Name: Molecular Probes geneticamente codificati a studiare G recettori accoppiati alle proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-13T16:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 16 s
Description: Scopri come introdurre sonde molecolari nei recettori accoppiati a proteine G utilizzando l'aminoacido non naturale p-azido-L-fenilalanina. Questo metodo consente foto-reticolazione e marcatura bioortogonale per studi strutturali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ringraziamo il generoso sostegno di numerose fondazioni e filantropi (vedi SakmarLab.org).

1. Site-specific Costituzione genetica di Innaturale Aminoacidi in GPCR <ol><li> Mantenere HEK293T cellule in DMEM (4,5 g / L di glucosio, glutammina 2 mM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) a 37 ° C in una atmosfera di CO 2 5%. </li><li> Trasfezione delle cellule cresciute al 60-80% di confluenza in una piastra da 10 cm usando Lipofectamine Plus. reagente. <ol><li> A 750 microlitri DMEM, aggiungere 10 microlitri Plus. reagente, 3,5 pg di GPCR cDNA (pMT4. Rho o pcDNA 3.1. CCR5) contenenti l&#39;ambra codone di stop in una posizione desiderata, 3,5 pg di tRNA soppressore cDNA (pSVB.Yam) e 0,35 mg di mutante amino-acil tRNA sintetasi cDNA per p-azido-L-fenilalanina (pcDNA.RS). Incubare a temperatura ambiente per 15 min. Effettuare anche una trasfezione simile usando l&#39;wt GPCR cDNA (non contenente un codone di stop ambra) per servire come controllo. Aggiungi questa miscela a 750 ml di DMEM con 17 microlitri Lipofectamine. Dopo equilibrazione 15 minuti a temperatura ambiente, portare lavolume totale di 4 ml. </li><li> Aspirare il terreno di 10 cm piastra, si applicano miscela di trasfezione per le cellule, e tornare a 37 ° C in 5% di CO 2 nell&#39;atmosfera. Dopo 4-6 ore, integrare le celle con 4 ml di DMEM contenente 20% FBS e 1 AZF mm. </li></ol></li><li> Il giorno seguente, sostituire i mezzi di crescita con DMEM contenente 10% FBS e azf 0,5 mM. </li><li> Celle di raccolta 48 ore dopo la trasfezione, per analizzare l&#39;espressione o procedere procedure photocrosslinking o etichettatura descritti nelle sezioni seguenti. <ol><li> Confermare espressione del mutante ambra GPCR in presenza della SAU nel mezzo di crescita. Facciamo questo rilevamento immunoblot occidentale. Lyse il pellet cellulare in 1% (w / v) dodecil-β-D-maltoside (DDM) in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 100 mM per 1 ora a 4 ° C. Centrifugare il lisato a 16.000 xg e risolvere il supernatante in condizioni riducenti mediante SDS-PAGE. Trasferimento a una membrana PVDF e effettuare analisi immunoblot per rilevare l&#39;espressione del recettore full-length usando the 1D4 mAb (Cell Nazionale Culture Center), che riconosce un epitopo ingegnerizzato al C-terminale del recettore. 31 </li></ol></li></ol> 2. Mappatura di rilegatura sito Ligand Uso mirata Photocrosslinking <ol><li> 48 ore dopo la trasfezione, mezzi di aspirare da cellule e sostituirlo con 4 ml di 1x tampone fosfato (PBS). Rientro a 37 ° C per 15 min. </li><li> Risospendere le cellule con PBS 1x e trasferire in una provetta Falcon. Centrifugare a 1500 rpm per 2 minuti per far sedimentare le cellule e aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in soluzione salina tamponata di Hank 1x contenente HEPES 20 mM, pH 7,5, 0,2% BSA e il ligando triziato a concentrazioni saturanti vincolante per il periodo di tempo e la temperatura richiesta per garantire recettore-ligando formazione del complesso. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in una piastra a 24 pozzetti o 96 pozzetti per fotoattivazione del AZF a 365 nm (per esempio utilizzare un lampada UV-A) per 15 min a 4 ° C. Manten la piastra sul ghiaccio per evitare il riscaldamento del campione e lisi cellulare. </li><li> Trasferire le cellule in una provetta Eppendorf, centrifugare per agglomerare le cellule, rimuovere il supernatante e procedere all&#39;analisi. I pellet possono essere conservati a -20 ° C per un uso futuro. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in tampone di lisi contenente 1% (w / v) DDM, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 e inibitori della proteasi. Dopo 1 ora di incubazione a 4 ° C, centrifugare il lisato cellulare per 10 minuti a 16.000 xg, e trasferire il surnatante in una nuova provetta. </li><li> Aggiungere 1D4 mAb-Sepharose resina 2B al supernatante e incubare una notte a 4 ° C per immunopurify GRCP usando l&#39;ingegnerizzato C-terminale 1D4 mAb epitopo. Il giorno dopo lavare le perline più volte con tampone di lisi. Campioni Eluire con 1% SDS a 37 ° C per 1 ora con agitazione. </li><li> Trasferire una porzione dell&#39;eluente in una fiala contenente 15 ml di liquido di scintillazione e contare su un contatore a scintillazione beta per quantificare la quantità di legame specifico del ligando triziato al secoloe recettore. </li><li> Risolvere il restante 1D4 mAb eluente purificato mediante elettroforesi su gel standard. Utilizziamo un 4-12% SDS-PAGE gel e poi trasferimento semi-dry ad una membrana di PVDF per immunoblotting. Abbiamo anche una corsia con scaletta proteine ​​standard per guidare l&#39;approssimazione visiva di peso molecolare. <ol><li> Bloccare la membrana PVDF con 5% di latte in tampone TBS contenente 0,05% Tween-20. Sondare la membrana per confermare l&#39;espressione del recettore full-length con 1D4 mAb seguito da anticorpo secondario anti-topo IgG HRP-coniugato. </li><li> Trattare con chemiluminescenza (ECL) Reattivo ed esporre membrana per autoradiografia pellicola per visualizzare bande. </li></ol></li><li> Tagliare la membrana con una lama di rasoio di separare ogni corsia campione e quindi tagliato a specifici marcatori di peso molecolare. Trasferimento segmenti di membrana di flaconi contenenti liquido di scintillazione. Quantificare la quantità di trizio in ogni segmento membrana contando su un contatore beta-scintillazione. </li><li> Identificare il positivophotocrosslink con il rilevamento di trizio alla massa molecolare apparente pari alla somma di quella del GPCR e il ligando. </li></ol> 3. Mirata epitopi Tagging e Cell Surface immunoenzimatico Assay (ELISA) <ol><li> 24 ore dopo la trasfezione, lavare le cellule con 1 ml di PBS 1X e trypsinize con 1 ml 0,25% tripsina per 3 min. Integrare con 9 ml DMEM contenente 10% FBS e AZF 0,5 mm. Risospendere le cellule e contare la densità cellulare. Usiamo un emocitometro standard. </li><li> Pre-trattare una, chiara-bottom piastra a 96 pozzetti alto legame con 100 ml di 0,01 mg / ml poli-D-lisina per pozzetto. Incubare per 30 minuti alla temperatura ambiente, lavate ripetutamente con PBS 1x e aria secca. </li><li> Piastra 200 ml di cellule trasfettate con una densità di 6 x ottobre 04-08 x 10 4 cellule / pozzetto di piastra a 96 pozzetti e ritorno a 37 ° C in 5% CO 2 nell&#39;atmosfera. </li><li> Il giorno dopo preparare le cellule per l&#39;etichettatura. Lavare delicatamente tre volte con 100 microlitri / pozzetto 1x PBS to rimuovere AZF contenente terreno di coltura. Assicurarsi che le cellule rimangono attaccati, per esempio, utilizzando PBS contenente Ca 2 + e Mg 2 +. </li><li> Preparare 50-200 micron FLAG-triarylphosphine etichettatura reagente in 1x HBSS / PBS da uno stock mantenuto a 5-20 mM in PBS. Applicare 60 ml in ciascun pozzetto (in triplicato per ogni mutante ambra) e ritorno a 37 ° C per 30 min a 4 ore. Mantenere una serie di pozzi senza trattamento etichetta in 1x HBSS / PBS. Anche un controllo peso GPCR confrontare con varianti AZF-GPCR. </li><li> Lavare le cellule 3 volte con 100 microlitri / pozzetto di tampone di bloccaggio, BB (1x PBS, 0.5% BSA), per rimuovere completamente l&#39;etichetta che non ha reagito. </li><li> Applicare 100 microlitri / pozzetto del 4% paraformaldeide (preparato da uno stock di 16% in PBS 1x) alle cellule. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare tre volte con BB. </li><li> Eseguire protocollo ELISA superficie cellulare standard per rilevare recettore etichettati e l&#39;espressione del recettore. Incubare con anticorpo primario per 1,5 ore su ghiaccio seguita da una secondariatibody incubazione a temperatura ambiente per 1 ora. <ol><li> Aggiungere 100 ml di anticorpi anti-FLAG M2 (es. 1:2.000 diluizione di anticorpo fatto in BB) per rilevare FLAG peptide epitopo di etichettatura reagente FLAG-triarylphosphine. Sondare anche non-label pozzetti trattati come controllo negativo. Aggiungi anti-CCR5 2D7 (usiamo una diluizione 1:500) anticorpo ad una serie separata di pozzi per determinare in peso o superficie cellulare espressione AZF-GPCR. </li><li> Lavare le cellule tre volte con BB, e incubare con 100 ml di HRP-coniugato anticorpo secondario anti-topo IgG (1:2.000 diluizione). </li><li> Lavare accuratamente le cellule cinque volte con BB. Aggiungere rilevamento buffer 50 microlitri: Amplex Rosso, 20 mM H 2 O 2, 1x PBS (1:10:90 ratio) e incubare per 15 min a temperatura ambiente. Raccogliere dati spettrali su un lettore di fluorescenza piatto multi-bene a λ ex = 530 e λ em = 590. </li></ol></li></ol> 4. Bioorthogonal Etichettatura fluorescente di un GPCR <ol><li> Lyse10 7 cellule raccolte esprimono wt o AZF-Rhodopsin varianti in 1 ml di tampone di solubilizzazione contenente 1% (w / v) DM, HEPES 50 mM o Tris-HCl, pH 6,8, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl 2 e inibitori della proteasi per 1 ore a 4 ° C. Centrifugare il lisato cellulare a 15.000 xg per 10 minuti e raccogliere il surnatante. </li><li> Aggiungere 100 microlitri 1D4-mAb resina sepharose 2B per catturare recettore usando l&#39;ingegneria C terminus 1D4 epitopo. Incubare per 12 ore a 4 ° C. Lavare la resina tre volte con 0,1% (w / v) DDM in 0,1 M tampone fosfato di sodio, pH 7,3. </li><li> Aggiungere 0,1 mM fluoresceina-fosfina in un volume totale di 0,3 - 0,5 etichettare recettore immobilizzato sulla matrice immunoaffinità (1D4-mAb sefarosio 2B). Incubare per 12 ore a temperatura ambiente. Centrifuga e si preleva il surnatante. Lavare la resina per rimuovere etichetta non reagito. </li><li> Eluire il recettore marcato con tampone di eluizione 100 ml contenente 0,1% (w / v) DDM e 0,33 mg / ml nonapeptide (C9 peptide contro l&#39;epitopo 1D4)in 2 mM tampone fosfato, pH 6,0 mediante incubazione in ghiaccio per 1 ora. </li><li> Risolvere campioni etichettati mediante SDS-PAGE in condizioni riducenti. Lavare gel brevemente in PBS e quindi visualizzare l&#39;etichettatura di AZF-GPCR da in-gel fluorescenza. Ad esempio, utilizzare uno scanner a fluorescenza confocale con un laser di lunghezza d&#39;onda 488 nm per rilevare recettore modificato con fluoresceina. </li></ol>

<ol><li>Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+ligand+binding+and+specificity+in+adrenergic+receptors%3A+Implications+for+GPCR-targeted+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery.</a> Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).</li>
<li>Steyaert, J., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody+stabilization+of+G+protein-coupled+receptor+conformational+states%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states.</a> Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).</li>
<li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+CXCR4+chemokine+GPCR+with+small-molecule+and+cyclic+peptide+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists.</a> Science. 330, 1066-1071 (2010).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+beta2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+eukaryotic+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded eukaryotic genetic code.</a> Science. 301, 964-967 (2003).</li>
<li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+incorporation+of+keto+amino+acids+into+functional+G+protein-coupled+receptors+using+unnatural+amino+acid+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis.</a> The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).</li>
<li>Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTIR+analysis+of+GPCR+activation+using+azido+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">FTIR analysis of GPCR activation using azido probes.</a> Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).</li>
<li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+G-protein-coupled+receptor+activation+using+genetically+encoded+infrared+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes.</a> Nature. 464, 1386-1389 (2010).</li>
<li>Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photolysis+of+diazoacetylchymotrypsin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The photolysis of diazoacetylchymotrypsin.</a> The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).</li>
<li>Nakayama, T. A., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+retinal+in+bovine+rhodopsin+determined+by+cross-linking+using+a+photoactivatable+analog+of+11-cis-retinal%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal.</a> The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).</li>
<li>Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+glucagon-like+peptide+1+docking+to+its+intact+receptor+studied+with+carboxyl-terminal+photolabile+probes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes.</a> The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).</li>
<li>Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+retinal+in+bacteriorhodopsin+as+studied+by+cross-linking+using+a+photosensitive+analog+of+retinal%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal.</a> The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).</li>
<li>Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+fluorescent+and+photoactivatable+MIP-1alpha+ligands+and+interactions+with+chemokine+receptors+CCR1+and+CCR5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5.</a> Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).</li>
<li>Janz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+between+an+allosteric+agonist+pepducin+and+the+chemokine+receptor+CXCR4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).</li>
<li>Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+a+photocrosslinking+amino+acid+to+the+genetic+code+of+Escherichiacoli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).</li>
<li>Hino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+photo-cross-linking+in+mammalian+cells+by+site-specific+incorporation+of+a+photoreactive+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid.</a> Nature. 2, 201-206 (2005).</li>
<li>Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+ligand-binding+site+on+a+G+protein-coupled+receptor+%28GPCR%29+using+genetically+encoded+photocrosslinkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers.</a> Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).</li>
<li>Grunbeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+photo-cross-linkers+map+the+binding+site+of+an+allosteric+drug+on+a+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor.</a> ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).</li>
<li>Dunham, T. D., Farrens, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+rhodopsin.+Movement+of+helix+f+detected+by+site-specific+chemical+labeling+and+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).</li>
<li>Maurel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+protein-protein+interaction+analysis+with+time-resolved+FRET+and+snap-tag+technologies%3A+application+to+GPCR+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization.</a> Nature. 5, 561-567 (2008).</li>
<li>Huber, T., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escaping+the+flatlands%3A+new+approaches+for+studying+the+dynamic+assembly+and+activation+of+GPCR+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+pharmacological+sciences%22%5BJournal%5D)">Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes.</a> Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).</li>
<li>Saxon, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+engineering+by+a+modified+Staudinger+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.</a> Science. 287, 2007-2010 (2000).</li>
<li>Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+azides+into+recombinant+proteins+for+chemoselective+modification+by+the+Staudinger+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).</li>
<li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strain-promoted+%5B3+%2B+2%5D+azide-alkyne+cycloaddition+for+covalent+modification+of+biomolecules+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems.</a> Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).</li>
<li>Kolb, H. C., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+impact+of+click+chemistry+on+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+discovery+today%22%5BJournal%5D)">The growing impact of click chemistry on drug discovery.</a> Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).</li>
<li>Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Model+for+the+G-Protein-Coupled+Receptor+Rhodopsin%3A+Hydrophobic+Interface+and+Dynamical+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure.</a> Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).</li>
<li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+conformation+and+its+environment+in+rhodopsin+in+light+of+a+new+2.2+%C3%85+crystal+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure.</a> J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).</li>
<li>Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+labeling+of+functional+G+protein-coupled+receptors+at+genetically+encoded+azido+groups%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups.</a> , submitted (2013).</li>
<li>Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+epitope+tagging+of+GPCRs+by+bioorthogonal+modification+of+a+genetically-encoded+unnatural+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid.</a> Biochemistry. , (2013).</li>
<li>Molday, R. S., MacKenzie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+rhodopsin%3A+characterization%2C+cross-reactivity%2C+and+application+as+structural+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes.</a> Biochemistry. 22, 653-660 (1983).</li>
<li>Gether, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonists+induce+conformational+changes+in+transmembrane+domains+III+and+VI+of+the+beta2+adrenoceptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor.</a> The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).</li>
<li>Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+structure%2C+dynamics%2C+and+activation%3A+A+perspective+from+crystallography%2C+site-directed+spin+labeling%2C+sulfhydryl+reactivity%2C+and+disulfide+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Chemistry%3B+Membrane+Proteins%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking.</a> Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).</li>
<li>Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+contact+sites+in+complex+formation+between+transducin+and+light-activated+rhodopsin+by+covalent+crosslinking%3A+use+of+a+photoactivatable+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).</li>
<li>Dorman, G., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzophenone+photophores+in+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Benzophenone photophores in biochemistry.</a> Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+the+site-specific+modification+of+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo.</a> Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).</li>
<li>Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleophilic+catalysis+of+oxime+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Nucleophilic catalysis of oxime ligation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).</li>
<li>Yanagisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+engineering+of+pyrrolysyl-tRNA+synthetase+to+genetically+encode+N%28epsilon%29-%28o-azidobenzyloxycarbonyl%29+lysine+for+site-specific+protein+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+biology%22%5BJournal%5D)">Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification.</a> Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Descriviamo qui una solida metodologia per site-specific inserimento di una sonda reattiva, AZF, in GPCR e dimostriamo tre applicazioni utili di questo strumento per studiare la struttura e la dinamica dei GPCR. Il nostro metodo al sito-specifico incorporano UAAs elude un problema fondamentale con una strategia alternativa basata sulla etichettatura chimicamente 32, 33 o allegando photocrosslinkers 34 per una singola cisteina mutante accessibile. Sebbene, chimiche che colpiscono gruppi tiolo della ...

Recettori accoppiati alla proteina G (GPCR Heptahelical) comprendono una superfamiglia di proteine ​​di membrana altamente dinamici che mediano i segnali extracellulari importanti e diverse. Nel paradigma classico, l&#39;attivazione del recettore è accoppiato con i cambiamenti conformazionali ligando-indotta. 1, 2 recenti progressi nel campo della biologia strutturale di GPCR hanno fornito informazioni significative sui meccanismi molecolari della segnalazione transmembrana. 3-5 Tuttavia, per comprendere con maggiore precisione chimica meccanismo funzionale e dinamica strutturale della segnalazione GPCR, un toolkit di approcci sono necessari per incorporare sonde molecolari e chimiche informativi per interrogare complessi di segnalazione attiva. A tal fine, abbiamo adattato un metodo per sito-specifico di introdurre non o poco sonde perturbanti nella recettori espressi sulla base di aminoacidi innaturale (SAU) mutagenesi con ambra codone tecnologia di soppressione precedentemente introdotta da Schultz ecoworkers. 6 Abbiamo ottimizzato la metodologia mutagenesi SAU per ottenere una espressione ad alto rendimento e sistema di mutagenesi per proteine ​​come GPCR, che sono difficili da esprimere in sistemi eterologhi più diversi dalle cellule di mammifero. L&#39;utilizzo di un silenziatore costruito ortogonale tRNA e si è evoluta-tRNA sintetasi pair per una specifica SAU, noi del sito specificamente introdotto UAAs in GPCR bersaglio espresse. L&#39;incorporazione di successo UAAs, p-acetil-L-fenilalanina (ACF), p-benzoil-L-fenilalanina (BZF), e p-azido-L-fenilalanina (AZF) è stata dimostrata nei nostri GPCR modello - rodopsina e umana recettore CC chemochine, CCR5. 7, 8 In linea di principio, una SAU può essere geneticamente codificato in qualsiasi posizione all&#39;interno della sequenza della proteina e questa proprietà è uno strumento biochimico prezioso in quanto consente la scansione singolo codone di un GPCR bersaglio. Ci concentriamo qui in particolare sulla versatilità della SAU, AZF, che ha una azi reattivafare parte. Oltre a servire come infrarossi (IR) sonda unico, 8, 9 AZF può anche servire come un photoactivatable reticolante per reazione con ammine primarie vicini o idrogeni alifatici. Inoltre, il gruppo azido biologicamente inerte può partecipare come un manico chimica selettiva nelle reazioni di etichettatura bioorthogonal. Qui vi presentiamo esempi che illustrano le applicazioni utili del sito-specifica incorporazione di AZF in GPCR, come photocrosslinking mirato ad intrappolare un complesso recettore-ligando, e la modifica dei GPCR da bioorthogonal codifica epitopo e le strategie in materia di etichettatura fluorescenti. Photoactivatable reagenti sono stati utilizzati per studiare i sistemi biologici dal 1960. 10 In questo periodo, l&#39;abbondanza di esperimenti reticolazione recettore-ligando sono stati segnalati per studiare complessi GPCR, la maggior parte dei quali ha coinvolto l&#39;uso di leganti fotoaffinità. 11, 12 Tuttavia, questi applicazioni sono tecnicamente limitati, in quanto Require sintesi di leganti recanti un gruppo reticolante. 13-15 Inoltre, con la frazione di reticolante nel ligando, è impegnativo per identificare la posizione della reticolazione sul GPCR. Sito-specifico introducendo photocrosslinking gruppi come UAAs in proteine ​​utilizzando la tecnologia di soppressione ambra codone è un avanzamento importante. 16, 17 Abbiamo sviluppato una tecnica photocrosslinking per identificare l&#39;interfaccia di legame su un recettore che è coinvolto nella formazione di un complesso recettore-ligando in cellule vive introducendo gruppi fotolabili in GPCR. 18, 19 Qui si descrive il protocollo sperimentale e metodo di analisi dei dati per applicare questa tecnologia photocrosslinking mirato per identificare il sito di legame di un ligando piccola molecola, maraviroc triziata, su CCR5. Questo metodo sfrutta la quantificazione precisa del manico sul ligando radioattivo, oltre ad avere la struttura chimica nativa del ligando. Tecniche basate fluorescenza supportano la precisa comprensione della base strutturale del recettore sondando direttamente lo stato conformazionale del recettore. 20, 21 Tuttavia, le tecniche che hanno la flessibilità necessaria per introdurre etichette fluorescenti in GPCR sito-specifica sono limitati. Siamo interessati a impiegare strategie di modificazione chimica bioorthogonal per facilitare l&#39;individuazione singola molecola (SMD) di complessi di segnalazione GPCR. 22 Il gruppo azido può partecipare a chimiche bioorthogonal come Staudinger-Bertozzi legatura, 23, 24 strain-promosso azide-senza rame cicloaddizione alkyne (SpAAC) 25 e azide-alchino cicloaddizione rame-catalizzato (CuAAC) 26. Ci concentriamo qui sulla reazione legatura Staudinger-Bertozzi che coinvolge la reazione specifica tra un azide e fosfina. Abbiamo dimostrato l&#39;utilizzo di due differenti derivati ​​fosfina, coniugati ad un epitopo peptide (peptide FLAG) o un&#39;etichetta fluorescente(Fluoresceina) per raggiungere sito-specifica modifica del GPCR. Abbiamo già ottimizzato le condizioni per l&#39;etichettatura sito-specifica della rodopsina varianti AZF utilizzando la struttura cristallina ai raggi X e simulazioni dinamiche di scegliere siti di destinazione che sono solventi esposte. 27, 28 Abbiamo anche illustrato la possibilità di conseguire l&#39;etichettatura libero-background da Staudinger- Bertozzi legatura. 29 dimostriamo qui la procedura generale impiegato per raggiungere marcatura fluorescente di un recettore detergente-solubilizzato che viene immobilizzato su una matrice immunoaffinità e seguito evidenziata in-gel fluorescenza. Inoltre, abbiamo dimostrato un utile estensione di questa strategia di etichettatura per identificare le posizioni suscettibili di etichettatura su un recettore di struttura sconosciuta, CCR5. Questo avviene tramite una mirata strategia di codifica-peptide epitopo che si basa sulla modificazione bioorthogonal di AZF-GPCR varianti in un formato semi-high throughput base cellulare. 30 Questometodo sfrutta le proprietà di rilevamento multi-step di un ELISA superficie cellulare per monitorare gli eventi di etichettatura. Le metodologie di cui parliamo qui sono generali e in linea di principio può essere applicato a qualsiasi GPCR incorporata con AZF usando l&#39;ambra codone tecnologia di soppressione. Nei protocolli qui presentati dettaglio i passi necessari per l&#39;espressione cellulare di mammifero di recettori incorporato con UAAs come AZF utilizzando il metodo di mutagenesi amminoacido non naturale e successive applicazioni di facilitare studi strutturali e dinamiche di GPCR.

<table><tbody><tr><td>Plasmide pSVB. Yam</td><td></td><td></td><td>(Ye et al., 2008)</td></tr><tr><td>Plasmid pcDNA.RS for azF</td><td></td><td></td><td>(Ye et al., 2009)</td></tr><tr><td>Plasmidi pMT4.Rho e pcDNA 3.1.CCR5</td><td></td><td></td><td>Opzionalmente contengono il codone di stop ambrato (TAG) nella posizione desiderata</td></tr><tr><td>Cellule</td><td></td><td></td> HEK 293T <td>Cellule aderenti</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>Codice 10566</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Siero Fetale Bovino</td><td>Gemini Bio-prodotti</td><td>100-106</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamina Plus</td><td>Invitrogen</td><td>Lipofectamina: 18324-012 Plus: 11514-015</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p-azido-L-fenilalanina</td><td>Chem-Impex International</td><td>6162</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabella 1. Incorporazione genetica sito-specifica di amminoacidi innaturali nei materiali GPCRs</td></tr><tr><td>Maxima ML-3500S Lampada UV-A</td><td>Spectronics Corporation</td><td></td><td>azF è attivata dalla luce a 365 nm</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata di Hank (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14065</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Irvine Scientific</td><td>9319</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Roche</td><td>3117405001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ligando</td><td></td><td></td> marcato con trizio <td>Dal collaboratore (Grunbeck et al., 2012)</td></tr><tr><td>1% (p/v) n-dodecil-&beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>D310LA&</td><td>nbsp;</td></tr><tr>Resina <td></td><td></td><td>1D4-sefarosio</td><td>1D4 mAb immobilizzato su resina di sefarosio 2B attivato da CNBr</td></tr> 1<tr><td>% (p/v) sodio dodecil solfato (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - Gel SDS al 12%</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>SDS-PAGE eseguiti su apparecchio NuPAGE</td></tr><tr><td>Apparecchio Trans-Blot SD Apparecchio</td><td>Biorad</td><td></td><td>per trasferimento semisecco</td></tr><tr><td>Membrana Immobilon polivinilidene-difluoruro (PVDF)</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Latte scremato Fisher</td><td>Scientific</td><td>NC9934262</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Aldrich</td><td>274348</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td>Liquido di scintillazione</td></tr><tr><td>Fiale di scintillazione</td><td>Fisher Scientific</td><td>333726</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LKB Wallac 1209 Rackbeta Contatore a scintillazione liquida</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Contatore a scintillazione beta</td></tr><tr><td>Anti-rodopsina 1D4 mAb</td><td>National Cell Culture Center</td><td>personalizzato</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IgG di topo coniugata con perossidasi di rafano (HRP) KPL</td><td>, Inc.</td><td>474-1806</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Substrato chemiluminescente SuperSignal West Pico</td><td>Thermo Scientific</td><td>34080</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hyblot CL AR film</td><td>Denville</td><td>E3018</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabella 2. Materiali fotoreticolanti mirati</td></tr><tr><td>0,25% Tripsina</td><td>Invitrogen</td><td>15050065</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FLAG-triarilfosfina</td><td>Sigma</td><td>GPHOS1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>M2 FLAG mAb</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-CCR5 2D7 mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>555990</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>piastra a 96 pozzetti</td><td>Costar</td><td>3601</td><td>Fondo trasparente, alto legame EIA/RIA</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (Calcio, Magnesio)</td><td>Gibco</td><td>14040</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>16% Paraformaldeide</td><td>EMS</td><td>28908</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>KPL, Inc.</td> <td>coniugata HRP</td>.<td>474-1516</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-coniglio IgG</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1516</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Amplex Rosso</td><td>Invitrogen</td><td>A12222</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>DE Healthcare Products</td><td>97-93399</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lettore di piastre multipozzetto a fluorescenza CytoFluor II</td><td>Perseptive Biosystems</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabella 3. Marcatura mirata di peptidi-epitopi e superficie cellulare Materiali ELISA</td></tr><tr><td>Fluoresceina-fosfina</td><td></td><td></td><td>(Huber et al., presentato 2012)</td></tr><tr><td>Nonapeptide (peptide C9)</td><td>AnaSpec</td><td>62190</td><td>Peptide che imita l'epitopo 1D4 NH2-TETSQVAPA-COOH</td></tr><tr><td>1% (p/v) n-dodecil-&beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>D310LA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>Resina <td></td><td></td><td>1D4-sefarosio</td><td>1D4 mAb immobilizzato su resina di sefarosio 2B attivata da CNBr</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% Gel SDS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>SDS-PAGE eseguiti su apparecchio NuPAGE</td></tr><tr><td>Scanner a fluorescenza Confocal Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare</td><td>fuori produzione</td><td>Scanner con laser a lunghezza d'onda di 488 nm</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Tabella 4. Materiali di etichettatura fluorescenti</td></tr></tbody></table>

molecular probes geneticamente codificati a studiare g recettori accoppiati alle proteine

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Per facilitare gli studi strutturali e dinamiche di G protein-coupled recettore (GPCR) complessi di segnalazione, sono necessari nuovi approcci per introdurre sonde informativi o etichette in recettori espressi che non perturbano la funzione del recettore. Abbiamo usato ambra tecnologia di soppressione codone geneticamente codificare l&#39;amminoacido non naturale, p-azido-L-fenilalanina (AZF) in diverse posizioni mirate nei GPCR eterologamente espressi in cellule di mammifero. La versatilità del gruppo azido è illustrato qui in applicazioni diverse per studiare GPCR nel loro ambiente nativo cellulare o detergenti in condizioni solubilizzate. In primo luogo, abbiamo dimostrato una tecnologia photocrosslinking mirata basata celle per identificare i residui nella tasca di legame del ligando di GPCR dove una piccola molecola ligando marcato con trizio viene reticolato di un acido ammino azido geneticamente codificati. Abbiamo poi Dimostriamo sito-specifica modifica del GPCR dal bioorthogonal Staudinger-Bertozzi legatura reazionizione che gli obiettivi del gruppo azido mediante derivati ​​fosfina. Discutiamo di una strategia generale per la mirata peptide-epitopo tagging delle proteine ​​di membrana espresse in-cultura e la sua individuazione utilizzando un metodo ELISA basato whole-cell. Infine, dimostriamo che AZF-GPCR possono essere selettivamente contrassegnati con sonde fluorescenti. Le metodologie sono discusse generale, in quanto possono in principio essere applicate a qualsiasi posizione amminoacido in qualsiasi espresso GPCR interrogare complessi di segnalazione attive.

Abbiamo utilizzato la metodologia mutagenesi amminoacido non naturale al sito-specifico introdurre sonde molecolari in un GPCR usando l&#39;ambra codone tecnologia di soppressione. Lo schema in figura 1 illustra le fasi salienti della metodologia e le varie applicazioni di incorporare la versatile UAA, p-azido-L-fenilalanina (AZF), in GPCR. Espressione di AZF-GPCR in cellule di mammifero permette mirato photocrosslinking ai ligandi, e mirata peptide-epitopo codifica o modifiche fluorescenti di ...

Abbiamo geneticamente codificare l&#39;amminoacido non naturale, p-azido-L-fenilalanina in varie posizioni mirate a GPCR e mostra la versatilità del gruppo azido in diverse applicazioni. Questi includono una tecnologia photocrosslinking mirato a identificare i residui nella tasca-ligando di un GPCR, e site-specific modifica bioorthogonal di GPCR con un tag peptide-epitopo o sonda fluorescente.

Molecular Probes geneticamente codificati a studiare G recettori accoppiati alle proteine

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è introdurre una singola sonda informativa nei recettori accoppiati alle proteine G bersaglio, al fine di facilitare studi strutturali e dinamici dei complessi di segnalazione. Questo risultato si ottiene trasfettando le cellule con i plasmidi necessari per esprimere il macchinario traduzionale richiesto all'incorporazione dell'amminoacido non naturale zeto, fenilalanina, o zeto fee in un GPCR espresso. La variante GPCR contenente zeto fee può quindi essere utilizzata in tre modi diversi per indagare la struttura e la funzione del recettore.Prima di tutto, il zeto fee viene utilizzato come crosslinker fotoattivabile nel GPCR, il che permette l'identificazione del sito di legame di un ligando triziato. Successivamente, il zeto fee può essere impiegato come gruppo chimico reattivo al fine di ancorare un peptide coniugato o una sonda fluorescente al GPCR mediante reazioni di marcatura bioortogonali. I risultati ottenuti dimostrano l'utilizzo del sonda molecolare zeto fee nel cross-linking fotoindotto mirato, nell'etichettatura mirata di epitopi e nella marcatura fluorescente dei GPCR, basati su metodi biochimici e su cellule vive. Il princ

genetically-encoded-molecular-probes-to-study-g-protein-coupled

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

La basato sulla fluorescenza calcio saggio mobilitazione qui descritto è un sistema di screening inversa farmacologia media produttività per l'identificazione di ligando funzionalmente attivazione (s) di orfani accoppiato a proteina G recettori (GPCR).

Caratterizzazione di G recettori accoppiati alla proteina da un calcio di Mobilitazione Assay Basato sulla fluorescenza

Semplici metodi per rilevare l'attivazione selettiva delle proteine G da parte dei recettori accoppiati a proteine G rimangono una sfida eccezionale nella segnalazione cellulare. Qui, i biosensori per il trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) sono stati sviluppati legando a coppie un GPCR a peptidi proteici G per sondare i cambiamenti conformazionali a concentrazioni controllate in cellule vive.

Conformazioni GPCR g di proteine-selettivi misurata utilizzando FRET sensori in un Fluorometer Assay Live Cell Suspension

Il legame di guanosina trifosfato (GTP) è uno degli eventi più iniziali nell'attivazione del GCR-Receptor (GPCR). Questo protocollo descrive come caratterizzare farmacologicamente interazioni specifiche GPCR-ligand monitorando il legame dell'analogo GTP radio-etichettato, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPyS) Risposta a un ligando di interesse.

Misurazione del segnalatore del ricettore accoppiato con G-proteina mediante la legatura GTP con etichetta radio

Il saggio cellulare descritto è stato progettato per l'identificazione del recettore per chemochine CXC 4 (CXCR4)-agenti interagenti che inibiscono o stimolano, sia competitivo o allosterico, il Ca2 + rilascio intracellulare avviato dall'attivazione di CXCR4.

Un'analisi cinetica basata sulla fluorescenza Ca2 + mobilizzazione per identificare il G proteina-ha accoppiato il ricevitore agonisti, antagonisti e modulatori allosterici

Un'analisi di fluorescenza facile è presentata per valutare l'efficienza di amino-acil-tRNA-sintetasi/tRNA coppie conglobando amino acidi non canonico (ncAAs) proteine espresse nelle cellule di mammifero. L'applicazione di ncAAs per studiare i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) è descritto, tra cui la mappatura foto-reticolazione di associazione siti e bioorthogonal GPCR etichettatura su cellule vive.

Ottimizzando la costituzione genetica di chimico sonde in GPCR per foto-reticolazione Mapping e chimica di Bioorthogonal in cellule di mammiferi dal vivo

Dato che i GPCR sono interessanti obiettivi drogabili, lo screening dei ligandi GPCR è quindi indispensabile per l'identificazione dei composti di piombo e per gli studi di deorfanotrizzazione. A fronte di questi sforzi, descriviamo PRESTO-Tango, una piattaforma di risorse open source utilizzata per la profilazione simultanea del reclutamento transitorio di z-arrestin2 a circa 300 GPCR utilizzando un test reporter basato su TEV.

Interrogatorio parallelo del reclutamento di z-Arrestin2 per lo screening dei ligandi su una scala a livello GPCR utilizzando PRESTO-Tango Assay

Questo protocollo utilizza il gonfiore dell'agarosio come tecnica potente e generalizzabile per incorporare proteine di membrana integrali (PIM) in vescicole lipidiche unilamellari giganti (GUV), come descritto qui per la ricostituzione della proteina del recettore della serotonina 1A umana (5-HT1AR), una delle classi di recettori accoppiati a proteine G farmacologicamente importanti.

Costruzione di membrane lipidiche modello che incorporano recettori accoppiati alla proteina G (GPCR)

In questo lavoro, viene descritto un saggio di fluorescenza di calcio intracellulare ad alto rendimento per piastre a 384 pozzetti per lo screening di piccole librerie di molecole su recettori accoppiati a proteine G ricombinanti (GPCR). Il bersaglio, il recettore della chinina dalla zecca della febbre bovina, Rhipicephalus microplus, è espresso nelle cellule CHO-K1. Questo test identifica agonisti e antagonisti che utilizzano le stesse cellule in un test di "doppia addizione".

Un saggio di fluorescenza del calcio "a doppia aggiunta" per lo screening ad alta produttività dei recettori accoppiati a proteine G ricombinanti

Questo protocollo descrive l'uso di biosensori basati su BRET per la misurazione in tempo reale dell'attivazione della proteina G nelle cellule HEK293 viventi dopo stimolazione del ligando del recettore accoppiato alla proteina G. Qui, il recettore β2-adrenergico e il recettore dei cannabinoidi di tipo 1 servono come esempi per dimostrare l'efficienza dei sensori per diversi sottotipi di proteine G e in vari GPCR.

Biosensori a base di proteine G basati su BRET per la misurazione dell'attività del recettore accoppiato a proteine G in cellule vive

Test di sensibilità visiva in lucertole utilizzando un paradigma di condizionamento operante che si avvale di riproduzione video di casuale-puntino kinematograms e generati dal computer invertebrati.

Test di sensibilità visiva alla velocità e direzione del movimento in lucertole

Scopri come introdurre sonde molecolari nei recettori accoppiati a proteine G utilizzando l'aminoacido non naturale p-azido-L-fenilalanina. Questo metodo consente foto-reticolazione e marcatura bioortogonale per studi strutturali.

Molecular Probes geneticamente codificati a studiare G recettori accoppiati alle proteine

Esplora altri video