Isolamento, la purificazione e della dicitura del mouse Bone Marrow neutrofili per studi funzionali ed Esperienze trasferimento adottivo

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare ed etichettare i neutrofili dal midollo osseo di topo per successivi studi funzionali ed esperimenti di trasferimento adottivo. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo le cellule del midollo osseo dai femori e dalle tibie di topo. Nel secondo passaggio, i globuli rossi vengono lisi osmoticamente sospesi in modo sequenziale in soluzioni di cloruro di sodio allo 0,2% e all'1,6% rispettivamente.

Successivamente, i neutrofili vengono isolati mediante centrifugazione su gradiente di densità. Nell'ultimo passaggio, i neutrofili vengono marcati con coloranti tracker per cellule. Infine, la citometria a flusso può essere utilizzata per determinare il numero di neutrofili trasferiti adottivamente reclutati in diversi tessuti murini.

Il vantaggio principale dell'isolamento dei neutrofili murini dal midollo osseo rispetto al sangue o al peritoneo è che un elevato numero di cellule, sufficiente per studi funzionali successivi ed esperimenti di trasferimento adottivo, può essere ottenuto dal midollo osseo sia in condizioni di stato stazionario che dopo un'infezione. Il vantaggio dell'utilizzo della tecnica di centrifugazione su gradiente per l'isolamento dei neutrofili murini rispetto alla selezione immunomagnetica o al sorting cellulare attivato da fluorescenza è che è rapida, economica e evita l'etichettatura dei neutrofili con anticorpi, che potrebbe indurre l'attivazione dei neutrofili. A dimostrare la procedura sarà Muca Swami Us, un tecnico del mio laboratorio, dopo aver spruzzato un topo eutanasizzato con etanolo al 70%.

Eseguire un'incisione nella regione addominale mediale del tessuto cutaneo dell'animale, quindi rimuovere il tessuto cutaneo dalla parte distale dell'animale, comprese le estremità inferiori. Successivamente, utilizzare le forbici per tagliare i muscoli degli arti posteriori dell'animale e quindi dislocare con attenzione l'articolazione coxo-femorale dall'articolazione dell'anca, evitando di fratturare la testa del femore. Quindi utilizzare le forbici come bisturi per rimuovere il tessuto muscolare residuo da femore e tibia.

Separare le ossa delle zampe all'articolazione del ginocchio, avendo cura di non rompere le estremità delle ossa, quindi posizionare le ossa in una piastra di Petri contenente RPMI 1640 freddo su ghiaccio. Introdurre FBS e antibiotici. Trasferire la piastra in una cappa a flusso laminare e sterilizzare l'esterno di ciascun osso con etanolo al 70% in una nuova piastra di Petri.

Dopo circa 10-15 secondi, risciacquare l'etanolo dalla superficie di ciascun osso con tre lavaggi successivi in PBS sterile freddo di ghiaccio. Quindi tagliare e posizionare l'epifisi di ciascun osso in una nuova piastra di Petri sterile. Successivamente, applicare un ago da 25 gauge a una siringa da 12 cc riempita con 10 millilitri di RPMI.

Integrare con FBS ed EDTA. Quindi, lavare le cellule del midollo osseo da entrambe le estremità della diafisi di ciascuna coppia femore-tibia in un tubo Falcon da 50 millilitri con tappo a vite, filtrando attraverso un filtro da 100 micrometri per rimuovere tutte le cellule. Raschiare le superfici interne delle ossa con la punta dell'ago.

Quando le ossa appaiono sbiancate, le cellule sono state rimossi in modo sufficiente. Ora utilizzare un bisturi per tagliare le epifisi ossee in piccoli pezzi quadrati di 0,5-1 millimetro e quindi usare l'estremità posteriore di una pipetta da 2,5 millilitri con punta einor comb più BioPure per frantumarli attraverso un filtro da 100 micrometri. Dopo aver centrifugato le cellule raccolte per sette minuti a 427 ×g e a 4 gradi Celsius, lisare i globuli rossi in 20 millilitri di cloruro di sodio allo 0,2% per circa 20 secondi.

Quindi arrestare la lisi con 20 millilitri di cloruro di sodio allo 1,6%, centrifugare le cellule e successivamente risospendere il pellet in RPMI 1640 integrato con FBS ed EDTA. Contare le cellule e, dopo averle centrifugate nuovamente, risospendere il pellet lavato in non più di 100 × 10⁶ cellule per un millilitro di PBS sterile freddo. Ora distribuire tre millilitri di soluzione opaca 1119 a una temperatura di 18-26 °C in un tubo conico da 15 millilitri, quindi sovrapporre lentamente tre millilitri di soluzione opaca 1119 a una temperatura di 18-26 °C.

Il suo opaco 1 0 7 7. Evitare di mescolare le due densità immediatamente dopo aver preparato l'opaco; stratificare con attenzione la sospensione di cellule del midollo osseo sopra l'opaco 1 0 7 7, centrifugare il gradiente di densità per 30 minuti a 834 ×g e 25 °C senza frenata, quindi raccogliere i neutrofili all'interfaccia tra gli strati opaco 1 1 1 9 e 1 0 7 7. Dopo aver lavato i neutrofili raccolti due volte in RPMI 1 6 40 con FBS e antibiotici, risospendere le cellule a una concentrazione di 5 × 10⁶ cellule per millilitro in PBS preriscaldato a 37 °C.

Dopo aver contato le cellule, riservare un piccolo aliquota di ciascun campione sperimentale per determinare la purezza e la vitalità mediante citometria a flusso, quindi etichettare i neutrofili rimanenti con un colorante tracker cellulare a una concentrazione finale di cinque micromolari per 10 minuti a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua agitato al buio. Infine, lavare le cellule due volte con RPMI 1 6 4 0 freddo integrato con FBS e antibiotici per evitare contaminazione incrociata del colorante prima di mescolare le popolazioni di neutrofili diversamente etichettate per studi successivi di ripopolamento competitivo. In questo pannello vengono mostrati grafici rappresentativi di citometria a flusso di neutrofili isolati dal midollo osseo mediante separazione su gradiente di densità ottenuti da un topo C 57 black six non infetto. La selezione iniziale utilizzata per le cellule del midollo osseo raccolte dall'interfaccia tra histopaque 1 1 1 9 e histopaque 1 0 7 7.

Utilizzando la diffusione anteriore e laterale, si dimostra che i neutrofili separati mediante gradiente di densità sono puri per oltre il 90% e vitali per oltre il 95% per almeno quattro ore dopo il trasferimento adottivo con tracciante cellulare. I neutrofili marcati con DIA possono essere tracciati mediante citometria a flusso in diversi tessuti murini. Ad esempio, nel sangue, nel midollo osseo e nei reni del topo ricevente infetto da Candida, ceppo C57BL/6, mostrato in questo esperimento, selezionando le cellule vive CD45 Ly6G CD11b negative, questi neutrofili rappresentativi trasferiti adottivamente e marcati con CMTMR possono essere differenziati dai neutrofili nativi del topo ricevente, negativi per CMTMR e PE, grazie all'espressione di PE.

Una volta acquisita padronanza, l'isolamento e la marcatura dei neutrofili del midollo osseo del mouse può essere completato in tre ore.