Name: Il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo Peripheral Nerve Injury (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Scopri il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo lesione del nervo laringeo ricorrente. Questo metodo utilizza laringoscopia ed elettromiografia per analizzare la rigenerazione assonale.

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Gli autori vorrebbero riconoscere ADIR (Aide à Domicile aux Insuffisants Respiratoires) e Fondation de l&#39;Avenir per il loro sostegno finanziario e al dottor Fanie Barnabé-Heider per la modifica del manoscritto.

1. Colture primarie di mucosa olfattiva e olfattiva Bulbi <ol><li> Prima di dissezione <ol><li> Fai medio, per 50 ml, con l&#39;aggiunta di 44 ml di calcio senza di Dulbecco Modified Eagle / medio di Ham F12 (DMEM/F12), supplementato con 5 ml di siero fetale bovino (FBS) e 1 ml di penicillina / streptomicina. </li><li> Coat 75 centimetri 2 palloni con poli-L-lisina (50 mcg / ml, 1,5 mg / cm 2), 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare boccette con PBS 1x. </li><li> Conservare i flaconi rivestiti in frigo per un massimo di 1 settimana. </li></ol></li><li> Dissezione <ol><li> Qualsiasi metodo di eutanasia deve essere preventivamente approvato dal cura degli animali e l&#39;uso comitato dell&#39;istituto e realizzato da personale qualificato. </li><li> Scegli ratti inbred come ratti Fischer. </li><li> Dopo il ratto è stato confermato essere entrato anestesia profonda con sodio pentobarbital o altre forme iniettabili di anestesia come la chetamina / xilazina, lui e r decapitareTogliete la pelle. </li><li> Aprire il cranio dalla anteriore alla parte posteriore. </li><li> Rimuovere la presa in carico OB per evitare le meningi. </li><li> Nella stessa ratto, aprire la cavità nasale sagittale. </li><li> Rimuovere l&#39;OM avendo cura di evitare la mucosa respiratoria. Si noti che l&#39;epitelio OM può essere facilmente identificato dal suo colore giallastro. </li><li> Protocolli ulteriormente dettagliate sulla dissezione di OM si possono trovare in una precedente <a href="https://www.jove.com/video/2762/isolating-nasal-olfactory-stem-cells-from-rodents-or-humans">J. Vis. Esp</a> . pubblicazione 13. </li></ol></li><li> Cultura <ol><li> Posizionare OB in soluzione tamponata di Hank sale (HBSS) contenente 0,1% di tripsina per 45 min a 37 ° C. </li><li> Posizionare OM in HBSS contenente 0,05% di collagenasi A per 45 min a 37 ° C. </li><li> Smettere di digestione enzimatica con l&#39;aggiunta di 2 ml di terreno caldo. </li><li> Lavare le cellule con mezzo e centrifugare a 300 xg per 3 min. </li><li> Campioni triturare di 2ml di terreno usando una pipetta P1000 fino ad ottenere una sospensione cellulare omogenea. </li><li> Piastra le cellule in fiasche pretrattate (5-10 x 10 6 cellule / fiasco) con 25 ml di terreno caldo. </li><li> Incubare e coltura le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Cambiare la metà del mezzo ogni 2 giorni. </li><li> Dopo 6-8 giorni in vitro, controllare la percentuale di p75 cellule positive su campioni di piccole cellule, presume essere OECs nei roditori, mediante citometria di flusso o immunocitochimica. Per queste analisi, altri marcatori possono essere studiati come GFAP e S100β. </li></ol></li><li> Citometria a flusso <ol><li> Raccogliere le celle come descritto in (sezione 2.2) &quot;trapianto cellulare&quot;. </li><li> Incubare con p75 anticorpo primario (1:100) durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule con 2 ml di PBS-EDTA e centrifugare a 300 xg per 3 min. </li><li> Incubare le cellule con PE anticorpo secondario anti-topo coniugato in 15min a 4 ° C al buio (1:200). </li><li> Lavare le cellule con 2 ml di PBS-EDTA e centrifugare a 300 xg per 3 min. </li><li> Risospendere le cellule in 500 microlitri di PBS-EDTA. </li><li> Analizzare 10-30 x 10 3 celle con flusso citometro. </li></ol></li><li> Analisi immunocitochimica <ol><li> Piastra le cellule in piastre da 6 pozzetti prerivestite per 48 ore come descritto in &quot;cultura&quot; (sezione 1.1.2 di seguito). </li><li> Lavare le cellule con PBS. </li><li> Fissare le cellule con PFA 4% per 15 min a RT. </li><li> Lavare le cellule con PBS. </li><li> Incubare le cellule con PBS / Triton X100 (0,1%) per 15 minuti a RT. </li><li> Lavare le cellule con PBS. </li><li> Incubare le cellule con anticorpi primari (1:200): p75, S100β e GFAP notte a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule con PBS. </li><li> Incubare le cellule con gli anticorpi secondari (1:500) per 1 ora a temperatura ambiente al buio. </li><li> Lavare le cellule con PBS. </li><li> Incubare le cellule con Hoechst 10 min a RT nel buio. </li><li> Lavare le cellule con PBS. </li><li> Analizzare le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza. </li></ol></li><li> Cellule GFP etichettatura <ol><li> Cinque giorni prima del trapianto, infettare culture OB e OM notte con vettore lentivirale ospitare rafforzata GFP (molteplicità di infezione: 20). </li><li> Prima del check trapianto su piccoli campioni il tasso di cellule GFP positive per citometria a flusso come descritto in precedenza in &quot;cultura&quot; (sezione 1.1). </li></ol></li></ol> 2. Chirurgia e Trapianti <ol><li> Ricorrente anastomosi nervo <ol><li> Tutti gli esperimenti con gli animali devono essere approvati preventivamente dalla cura degli animali e l&#39;uso comitato dell&#39;istituzione ed eseguite da personale qualificato. </li><li> Prima dell&#39;intervento autoclave tutti gli strumenti e mantenere la sterilità durante gli interventi chirurgici. </li><li> Anestetizzare ratto mediante iniezione intraperitoneale di ketamina cloridrato (12,5 mg / kg) e clorpromazina cloridrato (0,625 mg / kg). Valutare l&#39;adeguatezza di anestesia pizzico punta prima dell&#39;intervento. </li><li> Posizionare il ratto in decubito dorsale. </li><li> Eseguire una verticale di medie incisione cutanea cervicale due centimetri con un bisturi. </li><li> Eseguire un&#39;incisione verticale dei muscoli sottoioidei seguendo la linea bianca mediale. </li><li> Esporre laringe utilizzando divaricatore autostatico tra i muscoli sottoioidei. </li><li> Esporre il RLN. </li><li> Sotto il controllo microscopico, tagliare il nervo pienamente con microscissors a livello dell&#39;anello tracheale settima. </li><li> Eseguire anastomosi utilizzando un punto di 11,0 sutura sotto controllo microscopico. Questo intervento comporta una specifica denervazione motore della laringe. </li></ol></li><li> Il trapianto cellulare <ol><li> Appena prima del trapianto, rimuovere le cellule dalle stoviglie utilizzando 0,05% tripsina EDTA per 5 min a 37 ° C. </li><li> Smettere di digestione enzimatica con l&#39;aggiunta di 2 ml di terreno caldo. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 3 min. </li><li&gt; Al microscopio contare le cellule utilizzando un emocitometro e regolare la concentrazione cellulare secondo protocollo specifico. In questo modello, concentrazioni desiderate erano tra 1,2-6 x 10 6 cellule in 30 ml di DMEM/F12. </li><li> Fare la preparazione cellulare con 1:02 mix (30 e 60 microlitri in questo esperimento) di DMEM/F12-Matrige l in provetta da 1,5 ml prima di innesto e posizionarlo sul ghiaccio. Per evitare effetti non specifici, utilizzare il fattore di crescita ridotta Matrigel. </li><li> Appena prima del trapianto tenere il tubo in mano per pochi secondi a scaldare la Matrigel-medio impasto. </li><li> Deporre il mix sul sito anastomosi con una pipetta e attendere finché il composto auto-assembla sul nervo feriti. </li><li> Chiudere i muscoli e la pelle con una sutura 4.0. </li><li> Casa ratti individualmente e tenere sotto una lampada riscaldante per 24 ore. </li></ol></li></ol> 3. Valutazione <ol><li> Laringoscopia <ol><li> Anestetizzare ratti intraperitOneal iniezione di ketamina cloridrato (12,5 mg / kg) e clorpromazina cloridrato (0,625 mg / kg). Conferma ratti vengono anestetizzati con un pizzico punta prima di procedere con il protocollo. </li><li> Posizionare il ratto in decubito dorsale. </li><li> Inserire un 30 ° videolaryngoscope adeguati per fornire la migliore visione della laringe. Determinare punti di riferimento anatomici di riprodurre la stessa vista per ogni registrazione. </li><li> Registrare i movimenti delle corde vocali utilizzando il videolaryngoscope (5-10 sequenze / animale). Per ciascun animale selezionare tre sequenze successive di adduzione e abduzione massima massima. </li><li> Analizzare la funzione laringea utilizzando il software di analisi delle immagini. Determinare il movimento angolare assoluta misurando la differenza tra movimento di abduzione massima e adduzione massima delle corde vocali. Determinare punteggio dinamico misurando l&#39;ampiezza del movimento. Determinare il punteggio funzionale, misurando la synkinesis e movimenti paradossali. </li></ol></li><li> Elettromiografia (EMG) <ol><li&gt; Posizionare un elettrodo sui muscoli posteriori della coscia del ratto per l&#39;isolamento elettrico. </li><li> Esporre laringe e della trachea con l&#39;apertura della pelle e dei muscoli, come descritto in precedenza nella (sezione 2.1) &quot;anastomosi nervo ricorrente&quot;. </li><li> Esporre la cartilagine crico-tiroidea. </li><li> Aprire la cartilagine cricotiroidea per esporre il cricoarytenoid posteriore (PCA) del muscolo utilizzando microscissors. </li><li> Introdurre un elettrodo ad ago monopolare (38 x 0,45 millimetri) nel muscolo PCA. </li><li> Registrare l&#39;attività muscolare elettrica del muscolo PCA utilizzando un sistema di acquisizione durante la ventilazione spontanea. </li><li> Analizzare l&#39;attività muscolare in termini di ricchezza e la sincronizzazione con il respiro. Per analizzare EMG, assegnare un punteggio qualitativo 0-3 usando la seguente scala: 0: tracciato senza rima, senza aumento durante l&#39;inspirazione, 1: rima tracciando con inspiratori in aumento, ma povero tracing (Neurogen), 2: rima tracciando con l&#39;attività più ricchi, 3: rima rintracciamento, molto ricco, che costituisce un iReticolo nterferenze, simile ad una massima attività intenzionale. </li><li> Esporre il nervo vago per misurare la durata latenza e potenzialità. Il nervo vago è scelta come sede della stimolazione perché RLN può essere danneggiato durante la stimolazione grazie alle sue piccole dimensioni. </li><li> Stimolare il nervo vago con un elettrodo. </li><li> Registrare i segnali elettrici nel muscolo PCA. Misurare la latenza e la durata del potenziale. Se possibile utilizzare un modulo di acquisizione per registrare l&#39;attività muscolare, la latenza e la durata potenziale come il sistema Powerlab. </li></ol></li><li> Istologia <ol><li> Euthanize l&#39;animale con overdose di pentobarbital. </li><li> Rimuovere il moncone distale del RLN sotto controllo microscopico. La parte distale del RLN è definita come la parte tra anastomosi e della laringe. Si noti che è possibile trovare il sito di anastomosi diverse settimane dopo l&#39;intervento chirurgico perché il 11.0 sutura è una sutura non assorbibile. </li><li> Posizionare la porzione distale del RLN in 2% glutaraldeide 0,1 M fosfato(PH = 7,3) per 2 ore a 4 ° C. </li><li> Orientare con attenzione i campioni per realizzare sezioni coronali. </li><li> Lavare campioni in tampone fosfato. </li><li> Tagliare in segmenti più piccoli (3-4 mm di lunghezza) e postfix per 60 minuti a temperatura ambiente in 1% cacodilato tamponata OsO 4 e disidratate con etanolo. </li><li> Campioni orientare in stampi in silicone e incorporato in resine consistenti in POLYBED 812, DDSA e MNA, a cui è stato aggiunto il 2% di acceleratore BDMA. </li><li> Fai sezioni trasversali semi-sottile (1μm di spessore) con un ultramicrotomia sistema Pyramitome. </li><li> Colorazione con blu di toluidina 0,1% in 1% tetraborato di sodio per 75 sec a 70 ° C. </li><li> Analizzare campioni RLN con un sistema di analisi di conteggio. Contare il numero di fibre e misurare profili di fibre nervose mielinizzate determinando il contorno esterno e interno della guaina mielinica. </li></ol></li><li> Trapianto <ol><li> Preparazione delle cellule per il trapianto e trapianto di cellule come precedentemente descrittoin &quot;Il trapianto cellulare&quot; (paragrafo 2.2). </li><li> Analisi </li><li> Euthanize l&#39;animale con overdose di pentobarbital. Si noti che la fissazione degli animali può essere eseguita utilizzando iniezione intracardiaca di PFA 4%. </li><li> Rimuovere circa 2 cm di RLN. Utilizzare prossimale e parti distali del RLN. </li><li> Fissare campione RLN in azoto liquido. </li><li> Conservare i campioni a -80 ° C. </li><li> I campioni tagliati longitudinalmente con criostato (spessore 10-20 micron). </li><li> Analizzare i campioni al microscopio a fluorescenza per rilevare le cellule GFP positive. Si noti che l&#39;anticorpo anti-GFP può essere usato per aumentare emissione di fluorescenza ed effettuare costainings. </li></ol></li></ol>

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<li>Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+of+purification+for+establishing+primary+cultures+of+ensheathing+cells+from+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb.</a> Glia. 34, 81-87 (2001).</li>
<li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li>
<li>Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Although+olfactory+ensheathing+cells+have+remarkable+potential+to+sustain+nerve+regeneration%2C+they+cannot+be+applied+to+a+severe+vagus+nerve+section%2Fresection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model.</a> Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le tecniche qui presentate fanno OECs un modello utile per studiare trapianti cellulari in modelli di lesione dei nervi periferici. Il protocollo di coltura cellulare è relativamente semplice e può essere facilmente effettuata. D&#39;altro canto, le procedure chirurgiche, in particolare la sezione / anastomosi del RLN, richiedono esperienza e devono essere eseguite da personale qualificato. Le procedure descritte in questo protocollo evidenziano fattori importanti per concentrarsi su al fine...

Il sistema olfattivo primario è composto di due parti distinte: la mucosa olfattiva (OM) nel sistema nervoso periferico e il bulbo olfattivo (OB) nel sistema nervoso centrale. Il sistema olfattivo primario è caratterizzato dalla capacità dei neuroni olfattivi primari (PON) auto-di rinnovare tutta la vita in specie di mammiferi. Questa capacità è reso possibile grazie alla presenza di cellule staminali neurali nel OM. La crescita PON e la ricrescita da OM a OB è facilitata dalle cellule gliali specializzate chiamate cellule ensheathing olfattive (OECs). OECs sono cellule della cresta neurale che creano un microambiente favorevole per la neurogenesi del PON da OM a OB 1. In tal modo, OECs può essere trovato in OM e in OB costituendo diverse sottopopolazioni di cellule 2,3. Le diverse proprietà di OECs gli scienziati hanno di piombo per usarli per trapianti cellulari in diversi paradigmi sistema nervoso lesione 4. Infatti, OECs fattori di crescita prodotti, ridurre spaventare gliali, prOmote ricrescita assonale, e può mescolarsi liberamente con astrociti 5,6. Tuttavia, la stragrande maggioranza di questi studi si basano su lesioni del midollo spinale (SCI), pochi di loro hanno usato OECs dopo la lesione del nervo periferico (PNI) 7,8. Sebbene il sistema nervoso periferico ha una grande capacità di rigenerarsi dopo una lesione del nervo, sezioni complete indurre aberrante assonale ricrescita. Infatti, dopo transections complete del viso o dei nervi laringei ricorrenti (RLN) assoni pervenute all&#39;indirizzo sbagliato causano cocontractions muscolari chiamati synkinesis. Pertanto è di primaria importanza per proporre un modello di PNI quantificare non solo ricrescita assonale ma anche per valutare l&#39;efficienza delle contrazioni muscolari. Nella letteratura il modello più comune descritto è basato sulla lesione del nervo facciale 9,10. In questo modello, valutazioni funzionali sono basati sul recupero dei movimenti whisker 10. Tuttavia è complicato per dimostrare l&#39;efficacia del movENTI e discriminare i fenomeni cocontractions muscolari. Proponiamo qui un modello basato su una lesione RLN. Questo modello permette di valutare non solo la ricrescita degli assoni e dei movimenti delle corde vocali, ma anche l&#39;efficienza e la funzionalità di questi movimenti dopo trapianti cellulari 11,12. Questo protocollo fornisce una procedura passo passo alla cultura e trapianto OECs da OM e OB in un modello sezione RLN / anastomosi e di valutare animali dopo l&#39;intervento chirurgico.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>E3521T</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>E3387M</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>1152-8876</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>M3467Y</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>M3513P</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato</td><td>Merck</td><td>1.03256.0100</td><td></td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Biovalley</td><td>00563-450</td><td></td></tr><tr><td>MNA</td><td>Biovalley</td><td>00886-450</td><td></td></tr><tr><td>BDMA</td><td>Biovalley</td><td>00141-100</td><td></td></tr><tr><td>Polybed 812</td><td>Biovalley</td><td>08791-500</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-topo&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>550589</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR</td><td>BD Bioscience</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti P75</td><td>Chemicon</td><td>MAB 365</td><td></td></tr><tr><td>11.0 Filo</td><td>Ethicon</td><td>FG 2881</td><td></td></tr><tr><td>Blu Toluidina...</td><td>Ral Diagnostics</td><td>361590-0025</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Sigma</td><td>Sigma 2-16PK</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cappa a flusso laminare</td><td>Faster</td><td>BH-EN 2003 S Citometro</td><td></td></tr><tr>a<td>flusso</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Videolaringoscopio</td><td>Karl Storz Endoskope</td><td>Telecam SL NLSC 20212120</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione</td><td>AD Instruments</td><td>Powerlab</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di ultramicrotomia piramitomo</td><td>Leica</td><td>Ultracut S</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di analisi delle immagini</td><td>Explora Nova</td><td>Mercator</td><td></td></tr></tbody></table>

il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo peripheral nerve injury

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

<html> Cellule ensheathing olfattive (OECs) sono cellule della cresta neurale che permettono la crescita e ricrescita dei neuroni olfattivi primari. Infatti, il sistema olfattivo primario è caratterizzato dalla sua capacità di dare origine a nuovi neuroni anche in animali adulti. Questa particolare abilità è in parte dovuta alla presenza di OECs che creano un microambiente favorevole per neurogenesi. Questa struttura di OECs è stato usato per il trapianto cellulare come nei modelli di lesione del midollo spinale. Sebbene il sistema nervoso periferico ha una maggiore capacità di rigenerare dopo lesione del nervo rispetto al sistema nervoso centrale, sezioni complete indurre misrouting durante ricrescita assonale in particolare dopo facciale di transezione del nervo laringeo. In particolare, pieno sezionamento del nervo laringeo ricorrente (RLN) induce aberrante ricrescita assonale conseguente synkinesis delle corde vocali. In questo modello specifico, abbiamo dimostrato che OECs trapianto aumenta efficacemente la ricrescita assonale. ve_content &quot;&gt; OECs sono costituiti da diverse sottopopolazioni presenti sia nella mucosa olfattiva (OM-OECs) e bulbo olfattivo (OB-OECs). Presentiamo qui un modello di trapianto cellulare basata sull&#39;uso di questi differenti sottopopolazioni di OECs in un modello di lesione RLN. Utilizzando questo paradigma, colture primarie di OB-OECs e OM-OECs sono stati trapiantati in Matrigel dopo la sezione e anastomosi del RLN. due mesi dopo l&#39;intervento, abbiamo valutato animali trapiantati da analisi complementari sulla base di videolaryngoscopy, elettromiografia (EMG) , e studi istologici. Innanzitutto, videolaryngoscopy permesso di valutare le funzioni della laringe, in particolare cocontractions muscolari fenomeni. Poi, EMG analizza dimostrato ricchezza e la sincronizzazione delle attività muscolari. Infine, studi istologici basato su colorazione blu di toluidina permesso la quantificazione del numero e profilo di fibre mieliniche. Tutti insieme, si descrive qui come isolare, cultura, identify e trapianto OECs da OM e OB dopo RLN sezione-anastomosi e come valutare e analizzare l&#39;efficienza di queste cellule trapiantate sulle funzioni ricrescita e laringei assonale.

Illustrazioni di controllo e reinnervated (sezione / anastomizzata) gli animali sono stati scelti come i risultati possono variare a seconda delle trapianti cellulari effettuati (OM, OB o OM + OB). Coltura cellulare Le cellule aderiscono rapidamente alla superficie plastica e divenne segregata in andane parallele di cellule che sono allungate o rastremata, triangolare, multipolare, o forma-mandrino (Figure 1A e 1B). Dopo 8 giorni in vitro</...

Cellule ensheathing olfattive (OECs) sono cellule della cresta neurale che permettono la crescita dei neuroni olfattivi primari. Questa proprietà specifica può essere utilizzato per il trapianto cellulare. Presentiamo qui un modello di trapianto cellulare basata sull&#39;uso di OECs in un modello di lesione del nervo laringeo.

Il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

L'obiettivo generale di questa procedura è presentare un modello di trapianto cellulare basato sull'uso di cellule olfattive e cellule di rivestimento in un modello di lesione del nervo laringeo. Questo viene realizzato innanzitutto sezionando ed eseguendo l'anastomosi del nervo laringeo ricorrente. Successivamente, vengono trapiantate le cellule olfattive e di rivestimento ottenute dalla mucosa olfattiva o dai bulbi olfattivi.Poi, due o tre mesi dopo l'intervento chirurgico, gli animali vengono valutati mediante laringoscopia ed elettromiografia. Infine, il nervo laringeo ricorrente viene isolato per studi istologici. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano come le cellule olfattive e le cellule di guaina migliorino la rigenerazione assonica del nervo laringeo ricorrente e il recupero funzionale delle corde vocali attraverso laringoscopia, elettromiografia e analisi istologiche.Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo delle lesioni dei nervi periferici che riguardano la misurazione della crescita assonica e la capacità di quantificare la funzionalità del recupero. Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questo metodo incontra di

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Lesione traumatica al midollo spinale interrompe la comunicazione con il cervello. Per ripristinare la connettività perso utilizziamo un innesto del nervo periferico di fornire un substrato per la rigenerazione delle fibre in combinazione con fattori neurotrofici e matrice di modulazione degli enzimi per rimuovere molecole inibitrici per promuovere la crescita a lunga distanza.

La combinazione di innesto del nervo periferico e Matrix modulazione di riparare il cavo feriti Rat spinale

Descriviamo qui un metodo per biopsying mucosa olfattiva di ratto e umano cavità nasali. Queste biopsie può essere usato sia per identificare le anomalie molecolari nelle malattie cerebrali o isolare le cellule staminali adulte multipotenti che possono essere utilizzati per il trapianto di cellule in modelli animali di trauma cerebrale /...

Isolare cellule staminali olfattivo nasale da roditori o Umani

Questo video mostra la procedura per isolare i neuroni gangliari retinici (RGN) dalla retina di un ratto e cocoltivarli con cellule gliali che inguainano l'olfatto. Questo metodo consente di studiare il potenziale neuro-rigenerativo degli OEG dopo una lesione neurale.

Coculturazione dei neuroni gangliari retinici con glia inguainante olfattiva

Fonte: Portela-Lomba, M., et. al. Cocoltura di neuroni gangliari retinici di ratto assotomizzati con glia inguainante olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assonale adulta. J. Vis. Exp. (2020).Questo video dimostra l'imaging e la quantificazione della rigenerazione assonale in neuroni gangliari retinici di ratto axotomizzati (RGN) co-coltivati con cellule gliali di rivestimento olfattivo umano immortalizzate. Gli RGN sono immunomarcati, con soma rossi e assoni verdi. Le immagini...

Imaging e quantificazione della rigenerazione assonale nei neuroni del ganglio retinico di ratto assotomizzati

L'analisi delle proprietà fisiologiche dei neuroni sensoriali olfattivi incontra ancora limitazioni tecniche. Qui li registriamo attraverso un patch-clamp perforato in una preparazione intatta dell'epitelio olfattivo in topi geneticamente mirati. Questa tecnica consente la caratterizzazione delle proprietà di membrana e delle risposte a specifici ligandi di neuroni che esprimono recettori olfattivi definiti.

Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

Questo articolo descrive una tecnica per inserire un cavo condotto tra i ceppi del midollo spinale dopo il transection completo e riempimento con cellule di Schwann (SCs) e matrice di iniettabili della membrana basale al fine di colmare e promuovere la rigenerazione degli assoni attraverso il gap.

Trapianto di Schwann Cells PVDF-TrFE condotto a ponte ratto Transected del midollo spinale ceppi per promuovere la rigenerazione degli assoni attraverso il Gap

Questo protocollo presenta un modello robusto e riproducibile di allotransplant composito vascolarizzato (VCA) orientato allo studio simultaneo dell'immunologia e del recupero funzionale. Il tempo investito in una tecnica meticolosa in un trapianto ortotopico dell'arto posteriore della coscia destra con anastomose vascolari cucite a mano e coaptation neurale produce la capacità di studiare il recupero funzionale.

Fare il passo successivo: un modello di trapianto di arto hind di coaptation neurale per massimizzare il recupero funzionale nel ratto

Presentiamo un modello in vitro per valutare la capacità neuroregenerativa olfattiva di glia (OEG), dopo la lesione neurale. Si basa su una cocultura di neuroni ganglionali della retina adulta assotomizzati (RGN) su monostrati OEG e sul successivo studio della rigenerazione assonale, analizzando marcatori assonali e somatodendritici RGN.

Cocultura di neuroni ganglionali retini di ratto axotomizzati con glia ensheathing olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assionale adulta

Gangli spinali (DRG) sono strutture che contengono i neuroni sensoriali del sistema nervoso periferico. Quando dissociato, possono essere co-coltura con cellule staminali derivate da tessuto adiposo SC-like (ASC), che fornisce un modello valido per lo studio in vitro rigenerazione e mielinizzazione nervo, imitando l'ambiente in vivo presso il sito di lesione.

Gangli neuroni e cellule staminali derivate da tessuto adiposo differenziata: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-coltura modello per studiare Peripheral Nerve Regeneration

Girini di Xenopus offrono una piattaforma unica per studiare la funzione del sistema nervoso in vivo. Descriviamo le metodologie per valutare l'elaborazione di informazioni olfattive in vita Xenopus larve in normali condizioni di allevamento o dopo la ferita.

Valutazione funzionale delle vie olfattive in girini di Xenopus vivente

Scopri il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo lesione del nervo laringeo ricorrente. Questo metodo utilizza laringoscopia ed elettromiografia per analizzare la rigenerazione assonale.

Il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo Peripheral Nerve Injury

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