Molecular Probes geneticamente codificati a studiare G recettori accoppiati alle proteine

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di introdurre una singola sonda informativa nei recettori accoppiati a proteine G bersaglio per facilitare gli studi strutturali e dinamici dei complessi di segnalazione. Ciò si ottiene sezionando le cellule con i plasmidi necessari per esprimere il macchinario traslazionale richiesto per incorporare l'amminoacido innaturale zeto, fenilalanina o zeto fee in un GPCR espresso. La varianza della tariffa zeto GPCR può quindi essere applicata in tre modi diversi per studiare la struttura e la funzione del recettore.

In primo luogo, la tassa zeto viene utilizzata come reticolante fotoattivo nel GPCR, che consente l'identificazione del sito di legame di un ligando triziato. Successivamente, la tassa zeto può essere utilizzata come maniglia chimica reattiva per attaccare una sonda peptidica coniugata o fluorescente sul GPCR tramite chimica di marcatura bioortogonale Si ottengono risultati che mostrano l'uso della tassa zeto della sonda molecolare nella reticolazione fotografica mirata, nella marcatura mirata degli epitopi e nella marcatura fluorescente di GPCR basati su cellule vive e metodi biochimici. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'uso di ligandi di fotoaffinità o la marcatura della cisteina, è la flessibilità di introdurre in modo specifico un amminoacido innaturale biologicamente inerte e reattivo P zeto fenolo alanina in una posizione nota in un recettore bersaglio.