Molecular Probes geneticamente codificati a studiare G recettori accoppiati alle proteine

L'obiettivo generale del seguente esperimento è introdurre una singola sonda informativa nei recettori accoppiati alle proteine G bersaglio, al fine di facilitare studi strutturali e dinamici dei complessi di segnalazione. Questo risultato si ottiene trasfettando le cellule con i plasmidi necessari per esprimere il macchinario traduzionale richiesto all'incorporazione dell'amminoacido non naturale zeto, fenilalanina, o zeto fee in un GPCR espresso. La variante GPCR contenente zeto fee può quindi essere utilizzata in tre modi diversi per indagare la struttura e la funzione del recettore.

Prima di tutto, il zeto fee viene utilizzato come crosslinker fotoattivabile nel GPCR, il che permette l'identificazione del sito di legame di un ligando triziato. Successivamente, il zeto fee può essere impiegato come gruppo chimico reattivo al fine di ancorare un peptide coniugato o una sonda fluorescente al GPCR mediante reazioni di marcatura bioortogonali. I risultati ottenuti dimostrano l'utilizzo del sonda molecolare zeto fee nel cross-linking fotoindotto mirato, nell'etichettatura mirata di epitopi e nella marcatura fluorescente dei GPCR, basati su metodi biochimici e su cellule vive. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'uso di ligandi fotoaffini o la marcatura dei gruppi tiolo delle cisteine, è la flessibilità di introdurre in modo sito-specifico un aminoacido non naturale biologicamente inerte e reattivo, la P-zeto fenilalanina, in una posizione nota all'interno di un recettore bersaglio.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della segnalazione dei recettori accoppiati a proteine G, inclusa la mappatura dei siti di interazione in un complesso recettore-LIG nell'ambiente nativo della membrana, e facilitare studi fluorescenti a singola molecola identificando posizioni nel recettore A-G-P-C-R adatte alla marcatura bioortogonale. In terzo luogo, questo metodo può fornire informazioni sui meccanismi molecolari dei recettori per proteine G ed è inoltre applicabile ad altri sistemi, come diverse proteine cellulari e di membrana. Prima di iniziare questo esperimento, coltivare le cellule HEC 2 9 3 T in mezzo essenziale modificato di Eagle di KO, integrato con il 10% di siero fetale bovino, a 37 gradi Celsius in un'atmosfera al 5% di CO2.

Trasfetta le cellule al 60-80% di confluenza in una piastra da 10 centimetri con G pcr, r CD, NA utilizzando il reagente lipectomy plus come descritto nel protocollo del testo. Il giorno successivo, sostituisci il mezzo di crescita con DMEM contenente il 10% di FBS e 0,5 millimolare di fee. A 48 ore dal trasfezione, analizza l'espressione come descritto nel testo.

Procedere alle procedure di fotoattivazione, cross-linking o etichettatura come descritte nel resto di questo video. A 48 ore dal transfezione, aspirare il mezzo dalle cellule e sostituirlo con quattro millilitri di PBS 1x (soluzione salina fosfato) e riportare a 37 gradi Celsius per 15 minuti in modo che le cellule si stacchino dalla piastra. Successivamente, risospendere le cellule in 1x PBS e trasferirle in un tubo Falcon; centrifugare a 1500 giri al minuto per due minuti.

Per pelletizzare le cellule, aspirare il sopranatante prima di risospendere il pellet cellulare in una soluzione salina tamponata di Hanks 1x contenente il ligando triziato a concentrazione di legame saturante, preparata come descritto nel protocollo testuale. Incubare il pellet a 37 gradi Celsius per il tempo necessario per garantire la formazione del complesso recettore-ligando, il quale dipende dal recettore e dal ligando specifici. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare in una piastra a 24 pozzetti o a 96 pozzetti.

Quindi attivare fotochimicamente il zeto fee utilizzando una lampada a ultravioletti a 365 nanometri per 15 minuti a 4 gradi Celsius, mantenendo la piastra sul ghiaccio per evitare il riscaldamento del campione e la lisi cellulare. Dopo l'attivazione fotochimica, trasferire le cellule in un tubo einor e centrifugare per formare il pellet cellulare a seguito della centrifugazione. Rimuovere il soprannatante e procedere all'analisi.

Risospendere il pellet cellulare nel buffer di lisi e incubare le cellule per un'ora a quattro gradi Celsius. Successivamente, centrifugare il lisato cellulare per 10 minuti a 16.000 ×g. Prima di trasferire il sopranatante in un nuovo tubo, aggiungere l'anticorpo monoclonale 1D quattro modificato SROs due B resin al sopranatante e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius per immunopurificare il GPCR mediante l'epitopo dell'anticorpo monoclonale 1D quattro presente nel C-terminale ingegnerizzato. Il giorno successivo, lavare le perle diverse volte con il buffer di lisi. Eluire i campioni con SDS 1% a 37 gradi Celsius per un'ora sotto agitazione.

Trasferire una porzione dell'EENT in una provetta da 15 millilitri contenente liquido scintillante e contare su un contatore a scintillazione beta per quantificare la quantità di legame specifico del ligando triziato al recettore. Risolvere l'EENT purificato rimanente mediante elettroforesi su gel standard utilizzando un gel SDS al 4-12% con scala molecolare proteica standard. Successivamente, effettuare il trasferimento semisecco su membrana A-P-V-D-F per l'immunoblotting.

Bloccare la membrana in PVDF con il 5% di latte nel buffer TBS contenente lo 0,05% di Tween 20. Sondare la membrana per confermare l'espressione del recettore di lunghezza completa utilizzando l'anticorpo monoclonale 1D four, seguito dall'anticorpo secondario anti-US IgG coniugato con HRP. Trattare quindi la membrana con il reagente di chemiluminescenza potenziata.

Esponi la membrana a una pellicola di autoradiografia per visualizzare le bande. Successivamente, taglia la membrana con una lametta per separare ogni corsia del campione e quindi effettua ulteriori tagli in corrispondenza dei marcatori specifici di peso molecolare. Trasferisci i segmenti della membrana in vial contenenti liquido scintillante e quindi quantifica la quantità di trizio in ciascun segmento della membrana mediante conteggio su un contatore scintillometrico beta.

Identificare il legame foto-cross positivo mediante la rilevazione di trizio alla massa molecolare apparente pari alla somma del recettore accoppiato alla proteina G (GPCR) e del ligando. Dopo il lavaggio e il conteggio delle cellule, trattare in anticipo una piastra da 96 pozzetti con fondo trasparente ad alto legame aggiungendo 100 microlitri di 10 microgrammi per millilitro di poli-D-lisina per pozzetto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.

Quindi lavare ripetutamente con un XPBS prima di lasciare asciugare all'aria la piastra, seminando le cellule trasfettate in 200 microlitri a una densità di 60.000-80.000 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti e riportare a 37 gradi Celsius in un'atmosfera con 5%CO2. Il giorno successivo.

Preparare le cellule per l'etichettatura. Lavare delicatamente le cellule tre volte con 100 microlitri per pozzetto utilizzando un XPBS per rimuovere qualsiasi mezzo di crescita contenente zeto fee. Preparare un buffer contenente da 50 a 200 micromolare di reagente di etichettatura flag Tri AAL PHOSPHINE come descritto nel protocollo testuale.

Applicare 60 microlitri in ciascun pozzetto. Mantenere un set di pozzetti senza trattamento con marcatura e con tampone. Includere anche un controllo del GPCR di tipo selvaggio per confrontarlo con una varianza del GPCR a dieta zero.

Riposizionare la piastra a 37 gradi Celsius tra 30 minuti e quattro ore dopo l'incubazione. Lavare le cellule tre volte con 100 microlitri per pozzetto di buffer bloccante per rimuovere completamente l'etichetta non reattiva. Successivamente, aggiungere 100 microlitri per pozzetto di paraformaldeide al 4% alle cellule dopo un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente.

Lavare le cellule tre volte con il buffer di blocco. Eseguire un protocollo standard di EISA per la superficie cellulare per rilevare il recettore marcato e l'espressione del recettore, incubando prima con l'anticorpo primario per 1,5 ore sul ghiaccio. Successivamente, effettuare un'incubazione con l'anticorpo secondario a temperatura ambiente per un'ora.

Successivamente, aggiungere 100 microlitri di anticorpo secondario Anti-Flag M due diluito per rilevare l'epitopo peptidico flag del reagente di marcatura Tri AAL fosfina. Usare anche pozzetti non marcati come controllo negativo.

Quindi aggiungere l'anticorpo anti-CCR5 2D7 diluito in set separati di pozzetti per determinare l'espressione wild type o zeto fee. dell'espressione sulla superficie cellulare dei GPCR. Lavare le cellule tre volte con il buffer di blocco e incubare con 100 microlitri di anticorpo secondario anti-IgG di US coniugato con HRP diluito.

Dopo aver accuratamente lavato le cellule cinque volte con il buffer di blocco, aggiungere 50 microlitri di buffer di rilevamento e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Infine, raccogliere i dati spettrali su un lettore di piastre multipozzetto a fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 530 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 590 nanometri. Iniziare la procedura di marcatura lisando 10 milioni di cellule raccolte che esprimono il tipo selvatico o zeto fee.

Variare l'opsina dei bastoncelli in un millilitro di tampone di solubilizzazione per un'ora a quattro gradi Celsius. Raccogliere la frazione surnatante dopo la centrifugazione del lisato cellulare a 15.000 ×g per 10 minuti. Quindi aggiungere 100 microlitri di anticorpo monoclonale 1D4 legato alla resina Spheros 2B per catturare il recettore mediante l'epitopo 1D4 ingegnerizzato al termine C.

Dopo un'incubazione di 12 ore a quattro gradi Celsius, lavare la resina tre volte come descritto nel protocollo di testo. Successivamente, etichettare il recettore immobilizzato sulla matrice di affinità immunitaria aggiungendo 0,1 millimolare di fosfina marcata con fluorescina a un volume totale di 0,3-0,5 millilitri, incubare per 12 ore a temperatura ambiente prima di centrifugare, dopo aver rimosso il surnatante. Lavare la resina per rimuovere qualsiasi etichetta non reattiva ed eluire il recettore marcato con 100 microlitri di buffer Elian mediante incubazione sul ghiaccio per un'ora.

Risolvere i campioni marcati mediante elettroforesi SDS-PAGE in condizioni riducenti. Lavare brevemente i gel in PBS prima dell'etichettatura di un zeto fee. GPCR mediante fluorescenza Ingel utilizzando uno scanner a fluorescenza confocale con un laser a lunghezza d'onda di 488 nanometri per rilevare il recettore modificato con fluoresceina.

È stata utilizzata la metodologia di mutagenesi con aminoacidi non naturali per introdurre in modo specifico sonde molecolari nel sito C dell'A-G-P-C-R, mediante la tecnologia di soppressione del codone ambra. La tecnica di cross-linking fotoindotto può quindi essere utilizzata per studiare gli aspetti strutturali dei complessi ligando-GPCR in cellule vive, impiegando un ligando di piccola molecola marcato radioattivamente con trizio. Ravi Rock è stato utilizzato per identificare il suo sito di legame sul G-P-C-R-C-C-R cinque.

In questo esempio, l'irradiazione UV su cellule che esprimono zeto fee. CCR cinque varianza pre-incubate con Ravi triziato. Rock determina la formazione di complessi legati covalentemente, identificabili mediante il marcatore radioattivo sensibile presente sul ligando.

Tra le diverse posizioni del CCR5, la lucina 28 zeto fee e il triptofano 86 zeto fee si sono dimostrati in grado di fotoincrociare con Ravi Rock triziato, come mostrato da conteggi di scintillazione significativamente più elevati. Il recettore di tipo selvaggio non ha mostrato alcun incrocio con il ligando radioattivo. Le chimiche di marcatura bioortogonali possono essere utilizzate per modificare in modo specifico il sito C di una zeto fee.

Una strategia per la varianza dei recettori accoppiati a proteine G prevede l'etichettatura mirata di A-G-P-C-R in cellule vive mediante un'etichetta peptidica coniugata al peptide flag. Il reagente di marcatura Tri AAL PHOSPHINE viene utilizzato per modificare in modo specifico e selettivo uno zeto fee. La varianza di CCR5 mostrata qui rappresenta dati ottenuti da una strategia di rilevamento EISA sensibile e multistep, impiegata per identificare le posizioni marcate con il peptide flag.

Tra le posizioni analizzate sul CCR5, tutti i ceppi zeto hanno mostrato attività. Le varianti del CCR5 sono state espresse sulla superficie cellulare e circa la metà di esse ha subito con successo il marcatore specifico dell'epitopo; il CCR5 di tipo selvaggio è stato utilizzato come controllo negativo per il marcatore dell'epitopo, mostrando l'assenza del segnale anti-Flag. In un approccio alternativo, i recettori accoppiati alla proteina G di ceppi zeto solubilizzati con detergente sono stati immobilizzati su una matrice di affinità immunitaria, come l'anticorpo monoclonale anti-1D4 coniugato alla resina Spheros 2B, e successivamente marcati con un etichetta fluorescente coniugata.

L'immagine di fluorescenza Ingel dimostra l'etichettatura fluorescente riuscita dell'opsina GPCR in tre posizioni diverse, come previsto; l'opsina di tipo selvaggio non ha mostrato alcuna etichettatura di fondo, come indicato dall'assenza di una banda fluorescente al peso molecolare atteso del recettore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di confermare l'espressione completa della lente del GPCR bersaglio mediante un set specifico di acido introdotto AOL Alanina. Dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo della biologia dei recettori per esplorare qualsiasi complesso recettore-ligando o etichettare un recettore bersaglio. Utilizzando l'amminoacido non naturale, p-zeto fenolo alanina, introdotto in un sito specifico come sonda reattiva. Dopo aver visto questo video, si dovrà avere una buona comprensione di come utilizzare la neogenesi di amminoacidi non naturali per inserire una sonda molecolare in un A-G-P-C-R, facilitando studi strutturali e dinamici dei complessi di segnalazione dei GPCR mediante tecniche di foto-crosslinking mirato ed etichettatura bioortogonale.