cell trasferimento adottivo.

Un modello di topo In Vivo di attivazione delle cellule T Naïve CD4 di misura, la proliferazione e la differenziazione Th1 indotta dalle cellule dendritiche derivate da midollo osseo

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Questa ricerca delinea due tecniche per isolare abbondanti trappole extracellulari neutrofile (NET) dal midollo osseo di ratto. Un metodo combina un kit commerciale di isolamento dei neutrofili con la centrifugazione a gradiente di densità, mentre l'altro impiega solo la centrifugazione a gradiente di densità. Entrambi gli approcci producono NET funzionali che superano quelli dei neutrofili del sangue periferico.

Approccio unico per l'isolamento di neutrofili del midollo osseo di ratto con capacità comparabili

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Questo manoscritto delinea un protocollo per la preparazione di una libreria ATAC-seq di neutrofili da midollo osseo murino, con l'obiettivo di garantire una vitalità ottimale dei neutrofili e un'elevata qualità della libreria. Offre istruzioni dettagliate sulla preparazione del BMC, lo smistamento immunomagnetico e la costruzione di librerie, fungendo da guida preziosa, soprattutto per i neofiti dello studio dei neutrofili.

Libreria ATAC-Seq Preparazione di neutrofili derivati dal midollo osseo murino

Impara a isolare e marcare neutrofili dal midollo osseo di topo per studi funzionali e trapianti adottivi. Questo metodo utilizza centrifugazione a gradiente di densità e coloranti CellTracker per ottenere cellule pure e tracciabili.

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Isolamento, la purificazione e della dicitura del mouse Bone Marrow neutrofili per studi funzionali ed Esperienze trasferimento adottivo

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