Question 1

Cos'è un plasmide e perché viene utilizzato nella trasformazione batterica?

Accepted Answer

Un plasmide è una piccola molecola di DNA circolare a doppio filamento che può ridurre la sua dimensione attraverso il superavvolgimento, permettendogli di passare attraverso i pori della membrana cellulare batterica. I plasmidi contengono un sito di clonazione multiplo per l'inserimento Frammenti di DNA, un'origine di replicazione per la copia del DNA e un gene di resistenza agli antibiotici che permette alle cellule trasformate di sopravvivere in un terreno contenente antibiotici.

Question 2

Come fa il cloruro di calcio a rendere competenti le cellule batteriche?

Accepted Answer

Il cloruro di calcio crea un ambiente ricco di calcio dove gli ioni calcio positivi neutralizzano le cariche negative sia sul DNA plasmidico che sulla parete cellulare batterica. Questa neutralizzazione riduce la repulsione elettrostatica e indebolisce la parete cellulare, preparando le cellule ad assorbire il DNA estraneo durante la procedura di shock termico.

Question 3

Cosa succede durante la fase di shock termico della trasformazione batterica?

Accepted Answer

Un improvviso aumento di temperatura a 42°C per 30 secondi crea una differenza di pressione tra l'interno e l'esterno della cellula, inducendo la formazione di pori nella membrana batterica. Il DNA plasmidico superavvolto entra attraverso questi pori. Dopo lo shock termico, le cellule vengono immediatamente raffreddate sul ghiaccio, permettendo alla parete cellulare di auto-riparare e stabilizzare il plasmide all'interno.

Question 4

Che cos'è l'efficienza di trasformazione e come viene calcolata?

Accepted Answer

L'efficienza della trasformazione misura il tasso di successo della procedura di trasformazione. Viene calcolata dividendo il numero di trasformanti di successo (colonie contenenti il plasmide) per la quantità totale di DNA piattato. Questo parametro aiuta i ricercatori a valutare quanto efficacemente il metodo di shock termico ha introdotto i plasmidi nelle cellule batteriche.

Question 5

Come vengono preparate le cellule chimicamente competenti prima della trasformazione con shock termico?

Accepted Answer

I batteri vengono coltivati fino alla fase di log medio, quindi centrifugati e lavati più volte con soluzione di cloruro di calcio freddo per rimuovere il terreno di crescita. Dopo il lavaggio finale, le cellule vengono risospese in cloruro di calcio più 15% di glicerolo, distribuite in tubi per microcentrifuga e conservate a -80°C fino all'utilizzo per la trasformazione.

Question 6

Perché è importante la tecnica asettica durante la trasformazione batterica?

Accepted Answer

La tecnica asettica mantiene la sterilità durante tutta la procedura di trasformazione impedendo l'ingresso di contaminanti trasportati dall'aria nell'area di lavoro. Un bruciatore Bunsen sterilizza strumenti e reagenti creando allo stesso tempo una corrente di convezione che tiene lontani i contaminanti. Questo assicura che solo i batteri trasformati desiderati crescano sulle piastre di agar.

Question 7

Cosa succede dopo che i batteri trasformati sono stati piastre e qual è il passo successivo?

Accepted Answer

Le piastre vengono incubate durante la notte a 37°C capovolte per evitare l'esposizione alla condensa. Il giorno successivo, le colonie contenenti il plasmide sono visibili e possono essere contate per calcolare l'efficienza della trasformazione. Le colonie selezionate possono poi essere coltivate in un mezzo liquido contenente antibiotici per purificazione del plasmide isolamento e purificazione di DNA plasmidico per ulteriori esperimenti.

Trasformazione batterica: il metodo dello shock termico - Quiz di valutazione