Name: Preparazione del campione proteomica dalla fissati in formalina e incluso in paraffina Tissue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Impara la preparazione proteomica di tessuti FFPE tramite microdissezione laser e digestione multi-enzimatica FASP. Questo protocollo consente l'analisi quantitativa del proteoma fino a 10.000 proteine da campioni clinici microscopici.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

L&#39;autore ringrazia il Dott. Matthias Mann per il continuo supporto e la signora Katharina Zettl per dimostrare il metodo. Questo lavoro è stato supportato dal Max-Planck per l&#39;Avanzamento della Scienza.

1. Strumentazione necessaria <ol><li> Preparazione di fette di tessuto per microdissezione e il campione lisi <ol><li> Thermoblock impostato a 99 ° C o di una vasca da bagno con acqua bollente. </li><li> Laser microdissector operativo (ad esempio PALM, Zeiss, Göttingen, Germania). </li><li> Termostatato da banco centrifuga, la temperatura impostata a 20 ° C. </li><li> Camera umida (box) con un rack per tubi di smaltimento Eppendorf tipo. </li><li> Incubatore a 37 ° C. </li><li> Spettrofluorimetro consentendo di misurazione della fluorescenza eccitata vicino a luce UV con cuvette di quarzo micro-scala (0,1-0,2 ml). </li></ol></li></ol> 2. Soluzioni <ol><li> &#39;Tissue Lysis Buffer&#39; (TLB): 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M DTT, 0.5% (w / v) di polietilenglicole 20.000 e 4% SDS. </li><li> Soluzione UA: 8 M urea in 0,1 M Tris-HCl pH 8.5. Preparare 1 ml per 1 campione. Le soluzioni UA e IAA devono essere preparate al momento e utilizzati entro un giorno. </li><li> Soluzione IAA: 0,05 M iodoacetamide in UA. Preparare 0.1 ml per 1 campione. </li><li> Endoproteinase Lys-C, soluzione stock. </li><li> Tripsina, soluzione stock. </li><li> &#39;Digestione del buffer&#39; (DB): 0,05 M Tris-HCl pH 8.5. Preparare 0,25 ml per 1 campione. </li><li> &#39;Triptofano Soluzione Standard&#39;: 0,1 mg di triptofano in 1 ml di acqua deionizzata. </li><li> &#39;Assay buffer di B&#39; (ABB): 10 mM Tris-HCl, pH 7,6. </li><li> Soluzione madre di Britton &amp; Robinson Tampone universale (BRUB). Preparare una soluzione contenente 0,1 M CH 3 COOH, 0,1 MH 3 PO 4, e 0,1 MH 3 BO 3 e regolare con 1 M NaOH al pH desiderato (2, 4, 5, 6, e 11). Prima dell&#39;uso diluire 5 volte con acqua deionizzata. </li><li> Tampone A: 1% (v / v) CH 3 COOH in acqua deionizzata. </li><li> Tampone B: 60% (v / v) CH 3 CN, 1% (v / v) CH3COOH in acqua deionizzata. </li></ol> 3. Pipetta Tip e colonne &quot;StageTip &#39; <ol><li> Preparare SAX tip-colonna impilando 6 strati di membrana Empore-anioni in un common 0,2 ml punta della pipetta. Fare due colonne SAX-tip per campione. </li><li> Preparare &#39;StageTip&#39; impilando 3 strati di Empore-C 18 in un puntale di 0,2 ml. Effettuare 6 punte palco per ogni campione. </li></ol> 4. Preparazione di fette di tessuto per Microdissection e dei Campioni Lysis <ol><li> Tagliare sezioni con un microtomo (lo spessore delle fette dipende dal campione. Solitamente microdissezione funziona bene con le fette di 7-10 micron). </li><li> Irradiare diapositive membrana (MembraneSlide 1.0 PEN) con raggi UV per 45 min. </li><li> Montare le sezioni sui vetrini di membrana irradiare e asciutto, a 37 ° C per 2 ore. </li><li> Sparaffinare e portare le sezioni montati da due incubazioni successive in xilene per 2,5 minuti e 1,5 min. Reidratare le sezioni da incubazioni consecutivi in ​​etanolo assoluto, etanolo al 70% e acqua, ciascuno per 1 min. </li><li> Macchiare le sezioni con ematossilina di Mayer per 20 secondi, sciacquare con acqua per 1 minuto, e aria secca. </li><li> Raccogliere le populati cellularisu interessi utilizzando il sistema di microdissezione laser capture. Quando si utilizza lo strumento PALM (Zeiss) raccogliere i campioni nei tappi adesivi (adesivi PAC 200). </li><li> Pipettare un&#39;aliquota del TLB sul materiale microdissezione nel tappo. Chiudere la provetta e raccogliere la sospensione con un breve centrifugazione. Lyse tessuto microdissezione a 99 ° C su una piastra riscaldante con agitazione (600 rpm) per 1 ora. Utilizzare 3 ml di tampone per 10 nl del tessuto microdissezione. </li><li> Chiarire l&#39;estratto grezzo mediante centrifugazione a 16.000 xg a 18 ° C per 10 min. Il lisato può essere conservati congelati a -20 ° C. </li></ol> 5. Elaborazione del campione <ol><li> Mescolare fino a 50 ml di lisato chiarificato con 200 ml di UA nelle unità di ultrafiltrazione (30k forense) e centrifugare a 14000 g fino a meno di 10 microlitri della soluzione rimarranno nel filtro. Di solito questo passo richiede 10-15 minuti centrifugazione. </li><li> Pipettare 200 ml di UA all&#39;unità di ultrafiltrazionee centrifugare come in 5.1. Svuotare il tubo di raccolta. </li><li> Pipettare 50 ml di soluzione di IAA e miscelare a 600 rpm in una termo-mixer per 1 min e centrifugare come in 5.1. </li><li> Aggiungere 100 ml di UA all&#39;unità di ultrafiltrazione e centrifugare come in 5.1. Ripetere questa operazione due volte </li><li> Dispensare 100 ml di DB all&#39;unità di ultrafiltrazione e centrifugare a 5.1. Ripetere questa operazione due volte. </li><li> Trasferire le unità di filtrazione a nuovi tubi di raccolta. Pipettare 40 microlitri DB con endoproteinase Lys-C (proteinasi rapporto proteine ​​totali di 1:100) e miscelare a 600 rpm in termo-mixer per 1 min. Incubare le unità in una camera umida a 37 ° C per 18 ore. </li><li> Centrifugare le unità filtranti a 14000 g come in 5.1. </li><li> Pipettare 160 ml di acqua deionizzata e centrifugare le unità filtranti come in 5.1. La flow-through pool (5.7 e 5.8 punti) contiene i peptidi rilasciati da endoproteinase Lys C. </li><li> Trasferire unità di ultrafiltrazione a un nuovo tubo di raccolta. Aggiungere 40 microlitriDB con tripsina (enzima proteina rapporto 1:100) e miscelare a 600 rpm in termo-mixer per 1 min. Incubare le unità in una camera umida a 37 ° C per 4 ore. Ripetere i punti 5.7 e 5.8 per raccogliere i peptidi triptici. </li></ol> 6. La quantificazione dei peptidi <ol><li> La misurazione del contenuto di peptide in digest proteina può essere eseguita in tampone diluito perché i residui di triptofano sono ben accessibile al solvente. </li><li> Pipettare 0,2 ml di ABB in cuvetta di quarzo e registrare lo spettro di emissione di &#39;vuoto&#39;. </li><li> Preparare curva di calibrazione utilizzando 0,1 mg passi con l&#39;aggiunta di 1 ml aliquote TSS alla cuvetta e delicato mix con la ABB. </li><li> Pulire la cuvetta. </li><li> Pipettare il campione e registrare lo spettro (campione). </li><li> Calcolo della concentrazione di proteine ​​e peptidi Da 0.1 mg triptofano corrisponde a circa 9 mg proteina (basata sulla media 1.1% del contenuto di triptofano in miscele proteiche ottenute by lisi cellule umane), il contenuto proteico della a contenuto campione o peptide nel digest è pari a: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" /> dove F (Standard1) è la fluorescenza di 0.1 mg standard di triptofano. Il contenuto peptide permette di calcolare la resa del procedimento digestione e fornisce informazioni essenziali per seguenti peptide frazionamento e spettrometria di massa. </li></ol> 7. Il frazionamento delle Lys-C e trittico peptidi <ol><li> Diluire le soluzioni di peptidi ottenuti dalla digestione con Lys-C e tripsina con 0,2 ml di BRUB pH 11 e pH 5, rispettivamente. </li><li> Montare la punta della colonna SAX nella centrifuga coperchio dell&#39;adattatore tubo. </li><li> Lavare ed equilibrare la punta-colonna SAX successivamente con 0,1 ml di metanolo, 0,1 ml di 1 M NaOH, e 3 volte con 0,1 ml di BRUB, pH 11 per la separazione di Lys-C Peptides e con BRUB, pH 5 per i peptidi triptici. Il flusso delle soluzioni mediante il materiale della colonna è facilitato mediante centrifugazione a 4000 x g. </li><li> Lavare ed equilibrare le C 18 - &#39;StageTips&#39; successivamente, con 0,05 ml di metanolo, poi con 0,05 ml di tampone B e con 0,05 ml di tampone A. Preparare sei C 18 - &#39;StageTips; 4 per la separazione del Lys- peptidi C e due per la separazione dei peptidi triptici. </li><li> Montare il SAX Tip-colonna della C 18 - &#39;StageTip&#39;. Caricare le soluzioni campione nelle SAX Tip colonne equilibrate e centrifugare le colonne a 5.000 xg per 3 min. </li><li> Equilibrare le colonne &quot;pipetta a punta&quot; con 0,1 ml di BRUB, pH 11 o pH 5, rispettivamente al Lyc-C e campioni triptici. Facilitare il flusso mediante centrifugazione a 5.000 x g. </li><li> Trasferire la Tip-colonna SAX alla prossima C 18 - &#39;StageTip&#39;. </li><li> Continua eluizione dei peptidi con BRUB pH 6, 4 e 2 per il campione Lys C e con BRUB pH 2 per il campione con peptidi triptici. Per ogni fase di eluizione usare un C separato 18 - &#39;StageTip&#39;. </li><li> Lavare le C 18 - &#39;StageTips&#39; con 0,05 ml di tampone A. </li><li> Eluire frazioni con 0,05 ml di tampone B in fiale utilizzate direttamente per l&#39;iniezione dei campioni nel sistema LC assemblati con uno spettrometro di massa. </li></ol>

<ol><li>Nagaraj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+proteome+and+transcriptome+mapping+of+a+human+cancer+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 548(2011).</li>
<li>Beck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantitative+proteome+of+a+human+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">The quantitative proteome of a human cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 549(2011).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Dus, K., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+workflow+for+analysis+of+archival+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+clinical+samples+to+a+depth+of+10+000+proteins.+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Proteomic workflow for analysis of archival formalin-fixed and paraffin-embedded clinical samples to a depth of 10 000 proteins. Proteomics.</a> Clin. Appl. 7 (3-4), 225-233 (2013).</li>
<li>Magdeldin, S., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+deciphering+proteomes+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues.</a> Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).</li>
<li>Ostasiewicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome%2C+phosphoproteome%2C+and+N-glycoproteome+are+quantitatively+preserved+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+and+analyzable+by+high-resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 9 (7), 3688-36700 (2010).</li>
<li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature. 6 (5), 359-362 (2009).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Ostasiewicz, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+recovery+FASP+applied+to+the+proteomic+analysis+of+microdissected+formalin+fixed+paraffin+embedded+cancer+tissues+retrieves+known+colon+cancer+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteome+research%22%5BJournal%5D)">High recovery FASP applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers.</a> Journal of proteome research. 10 (7), 3040-3049 (2011).</li>
<li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+quantitative+remodeling+of+the+proteome+between+normal+colon+tissue+and+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma.</a> Mol. Syst. Biol. 8, 611(2012).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consecutive+proteolytic+digestion+in+an+enzyme+reactor+increases+depth+of+proteomic+and+phosphoproteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Consecutive proteolytic digestion in an enzyme reactor increases depth of proteomic and phosphoproteomic analysis.</a> Anal. Chem. 84 (6), 2631-2637 (2012).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+FASP+and+StageTip-based+fractionation+allows+in-depth+analysis+of+the+hippocampal+membrane+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome.</a> J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).</li>
<li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%2C+nanoelectrospray%2C+and+LC%2FMS+sample+pretreatment+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).</li>
<li>Thompson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+pre-analytical+factors+on+the+proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Proteomics Clin. Appl. , (2012).</li>
</ol>

L&#39;autore non ha nulla da rivelare.

La possibilità di studiare il materiale FFPE dalla tecnologia proteomica ad una profondità comparabile con il sequenziamento degli acidi nucleici e delle tecniche di microarray apre nuove prospettive nella biomarker e la destinazione della droga scoperta. Il protocollo descritto ha la caratterizzazione e quantificazione di proteoma di popolazioni di cellule microdissezione su una scala da 10.000 proteine. Quando si utilizza meno del materiale microdissezione un set di dati più piccoli possono essere generati, ma forse in molti casi quelli può anche fornire dati clinici importanti. Così, sia i campioni possono essere analizzati direttamente dopo la procedura MED-FASP o possono essere separati in meno frazioni. Poiché procedura FASP è compatibile con qualsiasi tipo di proteasi, altri enzimi o la loro combinazione può essere utilizzato dalla digestione delle proteine ​​6. La qualità del materiale FFPE sembra essere il problema più critico dell&#39;analisi. Abbiamo sperimentato che il tessuto fissato della stessa origine ma provenienti da differisconocliniche ORL avevano proprietà distinte. Utilizzando il tessuto da una fonte siamo stati in grado di generare peptidi ad alti rendimenti, mentre materiale simile da un&#39;altra clinica era quasi inutile. E &#39;probabile che la fissazione applicata e procedure incorporamento nonché condizioni di conservazione sono i principali fattori che influenzano le proprietà del materiale clinico 12. Pertanto è consigliabile testare le proprietà di alcuni campioni prima di iniziare un progetto più ampio. Molte pubblicazioni hanno riportato l&#39;uso del materiale FFPE in passato. Tuttavia, il numero di proteine ​​identificate in questi studi non superare più di 1.000-2.000 proteine ​​4. Considerando le dimensioni delle proteoma specifici di cellule umane aventi più di 10.000 proteine, tali studi sono stati in grado solo di fornire un quadro molto superficiale, quasi limitato a proteine ​​altamente abbondanti coinvolte in funzioni di manutenzione. Il nostro protocollo permette l&#39;isolamento efficiente del clinico o biologico materiale from conservato tessuto ed è ottimizzata per lisi, trasformazione di proteine ​​e peptidi prefrazionamento. Di conseguenza il nostro flusso di lavoro di preparazione del campione, quando accoppiato al spettrometria di massa di fascia alta, permette intuizioni di un proteoma quasi completi. Notevole, questo è possibile a requisiti di quantità di campione minuti. Il principale vantaggio di utilizzare i tessuti conservati è la loro relativa ampia disponibilità. Campioni FFPE archiviati per molti anni e decenni, e talvolta considerati come inutile, ora, grazie alla tecnologia proteomica, appaiono come materiale di grande valore per la ricerca clinica. Considerando che molte malattie possono essere studiate usando fresche o congelate indagine materiale di materiale FFPE sembra essere particolarmente importante per lo studio delle malattie rare 12, erano raccolta di una serie rappresentativa di campioni di solito richiede molto tempo.

Fissaggio con paraformaldeide e l&#39;inclusione in paraffina (FFPE) è il metodo standard per la conservazione e ricerca pathomorphologic di materiale tessuto clinico. Microscopia del tessuto conservato permette l&#39;identificazione di malattie legate cambiamenti morfologici, e la rilevazione e il punteggio di insorgenza di malattie legate antigeni. Dal momento che in genere solo una piccola parte del campione FFPE viene utilizzato in queste analisi, grandi quantità di materiale clinico rimangano archiviati e possono essere sfruttati in altri tipi di studi. Durante la recente decennio della ricerca nelle scienze della vita è stata rafforzata dalla potente tecnologia proteomica. Questa tecnologia consente l&#39;identificazione e la quantificazione di migliaia di proteine ​​in miscele complesse di proteine. Una caratteristica importante della tecnologia è che solo piccole quantità di materiale sono necessari per analisi su vasta scala. Recenti studi di proteomica hanno dimostrato che le proteine ​​possono essere studiate su una scala di quasi compLete proteoma 1, 2. Questo tipo di sistema permette indagini ampie conoscenze nella composizione delle cellule e l&#39;identificazione dei gruppi di proteine ​​che si verificano a livelli anomali nelle malattie. Considerando che tali studi richieste grandi capacità di spettrometria di massa, il recente lavoro ha dimostrato che simili entità della identificazione può essere raggiunto entro un solo giorno di misura 3. Il requisito di importo relativamente basso del campione e l&#39;ampia disponibilità di campioni clinici conservati noi e gli altri tentati di sviluppare metodi che permettano l&#39;esplorazione proteomica del materiale FFPE (per una rassegna vedi 4). Sfruttando la reversibilità della fissazione in formalina in un trattamento termico abbiamo sviluppato un protocollo che permette l&#39;estrazione quantitativa delle proteine ​​dal tessuto fissa 5. Abbiamo dimostrato che la procedura di sintesi conserva non solo proteine, ma anche almeno alcune modifiche post-traduzionali. Fosforylation e N-glicosilazione possono essere studiate usando i campioni FFPE 5, tuttavia un prerequisito perché è una delle condizioni di incasso dei tessuti, di stoccaggio e di fissazione controllati accuratamente. Successivamente, abbiamo ottimizzato il metodo di cattura microdissezione laser del tessuto fissato e per la proteomica reattore basato campione di trasformazione 6, 7. Uno studio su larga scala su cancro colorettale ha permesso l&#39;analisi quantitativa di 7.500 proteine ​​da microdissezione da materiale clinico 8. Infine, abbiamo migliorato il modo di esplorazione del materiale microdissezione mediante l&#39;applicazione consecutiva-two protocollo digestione delle proteine ​​passaggio 9. Rispetto alle strategie di digestione comuni utilizzando singolo enzima, questa procedura permette la generazione di più peptidi di sequenza univoco e, di conseguenza, si traduce in una maggiore profondità di identificazione delle proteine. Analisi di microdissezione adenoma del colon umano ha permesso l&#39;analisi proteomica ad una profondità di 9.500 proteine ​​per campione 3. In questo stalloney abbiamo mappato 55.000 peptidi per campione permettono l&#39;identificazione di 88-89% di proteine ​​con almeno 2 peptidi. Qui vi presentiamo un protocollo ottimizzato per la preparazione di campioni dal materiale FFPE per l&#39;analisi LC-MS/MS. Questo protocollo comprende preparazione di fettine di tessuto per microdissezione, lisi delle cellule isolate, e trattamento del campione in un formato reattore (FASP) 6. Poi si descrive una determinazione spettrofluorimetrico delle rese peptide, un compito con grande importanza per l&#39;identificazione ottimale peptide dalla spettrometria di massa. Infine, abbiamo dimostrato una forte scambiatore anionico (SAX) a base di tecnica di separazione per il peptide frazionamento. In questo metodo sia la separazione peptide e la pulizia finale sono effettuate utilizzando microcolonne pipetta-ribaltamento 10, 11. Questo passaggio è facoltativo ma è raccomandato in studi in cui più di pochi microgrammi di peptidi possono essere ottenuti da un singolo campione. Il SAX-frazionamento in grado di aumentare notevolmente il numero e la gamma dinamica di identPrecisazioni ed estendere la copertura sequenza proteica 3, 10.

<table><tbody><tr><td>MembraneSlide 1.0 PEN</td><td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germania</td><td>415190-9041-000</td><td></td></tr><tr><td>Cappuccio adesivo 200 opaco</td><td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germania</td><td>415190-9181-000</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ematossilina di Mayer </td><td>Sigma-Aldrich St. Louis, MO</td><td>MHS32</td><td></td></tr><tr><td>Forensic 30k </td><td>Merck Millipore Darmstadt, Germania</td><td>MRCF0R030</td><td>(Precedentemente venduto come Microcon YM-30) </td></tr><tr><td>Empore Anion Tecnologie</td><td>bioanalitiche 3M Azienda ST. Paul, MN</td><td>2252</td><td></td></tr><tr><td>Empore C18</td><td>Tecnologie bioanalitiche 3M Azienda ST. Paul, MN</td><td>2215</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina </td><td>Promega</td><td>2014-06-27</td><td></td></tr><tr><td>Endoproteinasi Lys-C</td><td>Wako</td><td>129-02541</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione del campione proteomica dalla fissati in formalina e incluso in paraffina tissue

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Materiale clinico conservato è una fonte unica per l&#39;indagine proteomica delle patologie umane. Qui si descrive un protocollo ottimizzato che consente larga scala l&#39;analisi quantitativa dei fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) tessuti. La procedura comprende quattro fasi distinte. Il primo è la preparazione di sezioni dal materiale FFPE e microdissezione di cellule di interesse. Nella seconda fase le cellule isolate vengono lisate e trattati con &#39;filtro aided preparazione del campione&#39; (FASP) tecnica. In questa fase, le proteine ​​sono esaurite da reagenti utilizzati per la lisi del campione e vengono digeriti in due fasi usando endoproteinase lysC e tripsina. Dopo ogni digestione, i peptidi sono raccolti in frazioni separate e il loro contenuto viene determinato utilizzando una misurazione di fluorescenza altamente sensibile. Infine, i peptidi vengono frazionati su microcolonne &#39;pipetta a punta. I lysC-peptidi sono suddivise in 4 frazioni, mentre il pe tritticoptides sono separati in due frazioni. In questo modo i campioni preparati permettono di analizzare proteoma da piccole quantità di materiale ad una profondità di 10.000 proteine. Così, il flusso di lavoro descritto è una tecnica potente per studiare malattie in un livello di sistema-moda così come per l&#39;identificazione di potenziali biomarcatori e bersagli farmacologici.

Analisi proteomica di materiale FFPE richiede metodi affidabili e riproducibili per la preparazione del campione. In questa pubblicazione si dimostra un protocollo che permette un efficace isolamento di popolazioni cellulari dal materiale fisso e la loro trasformazione chimica con conseguente elevata purezza frazioni peptidiche che possono essere utilizzati direttamente per l&#39;analisi LC-MS/MS. La procedura consiste di quattro parti distinte: (1) preparazione delle sezioni dei campioni FFPE e la sua microdissezione, (2) lisi del campione e l&#39;elaborazione delle proteine ​​mediante approccio MED FASP, e (3) quantificazione e (4) di frazionamento i peptidi (Figura 1). Nella prima fase del procedimento campioni FFPE sono sezionati con un microtomo e montati su membrana rivestita diapositive. Per aumentare l&#39;adesione tra le sezioni di tessuto e la superficie della membrana diapositiva è necessario per irradiare la superficie del vetrino con luce UV. A questo scopo si usa la luce di una lampada UVintegrato in un banco di coltura cellulare. Dopo questa fase i vetrini sono sottoposti a lavaggi permettendo la rimozione di paraffina e reidratazione dei campioni. Il materiale reidratato è macchiato con ematossilina per un breve periodo. Ciò si traduce in una debole colorazione del campione ma è sufficiente per la visualizzazione delle aree campione per microdissezione. La colorazione deve essere interrotta rapidamente risciacquando dei vetrini con un eccesso di acqua. Una colorazione prolungato dei risultati del campione di scarsi rendimenti peptidici. Nella fase successiva le sezioni essiccati sono sottoposti a microdissezione. La selezione delle aree tissutali di cellule individuali dipende dal tipo di indagine e richiede sempre conoscenze specifiche in istologia o Pathomorphology. Il materiale rilasciato laser viene raccolto su superfici adesive delle provette per il prelievo del campione. Poiché la capacità di legame del materiale adesivo è limitato è necessario trasferire il materiale microdissezione dal coperchio di tegli tubo dopo la dissezione di ogni 3-5 mm 2 del campione. Questo può essere fatto facilmente pipettaggio di pochi microlitri di tampone di lisi tissutale (LTB) sul coperchio e una breve rotazione del tubo in una centrifuga. Dopo che il campione viene raccolto sul fondo della provetta, la microdissezione e la raccolta del campione sul coperchio può essere proseguita. Una volta che l&#39;intero campione viene raccolto i tubi devono essere ulteriormente tappo con parafilm e incubate in un bagno d&#39;acqua a circa 99 ° C con agitazione continua per 1 ora. Poiché durante l&#39;incubazione acqua condensa sul coperchio, ogni 15 min i tubi devono essere poco centrifugato per raccogliere di nuovo l&#39;acqua nel cono tubo. Per ottenere peptidi lisati tissutali vengono elaborati utilizzando l&#39;approccio MED-FASP. In questo metodo le proteine ​​lisati sono esaurite dal detersivo e altre sostanze a basso peso molecolare, carboamidomethylated a residui di cisteina, e poi consecutivamente digeriti con due enzimi DIFferenza nelle loro specificità scissione: endoproteinase lysC e tripsina. Dopo ogni fase di digestione i peptidi sono raccolti in frazioni separate. In questa parte della preparazione del campione è importante continuare a ciascuna delle fasi di centrifugazione fino a oltre il 95% della soluzione inizialmente caricata nell&#39;unità di filtrazione superato la membrana. Analizzando tessuto del colon e del suo cancro abbiamo osservato che questa procedura rendimenti 3-6 pg di peptide per 100 nl (tessuto 100 mg o 10 mm 2 di una sezione di 10 um) del materiale microdissezione (Tabella 1). Poiché la proteina totale estraibile da tessuti è di circa il 10% del peso del tessuto le procedure di estrazione e digestione, congiuntamente, una resa del 30-60% nel rispetto al tessuto fresco originario. Questi valori riflettono perdite della proteina durante la disidratazione e colorazione, microdissezione e ritenzione della porzione del campione non digerito nelle unità di ultrafiltrazione. Poiché l&#39;estrazione e la lavorazione di nontessuto FFPE n-microdissezione comportato proteina-to-peptide-conversione resa del 75% 5 è probabile che le perdite di esempio critiche si verificano durante i passi prima MED-FASP. Una caratteristica importante delle miscele di peptidi ottenuti con tale procedura è la loro elevata purezza che facilita ulteriormente processo di frazionamento peptide frazionamento e l&#39;identificazione spettrometria di massa. Questo è stato recentemente dimostrato da un&#39;analisi di campioni di adenoma colorettale 3. In tale studio circa il 40% degli eventi MS / MS ha portato alla identificazione di peptidi dal tessuto FFPE e portato nella mappatura di fino a 17.000 peptidi per singola analisi LC-MS/MS. I tassi più alti di identificazione sono stati raggiunti solo in analisi delle cellule congelate in vitro in coltura 3. Nelle ultime due parti della intera procedura i peptidi isolati sono quantificati e frazionato su microcolonne pipetta a punta. Poiché la quantità di peptide isolato dal tessuto microdissezione sono esserebassa 10 mg non possono essere quantificati con comunemente usati saggi proteici a base di coloranti. Anche gli A 280 misurazioni UV-spettrale a tali concentrazioni non sono utili a causa della luce effetto di dispersione. Al contrario, le misurazioni di fluorescenza dei residui di triptofano offrono un modo affidabile per la determinazione del contenuto di peptide. Recentemente abbiamo dimostrato che fino a 5.000 proteine ​​da cellule in coltura possono essere identificati in un &#39;colpo solo&#39; 4 ore di analisi LC-MS/MS 7. Tuttavia questo tipo di analisi applicata a tessuti nativi raramente consente l&#39;identificazione di oltre 3.000 mila proteine. Per aumentare la profondità dell&#39;analisi peptidi generati in MED FASP devono essere pre-frazionata prima LC-MS/MS. La separazione micro-colonna SAX base è un metodo semplice ed efficiente frazionamento 10. E &#39;già stato applicato in diversi studi di proteomica compresi quelli analizzando tessuto fissato 5, 8, 9. Il SAX-microcolu &#39;pipetta punta&#39;MNS, e la C 18 - colonne di dissalazione &#39;StageTip&#39; 9 sono facili da preparare. Le colonne sono assemblati impilando di tappi, tagliati dalla SAX o C 18 membrane, in una microlitri punta di pipetta 11 200. Esempi di analisi dei campioni FFPE SAX-frazionata sono mostrati nella Tabella 1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" /> Figura 1. Panoramica della procedura. La procedura consiste di quattro parti distinte: (1) preparazione delle sezioni dei campioni FFPE e la sua microdissezione, (2) lisi del campione e l&#39;elaborazione delle proteine ​​mediante approccio MED FASP, e (3) quantificazione e (4) di frazionamento i peptidi. <table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.4in"> Campione </td><td fo:width="1in"> Esempio di pre-frazionamento / digestione </strong&gt; </td><td fo:width="1in"> Spettrometro di massa utilizzato </td><td fo:width="1.25in"> Resa Peptide ng campione / nL (± SD) </td><td fo:width="1.25in"> Proteine ​​Identificazioni univoco per ogni singolo campione </td><td fo:width=".75in"> Riferimento </td></tr><tr><td> • Adenonocarcinoma • mucosa colica normale </td><td> SAX / un enzima </td><td> Orbitrap-Velos </td><td> 36 ± 11 (n = 8) 30 ± 8 (n = 8) </td><td> 5985 ± 54 5868 ± 110 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> • colon Adenoma </td><td> SAX / due enzimi </td><td> Q Exactive </td><td> 56 ± 6.1 (n = 3) </td><td> 9501 ± 28 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Rappresentante dei risultati delle analisi proteomica del tessuto microdissezione FFPE.

In formalina archivio fisso e paraffina (FFPE) campioni clinici sono materiale prezioso per le indagini di malattie. Qui mostriamo un flusso di lavoro di preparazione del campione che consente un&#39;analisi approfondita proteomica del tessuto FFPE microdissezione.

Preparazione del campione proteomica dalla fissati in formalina e incluso in paraffina Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare e pre-frazionare peptidi da materiale fissato in formalina e in paraffina, o FFPE, per l'analisi proteomica. Ciò si ottiene isolando il tessuto desiderato mediante microdissezione, seguito dalla lisi cellulare. Il secondo passaggio consiste nel generare peptidi attraverso l'elaborazione del campione.Utilizzo della preparazione del campione assistita da filtro con digestione multi-enzimatica. I peptidi vengono quindi quantificati misurandone la fluorescenza del triptofano. L'ultimo passaggio consiste nella frazionamento dei peptidi mediante una tecnica di separazione basata su scambio anionico forte per il frazionamento dei peptidi.In definitiva, i campioni preparati permettono l'analisi di proteomi ottenuti da quantità minime di materiale fino a una profondità di 10.000 proteine. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la digestione in gel o in soluzione, è che essa è applicabile a piccole quantità di campioni clinici, come cellule ottenute mediante microdissezione laser. Il metodo fornisce campioni contenenti peptidi perfetti e puri.Che cosa facilita l'esplorazione proteomica dei tessuti umani e delle malattie? L'intero protocollo consiste in tecniche sviluppate e pubblicate in passato. Queste includono fasp ad alto recupero, pipet tip ation e la determinazione del contenuto peptidico basata sulla fluorescenza del triptofano, dimostrando che la procedura sarà Mrs.La dottoressa Catina, tecnico del nostro laboratorio, inizia a preparare sezioni di tessuto per la microdissezione tagliando sezioni con un microtomo. Lo spessore delle sezioni dipende dal campione. Di solito, la microdissezione funziona bene con sezioni di sette a dieci micrometri.Dopo aver irradiato le lamelle con luce UV per 45 minuti, montare i tagli su di esse prima di farle asciugare a 37 gradi Celsius per due ore. Deparaffinare i preparati montati mediante due incubazioni successive in barattoli consecutivi di xilolo per due minuti e mezzo e un minuto e mezzo. Quindi reidratare i tagli in modo consecutivo.Incubazioni di un minuto in etanolo assoluto, etanolo al 70% e, infine, in acqua. Dopo la colorazione delle sezioni con ematina di Meyer per 20 secondi.Risciacquare con acqua per un minuto e lasciare asciugare all'aria. Raccogliere la popolazione cellulare di interesse mediante un sistema di microdissezione laser. Quando si utilizza lo strumento palm, raccogliere i campioni nei tappi adesivi usando tre microlitri di tampone di lisi dei tessuti per 10 nanolitri di tessuto microdissecato.Applicare il buffer al materiale microdissecato nel cappuccio e chiudere il tubo. Raccogliere la sospensione dopo una breve centrifugazione. Quindi lisare il tessuto microdissecato a 99 gradi Celsius in un blocco riscaldante con agitazione per un'ora.Chiarire l'estratto grezzo mediante centrifugazione a 16.000 G e 18 gradi Celsius per 10 minuti. Mescolare fino a 50 microlitri del lisato chiarificato con 200 microlitri della soluzione UA in un'unità di ultrafiltrazione. Quindi centrifugare a 14.000 G fino a quando nel filtro rimangono meno di 10 microlitri di soluzione.Di solito, questo passaggio richiede una centrifugazione di 10-15 minuti. Successivamente, pipettare 200 microlitri della soluzione UA nell'unità di ultrafiltrazione e centrifugare. Come in precedenza, svuotare il tubo di raccolta prima di pipettare 50 microlitri della soluzione IAA nell'unità di ultrafiltrazione.Mescolare a 600 giri/min in un termoagitatatore a temperatura ambiente per un minuto e centrifugare. Come in precedenza, proseguire con i passaggi di ultrafiltrazione e centrifugazione come indicato nel protocollo scritto allegato a questo video. Successivamente, trasferire le unità di filtrazione in nuove provette di raccolta.Pipettare 40 microlitri di buffer di digestione con endoproteinasia lic C prima di mescolare a 600 RPM nel termo-miscelatore per un minuto. Incubare le unità in una camera umida a 37 gradi Celsius per 18 ore. Dopo aver centrifugato le unità filtranti come fatto in precedenza, pipettare 160 microlitri del buffer DB e centrifugare.Le unità filtranti attraverso cui passa il flusso combinato contengono i peptidi rilasciati dalla proteasi endo lic C. Successivamente, raccogliere i peptidi triptici come descritto nel protocollo testuale. La misurazione del contenuto peptidico nei digesti proteici può essere eseguita in tampone diluito poiché i residui di triptofano sono ben accessibili al solvente. Per quantificare i peptidi, pipettare prima 0,2 millilitri di tampone per saggio DB nella cuvetta di quarzo Q.Quindi posizionare il Q vet nel portacampioni dello strumento qve e registrare lo spettro di emissione per il bianco. Preparare una curva di calibrazione utilizzando incrementi di 0,1 microgrammi aggiungendo aliquote di un microlitro della soluzione standard di triptofano al Q vet e mescolando delicatamente con il buffer db. Dopo aver pulito il Q vet, pipettare il campione e registrare lo spettro del campione.Procedere al calcolo della concentrazione di proteine e peptidi come descritto nel protocollo testuale prima della frazionatura. Preparare la colonna a punta SAX impilando sei strati di membrana ionica EM.Import in una comune punta da pipetta da 0,2 millilitri. Preparare due colonne a punta SAX per ogni campione.Successivamente, preparare la punta a gradini impilando tre strati di M quattro C 18. In una punta da pipetta di 0,2 millilitri, preparare sei punte a gradini per ogni campione. Per iniziare.Effettuare la frazionatura diluendo le soluzioni peptidiche ottenute mediante digestione con ly C con 0,2 millilitri di tampone universale BRI e Robinson a pH 11. Analogamente, diluire le soluzioni peptidiche ottenute mediante digestione con tripsina con 0,2 millilitri di tampone universale BRI e Robinson a pH 5. Assemblare la colonna a punta SAX nel coperchio dell'adattatore per provetta centrifuga prima di lavare ed equilibrare la colonna a punta SAX e le punte a stadio C18 come descritto nel protocollo testuale.Successivamente, assemblare la colonna a punta SAX nella punta di tipo C 18. Caricare le soluzioni campione nelle colonne a punta SAX equilibrate e centrifugare le colonne a 5.000 G per tre minuti. Lavare le colonne a punta con 0,1 millilitri dei campioni diluiti.Facilitare il flusso mediante centrifugazione a 5.000 G. Trasferire la colonna a punta SAX allo stadio C18 successivo e continuare ad eluire i peptidi come descritto nel protocollo testuale. Dopo aver lavato le punte a stadio C18 con 0,05 millilitri di tampone A, eluire le frazioni con 0,05 millilitri di tampone B in vial, successivamente utilizzati per l'iniezione dei campioni in un sistema di cromatografia liquida assemblato con uno spettrometro di massa rappresentativo. Qui vengono mostrati i risultati dell'estrazione proteica e della digestione.La lisi di 250 nanolitri di tessuto, corrispondenti a un'area microdissecata di 25 millimetri quadrati da una sezione di 10 micrometri, produce circa 45 microgrammi di proteine totali dopo la digestione consecutiva in due passaggi nel formato fast con l'endoproteasi slice C e tripsina, ottenendo rese superiori al 50% delle proteine totali. Qui viene mostrata una misurazione rappresentativa della concentrazione di peptidi mediante fluorescenza; gli spettri del campione e dello standard di triptofano mostrano massimi compresi tra 350 e 360 nanometri. L'intensità della fluorescenza è proporzionale al contenuto di triptofano.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare campioni da tessuti ad alto contenuto per l'analisi proteomica utilizzando la tecnica di microdissezione, l'elaborazione del campione e la frazionatura dei peptidi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore, più il tempo necessario per la digestione delle proteine. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare sezioni di tessuto appena preparate dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della proteomica per esplorare i proteomi di tessuti e cellule e le anomalie nell'uomo utilizzando materiali fissati e inclusi in paraffina.

proteomic-sample-preparation-from-formalin-fixed-paraffin-embedded

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video dimostra il protocollo per l'estrazione del DNA da fissati in formalina materiale in paraffina. Questa è una di più giorni procedura di sezioni di tessuto in cui sono deparaffinate con xilene, reidratato con etanolo e trattati con proteinasi K per purificare e isolare il DNA per le successive analisi del gene-specifici o genoma.

Estrazione DNA da materiale in paraffina per le analisi genetiche ed epigenetiche

Il seguente video descrive come preservare la morfologia di un tessuto con fissazione in formalina e inclusione di paraffina.

Conservazione dei tessuti con paraffina fissata in formalina (FFPE): un metodo per studiare la morfologia dei tessuti

Questo protocollo di estrazione modificato migliora RNA e DNA raccolti dalle regioni più precisamente mirati di interesse in blocchi di tessuto istopatologici.

Preparazione core tessuto inclusi in paraffina fissati in formalina per entrambi RNA e DNA Extraction

Ibridazione in situ di fluorescenza (pesce) è spesso necessaria in combinazione con l'istopatologia e diagnostica molecolare per la selezione della terapia in medicina personalizzata. Un fissativo di romanzo-cross-linking, privo di formalina tessuto che permette alta qualità morfologiche, molecolare e analisi dei pesci dallo stesso campione tramite l'aggiunta di un passaggio di post-fissazione prima di pesce è presentato.

Protocollo per HER2 pescare con un fissativo tessuto-cross-linking, privo di formalina per combinare i vantaggi di crioconservazione e fissazione in formalina

Questo protocollo descrive un metodo attendibile e riproducibile per la preparazione di base di sublimazione di formalina riparata tessuto destinato per imaging spettrometria di massa.

Preparazione ottimale di formalina riparata campioni per Peptide basati su matrice assistita spettrometria totale di desorbimento/ionizzazione Laser i flussi di lavoro di Imaging

Questo protocollo fornisce una panoramica delle procedure per l'isolamento di RNA per la profilazione di trascrittomica di linfonodo tessuti da grandi animali, compresi i passaggi nell'identificazione e l'asportazione dei linfonodi da bestiame e animali selvatici, approcci di campionamento per garantire la consistenza attraverso più animali e considerazioni più risultati rappresentativi per la conservazione post-raccolta e l'elaborazione per l'analisi del RNA.

Raccolta e trattamento dei linfonodi da grandi animali per l'analisi del RNA: preparazione per gli studi di trascrittomica di linfonodo di grandi specie animali

Nell'era dell'immunoterapia del cancro, l'interesse nel chiarire le dinamiche del microambiente tumorale è aumentato in modo sorprendente. Questo protocollo descrive in dettaglio una tecnica di imaging con spettrometria di massa rispetto alle sue fasi di colorazione e imaging, che consentono un'analisi spaziale altamente multiplexata.

Espansione della comprensione del microambiente tumorale mediante spettrometria di massa Imaging di campioni di tessuto fissati in formalina e incorporati in paraffina

Qui, stabiliamo un metodo proteomico basato sulla spettrometria di massa utilizzando regioni isolate di interesse in sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina. Questo protocollo viene utilizzato per analizzare il proteoma proveniente da specifiche aree tissutali in sezioni di tessuto archiviate fissate in formalina e incluse in paraffina.

Un approccio semplificato per la proteomica basata sulla spettrometria di massa utilizzando regioni tissutali selezionate

Questo video dimostra la preparazione di un ultra-sottile matrice / analita strato per l'analisi dei peptidi e proteine ​​da Matrix-Assisted Laser ionizzazione di desorbimento spettrometria di massa (MALDI-MS).

MALDI Preparazione del campione: il metodo ultra sottile strato

In questo video, si dimostra un metodo per la separazione elettroforetica di proteine ​​mediante poli-acrylimide elettroforesi su gel (PAG).

Separazione elettroforetica delle proteine

Impara la preparazione proteomica di tessuti FFPE tramite microdissezione laser e digestione multi-enzimatica FASP. Questo protocollo consente l'analisi quantitativa del proteoma fino a 10.000 proteine da campioni clinici microscopici.

Preparazione del campione proteomica dalla fissati in formalina e incluso in paraffina Tissue

Esplora altri video