Preparazione del campione proteomica dalla fissati in formalina e incluso in paraffina Tissue

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare e prefrazionare peptidi da materiale formale e fisso e incluso in paraffina o FFPE per l'analisi proteomica. Ciò si ottiene isolando il tessuto desiderato mediante microdissezione, seguita da lisi cellulare. Il secondo passo consiste nel generare peptidi mediante l'elaborazione del campione.

L'uso del filtro di digestione multienzimatico ha aiutato la preparazione del campione. I peptidi vengono quindi quantificati misurando la loro fluorescenza del triptofano. La fase finale è il frazionamento dei peptidi utilizzando una tecnica di separazione basata su scambiatore anionico forte per il frazionamento dei peptidi.

In definitiva, i campioni preparati consentono l'analisi dei proteomi da piccole quantità di materiale a una profondità di 10.000 proteine. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la digestione in gel o in soluzione, è che è applicabile a piccole quantità di campioni clinici come le cellule laser di microdissezione. Il metodo fornisce campioni contenenti peptidi perfetti e puri.

Cosa facilita l'esplorazione proteomica dei tessuti umani e delle malattie? L'intero protocollo è costituito da tecniche sviluppate e pubblicate in passato. Questi includono l'alto recupero fasp, la punta della pipetta e la determinazione del contenuto di peptidi basata sulla fluorescenza del triptofano dimostrando che la procedura sarà la signora

Catina a sistemare un tecnico del nostro laboratorio per iniziare a preparare fette di tessuto per sezioni di taglio microdisect con un microtomo. Lo spessore delle fette dipende dal campione. Di solito la microdissezione funziona bene con fette da sette a 10 micrometri.

Dopo aver irradiato i vetrini della membrana con luce UV per 45 minuti, montare le sezioni su di essi prima di asciugarli a 37 gradi Celsius per due ore. Separare le sezioni montate mediante due incubazioni successive in barattoli consecutivi di xilene per due minuti e mezzo e un minuto e mezzo. Quindi reidratare le sezioni consecutivamente.

Incubazioni di un minuto in etanolo assoluto, etanolo al 70%. E infine, l'acqua. Dopo aver colorato le sezioni con l'ematina di Meyer per 20 secondi.

Sciacquare con acqua per un minuto e lasciare asciugare all'aria. Raccogli la popolazione cellulare di interesse utilizzando un sistema di microdissezione a cattura laser. Quando si utilizza lo strumento palmare, raccogliere i campioni nei cappucci adesivi utilizzando tre microlitri di tampone di lisi tissutale per 10 nanolitri di tessuto microdisetto.

Applicare il tampone sul materiale microsezionato nel tappo e chiudere la provetta. Raccogliere la sospensione dopo una breve centrifugazione. Quindi pidocchiare il tessuto microsezionato a 99 gradi Celsius in un blocco riscaldante con agitazione per un'ora.

Chiarificare l'estratto grezzo mediante centrifugazione a 16.000 g e 18 gradi Celsius per 10 minuti. Miscelare fino a 50 microlitri di lisato chiarificato con 200 microlitri di soluzione di UA in un'unità di ultrafiltrazione. Quindi centrifugare a 14.000 GS fino a quando nel filtro rimangono meno di 10 microlitri di soluzione.

Di solito questo passaggio richiede dai 10 ai 15 minuti di centrifugazione. Successivamente, pipettare 200 microlitri della soluzione UA nell'unità di ultrafiltrazione e nella centrifuga. Come in precedenza, svuotare la provetta di raccolta prima di pipettare 50 microlitri della soluzione I A nell'unità di ultrafiltrazione.

Mescolare a 600 RPM in un termo mixer a temperatura ambiente per un minuto e centrifugare. Come in precedenza, continuare le fasi di ultrafiltrazione e centrifugazione come indicato nel protocollo di testo che accompagna questo video. Quindi trasferire le unità di filtrazione in nuove provette di raccolta.

Pipettare 40 microlitri di tampone digestivo con endo proteinasi lic C prima di miscelare a 600 giri/min nel termomiscelatore per un minuto. Incubare le unità in una camera umida a 37 gradi Celsius per 18 ore. Dopo aver centrifugato le unità filtranti come fatto in precedenza, pipettare 160 microlitri del tampone DB e centrifugare.

Le unità filtranti attraverso le quali il flusso aggregato contiene i peptidi rilasciati dall'endo proteasi lic C.Successivamente raccolgono i peptidi del trittico come descritto nel protocollo di testo. La misurazione del contenuto di peptidi nei digestati proteici può essere eseguita in tampone diluito perché i residui di triptofano sono ben accessibili al solvente. Per quantificare i peptidi, prima pipettare 0,2 millilitri di tampone di saggio DB nel quarzo Q vet.

Quindi posizionare il Q vet nel supporto qve dello strumento e registrare lo spettro di emissione per il grezzo. Preparare una curva di calibrazione utilizzando incrementi di 0,1 microgrammi aggiungendo un'aliquota di microlitro della soluzione standard di triptofano al Q vet e mescolando delicatamente con il tampone db. Dopo aver pulito il Q vet, pipettare il campione e registrare lo spettro del campione.

Procedere al calcolo della concentrazione di proteine e peptidi come descritto nel protocollo di testo prima del frazionamento. Prepara la colonna di punte SAX impilando sei strati di EM. Importare la membrana ionica in un comune puntale per pipette da 0,2 millilitri. Creare due colonne di punte SAX per campione.

Quindi, prepara la punta del palco impilando tre strati di M four C 18. In un puntale per pipetta da 0,2 millilitri, realizzare sei puntali di stadio per ogni campione. Iniziare.

Frazionamento: diluire le soluzioni peptidiche ottenute mediante digestione con ly C con 0,2 millilitri di BRI e tampone universale Robinson. pH 11: diluire in modo analogo le soluzioni peptidiche ottenute da digestioni con tripsina, con 0,2 millilitri di tampone universale Britain e Robinson. pH 5: assemblare la colonna di puntali SAX nel coperchio dell'adattatore per provette centrifughe prima del lavaggio e acquisire l'equilibratura della colonna di puntali SAX e delle punte dello stadio C 18 come indicato nel protocollo di testo.

Quindi, assemblare la colonna della punta SAX nella punta dello stadio C 18. Caricare le soluzioni campione nelle colonne di puntali SAX equilibrate e centrifugare le colonne a 5.000 Gs per tre minuti. Lavare le colonne dei puntali delle pipette con 0,1 millilitri di campioni diluiti.

Facilitare il flusso mediante centrifugazione a 5.000 Gs.Trasferire la colonna di puntali SAX al successivo puntale dello stadio C 18 e continuare a eluire i peptidi come descritto nel protocollo di testo. Dopo aver lavato i puntali dello stadio C 18 con 0,05 millilitri di tampone A, eluire le frazioni con 0,05 millilitri di tampone B in fiale, successivamente utilizzate per l'iniezione dei campioni in un sistema di cromatografia liquida assemblato con un rappresentante dello spettrometro di massa. I risultati dell'estrazione e della digestione delle proteine sono mostrati qui.

La lisi di 250 nanolitri di tessuto, che corrisponde a un'area micro sezionata di 25 millimetri quadrati da una fetta di 10 micrometri, si traduce in circa 45 microgrammi di proteine totali dopo la digestione consecutiva in due fasi nel formato a digiuno con la fetta C di endoproteasi e la tripsina si traduce in rese di oltre il 50% della proteina totale. Qui è mostrata una misurazione rappresentativa della fluorescenza del contenuto di peptidi, gli spettri dello standard di Trytophan e il campione mostra massimi da 350 a 360 nanometri. L'intensità della fluorescenza è proporzionale al contenuto di triptofano.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare campioni da tessuto alto per l'analisi proteomica utilizzando la tecnica di microdissezione, l'elaborazione dei campioni e il frazionamento dei peptidi Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore più il tempo necessario per l'indigestione delle proteine. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di utilizzare fette di tessuto appena preparate dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della proteomica per esplorare i proteomi di tessuti e cellule e le anomalie negli esseri umani utilizzando l'arval per materiale fisso e incorporato tra pareni.