L'uso di Citometria immagine per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i lieviti patogeni in associazione con le cellule ospiti senza placcare le unità formanti colonie. In primo luogo, infettare le cellule macrofagiche con la capsula H o le cellule di lievito C albicans colorare le cellule macrofagiche infette con arancia aina e ioduro di propidio per evidenziare le cellule di lievito vitali. Quindi, utilizzando un citometro per immagini, acquisisci una serie di immagini e analizza i parametri di dimensione e forma per enumerare con precisione le cellule di lievito.

I risultati della citometria per immagini possono essere utilizzati efficacemente per quantificare i lieviti patogeni in associazione con le cellule ospiti. Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta durante la ricerca nel campo della patogenesi fungina, in cui dovevo ripetutamente placcare e contare le unità formanti colonie per la quantificazione della capsula di istoplasma del fungo patogeno. Il vantaggio principale della citometria per immagini rispetto al metodo standard di enumerazione delle CFU è la sua maggiore velocità, in quanto elimina le fasi laboriose e dispendiose in termini di tempo per la piastratura, l'incubazione e il conteggio di più diluizioni seriali di CFU Quando si confronta la crescita di ceppi wild type e mutanti all'interno delle cellule ospiti.

Questo metodo elimina le potenziali distorsioni introdotte dalle diverse capacità di avviare una crescita di qualità su terreni solidi. In generale, le persone che non conoscono questo metodo potrebbero essere messe alla prova dalla citometria per immagini. Strumentazione e software.

Iniziare la procedura coltivando i macrofagi alla densità desiderata. In piastre a 24 pozzetti aggiungere le cellule fungine in fase logaritmica di crescita, quindi incubare per 90 minuti per consentire la fagocitosi. Successivamente, lavare i macrofagi tre volte con PBS per rimuovere i funghi extracellulari incubati per i punti temporali definiti sperimentalmente prima dell'analisi del campione a bassa molteplicità di infezione, le cellule macrofagiche infette rimangono vitali per diversi giorni e i campioni possono essere analizzati circa ogni 12-24 ore.

Dopo tre lavaggi con PBS, aggiungere 0,5 millilitri di acqua sterile alle cellule macrofagiche infette. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per liberare i funghi dalle cellule dei macrofagi. Quindi raccogliere il lisato in una provetta sterile e tenerlo in ghiaccio.

Trasferire 20 microlitri di lisato in un tubo separato. Aggiungere 20 microlitri di una soluzione di ioduro di propidio arancione per l'analisi citometrica immediata delle immagini. Eseguire la diluizione di dieci volte dei lisati nel terreno.

Quindi impiattare 100 microlitri di ciascuna diluizione in duplicato. Su piastre HMM aros. Incubare le piastre in una camera umidificata a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per sette-otto giorni.

Conta manualmente le colonie sulle tavole, visualizzando un minimo di 100 e un massimo di 1000 colonie distinte. Per raccogliere i macrofagi vivi, lavare le cellule tre volte con PBS. Quindi aggiungere 0,5 millilitri di PBS e incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Rimuovere i macrofagi dai pozzetti di coltura dei tessuti mediante pipettaggio delicato. Trasferire il liquido in una provetta sterile e conservarlo con ghiaccio. Per configurare lo strumento accelerometro, inserire i moduli ottici a fluorescenza nel sistema e assicurarsi che siano bloccati in posizione.

Attivare il citometro per immagini nel menu a discesa del software per il saggio. Selezionare il tipo di test preimpostato e il tipo di cella per verificarne la vitalità. Il test è ottimizzato per il rilevamento dell'arancia e dello ioduro di propidio per il rilevamento dell'infezione da candida albicans.

Il test è ottimizzato per la rilevazione della GFP. Ora apri la scheda delle opzioni e fai clic su scatta immagine di sfondo Al termine dell'operazione, fai clic su anteprima immagine in campo chiaro per la misurazione della fattibilità A OPI. Miscelare 20 microlitri di campione con 20 microlitri di A OPI e pipettare nella camera di contabilizzazione per il tasso di infezione da candida albicans.

Mescolare bene il campione e pipettarlo direttamente nella camera di conteggio. Dopo che le cellule si sono depositate nella camera, inserire la camera di conteggio nel citometro per immagini per l'acquisizione delle immagini. Metti a fuoco il campione, quindi fai clic su conteggio.

Al termine dell'operazione di acquisizione dell'immagine, rimuovere la camera di conteggio monouso e smaltirla correttamente. Per una misurazione OPI, i risultati della concentrazione e della vitalità vengono visualizzati nella pagina dei risultati del conteggio per determinare il tasso di infezione da candida albicans. Dopo aver ottenuto i risultati del conteggio, fare clic su esporta.

Quindi inviare i dati a FCS express four per l'analisi della popolazione cellulare di GFP. In FCS express, importare il file di dati e tracciare i risultati in un istogramma a fluorescenza. Successivamente, applicare un gate di popolazione cellulare all'istogramma per determinare le percentuali di popolazione di cellule infette da candida albicans.

Questo esperimento monitora la crescita delle cellule macrofagiche infettate dal lievito hcaps Lotum in punti temporali definiti. I campioni vengono colorati e analizzati mediante citometria basata su immagini. Le cellule di lievito liberate dai macrofagi allacciati sono identificate dal software di visione Soter.

Qui, il numero assoluto di lieviti vivi rilevati è maggiore del lievito in grado di formare colonie su terreno solido. Questi dati evidenziano la presenza di un numero significativo di cellule vitali, ma non coltivabili. Questi macrofagi derivati dal midollo osseo sono stati infettati con cellule di lievito C albican che esprimono la proteina fluorescente verde sotto il controllo del promotore A DH one.

Molteplicità di infezioni che vanno da 0,1 a 10 hanno portato ad aumenti incrementali dell'intensità della GFP all'interno dei macrofagi infetti, così come la percentuale totale di macrofagi infetti Una volta padroneggiati. Questa tecnica può essere eseguita in pochi minuti per campione se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di impostare i parametri in modo tale che vengano contate solo le cellule fungine e non le cellule ospiti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la citometria per immagini per quantificare i lieviti patogeni in associazione con le cellule ospiti. Non dimenticare che lavorare con funghi patogeni può essere estremamente pericoloso, quindi indossa dispositivi di protezione individuale e segui le corrette procedure di smaltimento dei rifiuti a rischio biologico.