Isolamento, la purificazione e della dicitura del mouse Bone Marrow neutrofili per studi funzionali ed Esperienze trasferimento adottivo

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e marcare i neutrofili dal midollo osseo di topo per studi funzionali a valle ed esperimenti di trasferimento adottivo. Ciò si ottiene raccogliendo prima le cellule del midollo osseo da mure, femori e tibia. Durante la seconda fase, i globuli rossi vengono allacciati osmoticamente sospendendoli in sequenza in soluzioni di cloruro di sodio rispettivamente allo 0,2% e all'1,6%.

Successivamente, i neutrofili vengono isolati mediante centrifugazione in gradiente di densità. Nella fase finale, i neutrofili vengono marcati con coloranti per tracciatori cellulari. In definitiva, la citometria a flusso può essere utilizzata per determinare il numero di neutrofili trasferiti in adozione reclutati in vari tessuti di topo.

Il vantaggio principale dell'isolamento dei neutrofili di topo dal midollo osseo rispetto al sangue o al peritoneo, è che il gran numero di cellule sufficienti per gli studi funzionali a valle e gli esperimenti di trasferimento adottivo può essere ottenuto dal midollo osseo sia durante lo stato stazionario che dopo l'infezione. Il vantaggio dell'utilizzo di una tecnica di centrifugazione a gradiente per isolare i neutrofili di topo rispetto alla selezione immunomagnetica della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza è che è veloce, economica ed evita di marcare i neutrofili con anticorpi, che possono indurre l'attivazione dei neutrofili. A dimostrare la procedura sarà muca Swami Us, un tecnico del mio laboratorio dopo aver spruzzato un topo soppresso con etanolo al 70%.

Praticare un'incisione nella regione addominale media della pelle dell'animale e quindi rimuovere il tessuto cutaneo dalla parte distale dell'animale, compresi gli arti inferiori. Successivamente, usa le forbici per tagliare i muscoli dagli arti posteriori dell'animale e poi disloca con cura l'ACE beum dall'articolazione dell'anca, evitando di rompere la testa del femore. Quindi usa le forbici in un bisturi per rimuovere il muscolo rimanente dal femore e dalla tibia.

Separare le ossa della gamba all'altezza dell'articolazione del ginocchio, facendo attenzione a non rompere le estremità ossee, quindi posizionare le ossa in una capsula di Petri contenente RPMI 1 6 4 ohm ghiacciato. Integrare con FBS e antibiotici. Trasferire la piastra in una cappa di coltura tissutale e quindi sterilizzare l'esterno di ciascun osso con etanolo al 70% in una nuova piastra di Petri.

Dopo circa 10-15 secondi, sciacquare l'etanolo dalla superficie di ciascun osso con tre lavaggi successivi in PBS sterile ghiacciato. Quindi tagliare e posizionare l'epifisi di ciascuna delle ossa in una nuova capsula di Petri sterile. Quindi, collegare un ago calibro 25 a una siringa da 12 cc riempita con 10 millilitri di RPMI.

Integrare con FBS e EDTA. Quindi sciacquare le cellule del midollo osseo da entrambe le estremità dell'asta di ciascuna coppia di femore-tibia su un tubo Falcon con tappo a vite da 50 millilitri sbiadito con un filtro da 100 micrometri per rimuovere tutte le cellule. Raschiare le superfici interne delle ossa con la punta dell'ago.

Quando le ossa appaiono sbiancate, le cellule sono state sufficientemente rimosse. A questo punto, con un bisturi, tagliate le epifisi ossee in piccoli pezzi Q da 0,5 a un millimetro, quindi utilizzate l'estremità posteriore di una punta a pettine einor da 2,5 millilitri e la punta della pipetta BioPure per farle passare attraverso il filtro da 100 micrometri. Dopo aver centrifugato le cellule raccolte per sette minuti a 427 volte G e quattro gradi Celsius, i globuli rossi in 20 millilitri di cloruro di sodio allo 0,2% per circa 20 secondi.

Quindi interrompere la lisi con 20 millilitri di cloruro di sodio all'1,6%, centrifugare le cellule e quindi risospendere il pellet in RPMI 1 6 4 oh integratore con FBS e EDTA. Contare le celle e poi, dopo averle fatte girare di nuovo, risospendere il pellet lavato a non più di 100 volte 10 per le sei celle per un millilitro di ghiaccio. PBS sterile a freddo Ora erogare tre millilitri da 18 a 26 gradi Celsius, il suo opaco 1 1 1 9 in un tubo conico da 15 millilitri, quindi sovrapporre lentamente tre millilitri da 18 a 26 gradi Celsius.

Il suo opaco 1 0 7 7. Evitando di mescolare le due densità subito dopo aver preparato il suo opaco, stratificare accuratamente la sospensione cellulare del midollo osseo sopra la sua centrifuga opaca 1 0 7 7, il gradiente di densità per 30 minuti a 834 volte G e 25 gradi Celsius senza la rottura, e quindi raccogliere i neutrofili all'interfaccia dei suoi strati opachi 1 1 1 9 e 1 0 7 7. Dopo aver lavato i neutrofili raccolti due volte in RPMI 1, 6, 4 oh, FBS e antibiotici Resus, sospendere le cellule a cinque volte 10 alle sei cellule per millilitro in PBS, preriscaldare a 37 gradi Celsius.

Dopo aver contato le cellule, riservare una piccola aliquota di ciascun campione sperimentale per determinare la purezza e la vitalità mediante citometria a flusso, quindi etichettare i neutrofili rimanenti con un colorante tracciante cellulare a una concentrazione finale di cinque micromolari per 10 minuti a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua agitante al buio. Infine, lavare le cellule due volte con RPMI 1 6 4 oh freddo con FBS e antibiotici per evitare la contaminazione incrociata del colorante prima di mescolare le popolazioni di neutrofili marcate in modo differenziale per studi di ripopolamento competitivo a valle qui, in questo pannello sono mostrati grafici rappresentativi di citometria a flusso rappresentativi di neutrofili separati da gradiente di densità isolato nel midollo osseo da un topo nero sei C 57 non infetto. Il gating iniziale utilizzato per le cellule del midollo osseo raccolte dall'interfaccia dell'istopata 1 1 1 9 e dell'istopata 1 0 7 7.

Utilizzando la dispersione diretta e laterale, è dimostrato che i neutrofili separati dal gradiente di densità sono puri al 90% e vitali per almeno quattro ore dopo il tracciamento delle cellule di trasferimento adottivo. I neutrofili marcati con DIA possono essere monitorati mediante citometria a flusso in vari problemi di topo. Ad esempio, nel sangue, nel midollo osseo e nei reni del topo nero sei C 57 infetto da candida ricevente, mostrato in questo esperimento mediante gating sulle cellule C 45 LY sei G CD 11 B vive, questi neutrofili marcati con C-M-T-M-R trasferiti in modo adottivo possono essere differenziati dai neutrofili nativi C-M-T-M-R e PE negativi del topo ricevente in base alla loro espressione di PE.

Una volta padroneggiato, l'isolamento e la marcatura dei neutrofili del midollo osseo di topo possono essere completati in tre ore.