Preparazione del campione proteomica dalla fissati in formalina e incluso in paraffina Tissue

L'obiettivo generale di questa procedura è generare e pre-frazionare peptidi da materiale fissato in formalina e in paraffina, o FFPE, per l'analisi proteomica. Ciò si ottiene isolando il tessuto desiderato mediante microdissezione, seguito dalla lisi cellulare. Il secondo passaggio consiste nel generare peptidi attraverso l'elaborazione del campione.

Utilizzo della preparazione del campione assistita da filtro con digestione multi-enzimatica. I peptidi vengono quindi quantificati misurandone la fluorescenza del triptofano. L'ultimo passaggio consiste nella frazionamento dei peptidi mediante una tecnica di separazione basata su scambio anionico forte per il frazionamento dei peptidi.

In definitiva, i campioni preparati permettono l'analisi di proteomi ottenuti da quantità minime di materiale fino a una profondità di 10.000 proteine. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la digestione in gel o in soluzione, è che essa è applicabile a piccole quantità di campioni clinici, come cellule ottenute mediante microdissezione laser. Il metodo fornisce campioni contenenti peptidi perfetti e puri.

Che cosa facilita l'esplorazione proteomica dei tessuti umani e delle malattie? L'intero protocollo consiste in tecniche sviluppate e pubblicate in passato. Queste includono fasp ad alto recupero, pipet tip ation e la determinazione del contenuto peptidico basata sulla fluorescenza del triptofano, dimostrando che la procedura sarà Mrs.

La dottoressa Catina, tecnico del nostro laboratorio, inizia a preparare sezioni di tessuto per la microdissezione tagliando sezioni con un microtomo. Lo spessore delle sezioni dipende dal campione. Di solito, la microdissezione funziona bene con sezioni di sette a dieci micrometri.

Dopo aver irradiato le lamelle con luce UV per 45 minuti, montare i tagli su di esse prima di farle asciugare a 37 gradi Celsius per due ore. Deparaffinare i preparati montati mediante due incubazioni successive in barattoli consecutivi di xilolo per due minuti e mezzo e un minuto e mezzo. Quindi reidratare i tagli in modo consecutivo.

Incubazioni di un minuto in etanolo assoluto, etanolo al 70% e, infine, in acqua. Dopo la colorazione delle sezioni con ematina di Meyer per 20 secondi.

Risciacquare con acqua per un minuto e lasciare asciugare all'aria. Raccogliere la popolazione cellulare di interesse mediante un sistema di microdissezione laser. Quando si utilizza lo strumento palm, raccogliere i campioni nei tappi adesivi usando tre microlitri di tampone di lisi dei tessuti per 10 nanolitri di tessuto microdissecato.

Applicare il buffer al materiale microdissecato nel cappuccio e chiudere il tubo. Raccogliere la sospensione dopo una breve centrifugazione. Quindi lisare il tessuto microdissecato a 99 gradi Celsius in un blocco riscaldante con agitazione per un'ora.

Chiarire l'estratto grezzo mediante centrifugazione a 16.000 G e 18 gradi Celsius per 10 minuti. Mescolare fino a 50 microlitri del lisato chiarificato con 200 microlitri della soluzione UA in un'unità di ultrafiltrazione. Quindi centrifugare a 14.000 G fino a quando nel filtro rimangono meno di 10 microlitri di soluzione.

Di solito, questo passaggio richiede una centrifugazione di 10-15 minuti. Successivamente, pipettare 200 microlitri della soluzione UA nell'unità di ultrafiltrazione e centrifugare. Come in precedenza, svuotare il tubo di raccolta prima di pipettare 50 microlitri della soluzione IAA nell'unità di ultrafiltrazione.

Mescolare a 600 giri/min in un termoagitatatore a temperatura ambiente per un minuto e centrifugare. Come in precedenza, proseguire con i passaggi di ultrafiltrazione e centrifugazione come indicato nel protocollo scritto allegato a questo video. Successivamente, trasferire le unità di filtrazione in nuove provette di raccolta.

Pipettare 40 microlitri di buffer di digestione con endoproteinasia lic C prima di mescolare a 600 RPM nel termo-miscelatore per un minuto. Incubare le unità in una camera umida a 37 gradi Celsius per 18 ore. Dopo aver centrifugato le unità filtranti come fatto in precedenza, pipettare 160 microlitri del buffer DB e centrifugare.

Le unità filtranti attraverso cui passa il flusso combinato contengono i peptidi rilasciati dalla proteasi endo lic C. Successivamente, raccogliere i peptidi triptici come descritto nel protocollo testuale. La misurazione del contenuto peptidico nei digesti proteici può essere eseguita in tampone diluito poiché i residui di triptofano sono ben accessibili al solvente. Per quantificare i peptidi, pipettare prima 0,2 millilitri di tampone per saggio DB nella cuvetta di quarzo Q.

Quindi posizionare il Q vet nel portacampioni dello strumento qve e registrare lo spettro di emissione per il bianco. Preparare una curva di calibrazione utilizzando incrementi di 0,1 microgrammi aggiungendo aliquote di un microlitro della soluzione standard di triptofano al Q vet e mescolando delicatamente con il buffer db. Dopo aver pulito il Q vet, pipettare il campione e registrare lo spettro del campione.

Procedere al calcolo della concentrazione di proteine e peptidi come descritto nel protocollo testuale prima della frazionatura. Preparare la colonna a punta SAX impilando sei strati di membrana ionica EM.Import in una comune punta da pipetta da 0,2 millilitri. Preparare due colonne a punta SAX per ogni campione.

Successivamente, preparare la punta a gradini impilando tre strati di M quattro C 18. In una punta da pipetta di 0,2 millilitri, preparare sei punte a gradini per ogni campione. Per iniziare.

Effettuare la frazionatura diluendo le soluzioni peptidiche ottenute mediante digestione con ly C con 0,2 millilitri di tampone universale BRI e Robinson a pH 11. Analogamente, diluire le soluzioni peptidiche ottenute mediante digestione con tripsina con 0,2 millilitri di tampone universale BRI e Robinson a pH 5. Assemblare la colonna a punta SAX nel coperchio dell'adattatore per provetta centrifuga prima di lavare ed equilibrare la colonna a punta SAX e le punte a stadio C18 come descritto nel protocollo testuale.

Successivamente, assemblare la colonna a punta SAX nella punta di tipo C 18. Caricare le soluzioni campione nelle colonne a punta SAX equilibrate e centrifugare le colonne a 5.000 G per tre minuti. Lavare le colonne a punta con 0,1 millilitri dei campioni diluiti.

Facilitare il flusso mediante centrifugazione a 5.000 G. Trasferire la colonna a punta SAX allo stadio C18 successivo e continuare ad eluire i peptidi come descritto nel protocollo testuale. Dopo aver lavato le punte a stadio C18 con 0,05 millilitri di tampone A, eluire le frazioni con 0,05 millilitri di tampone B in vial, successivamente utilizzati per l'iniezione dei campioni in un sistema di cromatografia liquida assemblato con uno spettrometro di massa rappresentativo. Qui vengono mostrati i risultati dell'estrazione proteica e della digestione.

La lisi di 250 nanolitri di tessuto, corrispondenti a un'area microdissecata di 25 millimetri quadrati da una sezione di 10 micrometri, produce circa 45 microgrammi di proteine totali dopo la digestione consecutiva in due passaggi nel formato fast con l'endoproteasi slice C e tripsina, ottenendo rese superiori al 50% delle proteine totali. Qui viene mostrata una misurazione rappresentativa della concentrazione di peptidi mediante fluorescenza; gli spettri del campione e dello standard di triptofano mostrano massimi compresi tra 350 e 360 nanometri. L'intensità della fluorescenza è proporzionale al contenuto di triptofano.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare campioni da tessuti ad alto contenuto per l'analisi proteomica utilizzando la tecnica di microdissezione, l'elaborazione del campione e la frazionatura dei peptidi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore, più il tempo necessario per la digestione delle proteine. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare sezioni di tessuto appena preparate dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della proteomica per esplorare i proteomi di tessuti e cellule e le anomalie nell'uomo utilizzando materiali fissati e inclusi in paraffina.