Il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo Peripheral Nerve Injury

L'obiettivo generale di questa procedura è presentare un modello di trapianto cellulare basato sull'uso di cellule olfattive e cellule di rivestimento in un modello di lesione del nervo laringeo. Questo viene realizzato innanzitutto sezionando ed eseguendo l'anastomosi del nervo laringeo ricorrente. Successivamente, vengono trapiantate le cellule olfattive e di rivestimento ottenute dalla mucosa olfattiva o dai bulbi olfattivi.

Poi, due o tre mesi dopo l'intervento chirurgico, gli animali vengono valutati mediante laringoscopia ed elettromiografia. Infine, il nervo laringeo ricorrente viene isolato per studi istologici. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano come le cellule olfattive e le cellule di guaina migliorino la rigenerazione assonica del nervo laringeo ricorrente e il recupero funzionale delle corde vocali attraverso laringoscopia, elettromiografia e analisi istologiche.

Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo delle lesioni dei nervi periferici che riguardano la misurazione della crescita assonica e la capacità di quantificare la funzionalità del recupero. Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questo metodo incontra difficoltà, poiché l'anastomosi ricorrente dei nervi laringei richiede competenze microchirurgiche. Dopo aver generato colture primarie marcate con GFP di bulbi olfattivi (OB) e mucosa olfattiva (OM), come descritto nel protocollo scritto, prepararsi per l'intervento chirurgico autoclavando tutti gli strumenti.

Dopo aver anestetizzato il ratto mediante iniezione intraperitoneale di ketamina e clorpromazina, verificare il livello di sedazione effettuando una compressione del dito del piede. Rasare la zona chirurgica e posizionare il ratto in decubito dorsale, disinfettare la cute con lavaggi alternati di alcol e soluzione di Betadine. Successivamente, allestire un ambiente chirurgico sterile e mantenere procedure sterili per tutta la durata dell'intervento.

Utilizzare un bisturi per eseguire un'incisione cutanea cervicale media di due centimetri. Successivamente, seguendo la linea bianca mediana, effettuare un'incisione verticale dei muscoli ioidei inferiori utilizzando un retrattore ortostatico posizionato tra i muscoli ioidei inferiori. Esporre la laringe e quindi il nervo laringeo ricorrente o RLN.

Quindi, sotto un microscopio chirurgico, utilizzare forbici microchirurgiche per recidere completamente il nervo a livello del settimo anello tracheale con un punto di sutura 11 T. Eseguire l'anastomosi per denervare la laringe subito prima del trapianto. Utilizzare tripsina EDTA 0,05% per rimuovere le cellule OB e OM dalle piastre.

Quindi, per arrestare la digestione, aggiungere cinque millilitri di mezzo caldo dopo aver centrifugato le cellule a 432 G per cinque minuti. Utilizzare un citometro ematico per contare le cellule e regolare la concentrazione cellulare in questo modello tra 1,2 e sei volte 10 alla sesta cellule in 30 microlitri di D-M-E-M-F 12 utilizzati in un tubo da microcentrifuga. Preparare un rapporto da uno a due tra cellule e fattore di crescita, Matrigel ridotto e porre in ghiaccio poco prima del trapianto.

Rimuovere il tubo dal ghiaccio e tenerlo in mano per riscaldare la miscela. Utilizzando una pipetta, depositare la soluzione di cellule in Matrigel sul sito di anastomosi e lasciare che la miscela si autoassembli sul nervo lesionato una volta solidificata. Usare punti di sutura numero quattro per chiudere i muscoli e la pelle.

Posizionare il ratto in una gabbia individuale e mantenerlo sotto una lampada riscaldante per 24 ore. Somministrare analgesici per i successivi cinque giorni, circa due mesi dopo l'intervento chirurgico, dopo aver anestetizzato l'animale. Nei ratti, come descritto in precedenza in questo video, utilizzare una pinzatura del dito del piede per confermare la sedazione.

Posizionare il ratto in decubito dorsale prima di inserire un video con angolazione di 30 gradi. Regolare il laringoscopio a 30 gradi in modo da ottenere la migliore visione della laringe, riproducendo la stessa immagine per ogni registrazione. Identificare i punti di riferimento anatomici come la commessura posteriore, la corda vocale destra nel punto in cui si inserisce nell'apofisi vocale dell'OID e la corda vocale sinistra nel punto in cui si inserisce nell'ipotesi vocale dell'oid.

Registra i movimenti delle corde vocali selezionando tre sequenze di adduzione massima e abduzione massima successive. Per analizzare la funzione laringea, determina il movimento angolare assoluto misurando la differenza tra il movimento di massima adduzione e di massima abduzione delle corde vocali. Determina il punteggio dinamico misurando l'ampiezza del movimento e il punteggio funzionale misurando le sinchinesi e i movimenti paradossi per eseguire l'elettromiografia.

Posizionare un elettrodo sul muscolo ischiatico del ratto dopo aver esposto la laringe e la trachea, come dimostrato per l'anastomosi del nervo ricorrente. Esporre la cartilagine cricotiroidea. Successivamente, utilizzando forbici microchirurgiche, aprire la cartilagine cricotiroidea per esporre il muscolo cricotiroideo posteriore o muscolo PCA.

Inserire un elettrodo monopolarе a ago nel muscolo con l'animale in ventilazione spontanea. Utilizzare un sistema di acquisizione per registrare l'attività elettrica muscolare del muscolo PCA. Analizzare l'attività muscolare in termini di ricchezza e sincronizzazione con la respirazione assegnando un punteggio qualitativo da zero a tre utilizzando la seguente scala.

Zero corrisponde a un tracciato non provato senza aumento durante l'inspirazione. Uno corrisponde a un tracciato ritmico con aumento durante l'inspirazione, ma scarso; due corrisponde a un tracciato ritmico con attività più ricca; e tre corrisponde a un tracciato ritmico molto intenso, che costituisce un modello di interferenza simile a un'attività intenzionale massimale.

Successivamente, per evitare di danneggiare il nervo laringeo ricorrente a causa delle sue ridotte dimensioni, esporre il nervo vago, quindi applicare un elettrodo e stimolare in questo punto. Registrare la latenza e la durata del potenziale nel muscolo PCA. Infine, dopo l'eutanasia dell'animale mediante sovradosaggio di pentobarbital sotto microscopio, localizzare l'anastomosi, suturare ed asportare il moncone distale del nervo laringeo ricorrente compreso tra l'anastomosi e la laringe.

Eseguire l'analisi istologica secondo il protocollo testuale riportato qui di seguito dopo il trapianto di cellule da colture primarie di mucosa olfattiva e bulbi olfattivi, che sono esempi di tracce elettromiografiche ottenute nel muscolo PCA durante la respirazione. Gli animali del gruppo di controllo presentavano una ricca attività elettrica muscolare con un aumento durante l'inspirazione, che non era presente nel gruppo trattato con Rer. In questa figura, le analisi istologiche del nervo laringeo ricorrente (RLN) mediante colorazione con blu di toluidina mostrano profili tipici delle fibre provenienti da animali normali, riinnervati e trapiantati.

Questa misurazione permette la quantificazione del numero di fibre mielinizzate, della dimensione media delle fibre e dello spessore medio della mielina, come mostrato qui. Per completare le analisi istologiche, è stato effettuato il tracciamento delle cellule positive per GFP dopo il trapianto intranervoso nel nervo sciatico.

Questo sito è stato scelto piuttosto che il RLN perché le piccole dimensioni del nervo laringeo ricorrente impediscono il trapianto intranervoso. Un'anastomosi del nervo periferico ricorrente di alta qualità può essere eseguita in 15 minuti se effettuata correttamente dopo il suo sviluppo. Queste tecniche hanno aperto la strada ai ricercatori nel campo delle lesioni dei nervi periferici per esplorare l'uso del trapianto cellulare in un modello animale ratto.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trapiantare cellule nel modello di lesione ricorrente del nervo e valutare il recupero funzionale delle corde vocali mediante elettromiografia, endoscopia da laboratorio e analisi istologiche.