Name: Luso di Citometria immagine per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Impara a quantificare i lieviti patogeni nelle cellule ospiti con la citometria a immagini. Questo metodo alternativo all'enumerazione delle unità formanti colonia riduce tempi e lavoro nello studio delle interazioni ospite-patogeno.

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1. L&#39;infezione dei macrofagi con H. capsulatum, C. albicans <ol><li> 16 ore prima dell&#39;infezione, macrofagi sementi alla densità desiderata in piastre da 24 pozzetti. In questo protocollo, è stata utilizzata una densità di 3,0 x 10 5 cellule / pozzetto. </li><li> Aggiungi cellule fungine in fase di crescita logaritmica ad una molteplicità desiderato di infezione (MOI). Questo protocollo può accogliere una gamma di MOI (0,2-5,0). Per l&#39;infezione di macrofagi RAW264.7 con H. capsulatum, abbiamo utilizzato un MOI di 0,2. </li><li> Seguendo 1,5 ore per permettere la fagocitosi, i macrofagi lavare tre volte con PBS per rimuovere funghi extracellulari. </li><li> Incubare per numero desiderato di ore prima dell&#39;analisi del campione. A partire MOI (0,2 nel nostro esperimento), cellule di macrofagi infettati rimangono vitali per diversi giorni, ed i campioni possono essere analizzati circa ogni 12-24 hr. </li></ol> 2. Macrofago Lysis <ol><li> Per liberare i funghi da macrofagi, rimuovere i supporti, lavare 3 volte con PBS, eaggiungere 0,5 ml di acqua sterile. In queste condizioni, i macrofagi e lisare cellule fungine rimarranno intatti. </li><li> Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Trasferimento lisato di provetta sterile, tenere in ghiaccio. </li><li> Trasferire 20 microlitri di lisato un tubo separato, quindi aggiungere 20 microlitri AO / soluzione di PI. Passare direttamente al punto 5: &quot;Preparazione del campione per analisi di citometria immagine&quot; </li></ol> 3. CFU placcatura <ol><li> Eseguire dieci volte diluizione dei lisati (dal punto 2.3) in media. </li><li> Tavola 100 ml di ogni diluizione, in duplice copia, su piastre HMM-agarosio. Incubare le piastre in una camera umidificata a 37 ° C con 5% di CO 2 per 7-8 giorni. </li><li> Contare manualmente le colonie su piastre di visualizzazione di un minimo di 100 e un massimo di 1.000 colonie distinte. </li></ol> 4. Visualizzazione dei funghi all&#39;interno dei macrofagi in diretta <ol><li> Per raccogliere i macrofagi vivo, lavare le cellule 3 volte con PBS. Aggiungere 0,5 ml di PBS e incubare per 30 min a 4 ° C.</li><li> Per rimuovere i macrofagi da pozzetti di coltura dei tessuti, pipettare delicatamente su e giù parecchie volte. Trasferimento liquido provetta sterile, tenere in ghiaccio. </li><li> Trasferire 20 ml del campione in una provetta separata, quindi aggiungere 20 microlitri AO / soluzione di PI. Passare direttamente al punto 5: &quot;Preparazione del campione per analisi di citometria immagine&quot;. </li></ol> 5. Preparazione del campione per l&#39;analisi di citometria Immagine <ol><li> Pipettare accuratamente il campione di riferimento e quindi trasferire 20 ml di campione nella camera di conta cellulare usa e getta. </li><li> Permettono alle cellule di stabilirsi nella camera per 30 sec. </li><li> Inserire il conteggio da camera nel citometro immagine. </li></ol> 6. Configurazione strumento Cellometer <ol><li> Inserire l&#39;ottica di fluorescenza Moduli: VB-535-402 e VB-660-502 nel sistema e fare in modo che siano bloccati in posizione. <ol><li> VB-535-402 (eccitazione a 475 nm, emissione a 535 nm) è utilizzato per il rilevamento e arancio acridina GFP. </li><li> VB-660-502 (excitation a 540 nm, emissione a 660 nm) è utilizzato per il rilevamento ioduro di propidio. </li></ol></li><li> Accendere il citometro immagine e aprire il software di accompagnamento. </li></ol> 7. Software Setup Cellometer <ol><li> Selezionare il preset &quot;Reazione&quot; e &quot;Tipo di cella&quot; nel menu a scomparsa del saggio. <ol><li> Per la viabilità, il saggio è ottimizzato per arancio di acridina e la rilevazione ioduro di propidio. </li><li> Per il rilevamento di infezione da Candida albicans, il saggio è ottimizzato per il rilevamento GFP. </li></ol></li><li> Selezionare &quot;Opzioni&quot; nella parte superiore e fare clic su &quot;Sfondo prendere l&#39;immagine&quot;, e consentire il completamento dell&#39;operazione. </li><li> Fare clic su &quot;Anteprima Bright-Campo di immagine&quot;. </li></ol> 8. Acquisizione di immagini di Procedura <ol><li> Inserire la camera del campione preparato nel citometro immagine. </li><li> Utilizzare la manopola di messa a fuoco e regolare la messa a fuoco. </li><li> Una volta a fuoco, fare clic su &quot;Conte&quot;, e consentire l&#39;operazione di acquisizione di immagini da completare. </li><li> Remove la camera di conteggio monouso e smaltire in modo appropriato. </li></ol> 9. Immagine Data Analysis <ol><li> La concentrazione e la misurazione della vitalità <ol><li> Una volta che il conteggio è completato, la concentrazione e la vitalità delle cellule bersaglio vengono visualizzati nella pagina di risultato. </li><li> Fare clic su &quot;Esporta&quot; per esportare i dati in FCS Express 4 per l&#39;analisi popolazione di cellule GFP nel esperimento infezione da Candida albicans. </li></ol></li><li> FCS analisi express di Candida albicans cellule infette <ol><li> Importare il file &quot;. NXDAT&quot; in FCS Express 4 e riportare i risultati in un istogramma di fluorescenza. </li><li> Applicare cancello popolazione cellulare per l&#39;istogramma per determinare le percentuali di popolazione di Candida albicans cellule infette. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Worsham, P. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+plating+of+Histoplasma+capsulatum+without+addition+of+conditioned+medium+or+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Vet.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores.</a> J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).</li>
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<li>Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Image-based+Cytometry+for+Comparison+of+Fluorescent+Viability+Staining+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods.</a> Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).</li>
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<li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285, 1271-1275 (1999).</li>
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<li>Nguyen, V. Q., Sil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switch+to+the+pathogenic+yeast+form+of+Histoplasma+capsulatum+requires+Ryp1%2C+a+conserved+transcriptional+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).</li>
<li>Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+susceptibility+testing+of+fungi+by+flow+cytometry+using+vital+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).</li>
</ol>

Gli autori Leo Li-Ying Chan e Benjamin Paradis sono dipendenti di Nexcelom Bioscience LLC.

Citometria a immagine consente di catturare immagini di alta qualità e, utilizzando software specializzati, eseguire una rapida quantificazione delle cellule. Una sfida potenziale all&#39;adozione di citometria immagine nel campo della patogenesi microbica è che sono presenti in una popolazione mista di cellule, comprese le cellule ospiti di mammifero i microbi da contare. Qui, dimostriamo che citometria immagine può essere utilizzato per la quantificazione dei lieviti patogeni vitali durante l&#39;infezione in vitr...

Studi di funghi patogeni, in associazione con i loro ospiti e / o le cellule ospiti richiedono spesso quantificazione delle cellule fungine vitali corso di un corso di tempo o in diverse condizioni di infezione. Enumerazione di unità formanti colonie (CFU) è il metodo standard con cui è stato misurato il numero di cellule vitali fungine, tuttavia, questa tecnica presenta diversi inconvenienti e limitazioni. In primo luogo, molte specie fungine sono a crescita lenta. La crescita di colonie visibili su terreni solidi può richiedere 1-2 settimane, rallentando notevolmente il ritmo della ricerca. Secondo, manipolazione dei campioni durante CFU placcatura è un processo laborioso, da alcuni diluizioni devono essere placcati per assicurare un numero numerabile di colonie. Terzo, il numero di CFU è tipicamente inferiore al numero di organismi vitali piastrate poiché il rendimento placcatura è ben inferiore al 100%. Ad esempio, l&#39;efficienza di placcatura per il dimorfismo fungino agente patogeno capsulatum Histoplasma può essere alto come il 90%, ma sono di routine a partire da30% e sono ancora più basso (10%) per il relativo fungina dimorph Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Efficienza placcatura per la Candida albicans è soggetto a variabilità 3. Infine, l&#39;analisi CFU rappresenta solo cellule vive e dividendo attivamente capaci di instaurare crescita su terreno solido, mentre in molti casi, sarebbe utile per determinare la presenza e la concentrazione di cellule inattive morte e / o metabolicamente. In precedenza, i metodi di citometria a flusso per la quantificazione dei vari patogeni specie fungine è stata descritta 4-6. Tuttavia, a causa di problemi di contenimento biosicurezza coinvolti utilizzando il livello di biosicurezza 2 (BSL2) o patogeni BSL3 livello sul citofluorimetri condivisi, l&#39;adozione di questa tecnica è stato limitato. Come la citometria a flusso, citometria immagine è un metodo sensibile e rapido di quantificazione delle cellule. Tuttavia, citometria immagine può essere eseguita ad una frazione del costo con risultati paragonabili 7 -11. Qui, descriviamo i metodi per l&#39;esecuzione di citometria a immagine di funghi patogeni in associazione con cellule ospiti. Dimostriamo nostri metodi che utilizzano due funghi patogeni umani: capsulatum Histoplasma e Candida albicans H.. capsulatum è un patogeno fungino dimorphic che causa la malattia respiratoria, negli esseri umani, cresce come lievito in erba e si replica all&#39;interno di macrofagi alveolari Candida albicans è una specie commensali umani che causano occasionalmente candidosi.. Abbiamo dimostrato che la citometria a immagine consente una rapida quantificazione di questi lieviti, insieme con la capacità di visualizzazione.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Life Technologies</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione AO/PI</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CSK-0102</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio monouso</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Cellometer Vision</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di visione per cellometro</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;uso di citometria immagine per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studi dei meccanismi di patogenesi cellulari di lieviti patogeni come la Candida albicans, capsulatum Histoplasma e Cryptococcus neoformans comunemente impiegano infezione di ospiti mammiferi o cellule ospitante (cioè macrofagi) seguita da quantificazione lievito utilizzando formanti colonie analisi unità o citometria a flusso. Mentre unità formanti colonia enumerazione è stato il metodo più comunemente utilizzato in campo, questa tecnica ha degli svantaggi e limitazioni, tra cui lenta crescita di alcune specie fungine su supporti solidi ed efficienze basse e / o variabile placcatura, il che è di particolare interesse quando si confrontano crescita di ceppi wild-type e mutanti. Citometria di flusso può fornire informazioni quantitative relative rapida vitalità del lievito, tuttavia, adozione mediante citometria a flusso per lieviti patogeni è stato limitato per una serie di ragioni pratiche tra cui il suo biosicurezza considerazioni costo elevato e. Qui, dimostriamo una immagine basata sumetodologia citometria utilizzando la Vision Cellometer (Nexcelom Bioscience, LLC) per la quantificazione dei lieviti patogeni vitali in co-coltura con macrofagi. I nostri studi si concentrano sulla individuazione di due funghi patogeni umani: capsulatum Histoplasma e Candida albicans H.. capsulatum colonizza macrofagi alveolari replicando all&#39;interno del phagosome macrofagi, e qui, abbiamo quantitativamente valutare la crescita di H. lieviti capsulatum in macrofagi RAW 264.7 con arancio di acridina / ioduro di propidio colorazione in combinazione con citometria immagine. Il nostro metodo fedelmente ricapitola i trend di crescita, misurata dalla colonia tradizionale formando unità di enumerazione, ma di un significativo aumento della sensibilità. Inoltre, valutiamo direttamente infezione di macrofagi in diretta con un ceppo GFP che esprimono di C. albicans. La nostra metodologia offre un mezzo rapido, preciso ed economico per il rilevamento e la quantificazione di importanti funghi patogeni umani in associazione spiritocellule ospiti h.

Abbiamo usato il Cellometer Vision immagine citometro a monitorare la crescita di H. capsulatum in macrofagi. 264.7 cellule RAW sono state infettate con H. cellule di lievito capsulatum e in vari momenti, i campioni sono stati sottoposti ad AO / PI colorazione seguita da analisi di citometria basata sulle immagini. In parallelo, i campioni sono stati analizzati con tradizionale enumerazione CFU. Ad ogni tempo, i campioni sono stati incubati in acqua per lisare macrofagi e le cellule di lievito...

Qui mostriamo come citometria immagine può essere utilizzato per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti in coltura. Questa tecnica può essere utilizzata come alternativa al CFU enumerazione.

L&#39;uso di Citometria immagine per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i lieviti patogeni in associazione con cellule ospiti senza piastrare unità formanti colonie. Innanzitutto, infettare le cellule macrofagiche con lieviti di H capsulation o C albicans e colorare le cellule macrofagiche infette con aine orange e ioduro di propidio per evidenziare i lieviti vitali. Successivamente, mediante un citometro ad imaging, acquisire una serie di immagini e analizzare i parametri di dimensione e forma per enumerare con precisione le cellule di lievito.I risultati della citometria mediante immagini possono essere efficacemente utilizzati per quantificare lieviti patogeni in associazione con cellule ospiti. Ebbi per la prima volta l'idea di questo metodo durante la mia ricerca nel campo della patogenesi fungina, in cui dovevo ripetutamente effettuare piastre e contare le unità formanti colonie per quantificare il fungo patogeno Histoplasma capsulatum. Il vantaggio principale della citometria mediante immagini rispetto al metodo standard di enumerazione delle UFC è la maggiore velocità, poiché elimina le fasi lunghe e laboriose di semina, incubazione e conteggio di multiple diluizioni seriali delle UFC durante il confronto della crescita di ceppi selvatici e mutanti all'interno delle cellule ospiti.Questo metodo elimina il potenziale bias introdotto dalle diverse capacità di avviare una crescita di qualità su mezzo solido. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà nell'analisi citometrica delle immagini, nell'utilizzo dello strumento e del software.Iniziare la procedura coltivando i macrofagi alla densità desiderata. In piastre a 24 pozzetti, aggiungere le cellule fungine in fase di crescita logaritmica, quindi incubare per 90 minuti per consentire la fagocitosi. Successivamente, lavare i macrofagi tre volte con PBS per rimuovere i funghi extracellulari e incubare per i tempi definiti sperimentalmente prima dell'analisi del campione. A bassa molteplicità di infezione, le cellule di macrofagi infettati rimangono vitali per diversi giorni e i campioni possono essere analizzati approssimativamente ogni 12-24 ore.Dopo tre lavaggi con PBS, aggiungere 0,5 millilitri di acqua sterile alle cellule di macrofagi infetti. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per liberare i funghi dalle cellule di macrofagi. Successivamente, raccogliere il lisato in una provetta sterile e mantenere sul ghiaccio.Trasferire 20 microlitri del lisato in un tubo separato. Aggiungere 20 microlitri di soluzione di propidio ioduro in aine arancione per l’analisi citometrica mediante imaging immediata. Eseguire un’opportuna diluizione dei lisati nel mezzo.Quindi piastrare 100 microlitri di ciascuna diluizione in duplicato su piastre HMM aros. Incubare le piastre in una camera umidificata a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per sette-otto giorni.Contare manualmente le colonie sulle piastre, selezionando quelle con un minimo di 100 e un massimo di 1000 colonie distinte. Per raccogliere i macrofagi vivi, lavare le cellule tre volte con PBS. Quindi aggiungere 0,5 millilitri di PBS e incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius.Rimuovere i macrofagi dalle pozzette della coltura cellulare mediante pipettaggio delicato. Trasferire il liquido in un tubo sterile e conservare sul ghiaccio. Per configurare lo strumento accelerometrico, inserire i moduli ottici a fluorescenza nel sistema e assicurarsi che siano bloccati correttamente.Accendere il citometro ad immagini nel menu a discesa del saggio nel software. Selezionare il tipo di saggio preimpostato e il tipo di cellula per la vitalità. Il saggio è ottimizzato per la rilevazione di acridina arancione e ioduro di propidio per la rilevazione dell'infezione da candida albicans.Il saggio è ottimizzato per la rilevazione di GFP. Aprire ora la scheda delle opzioni e fare clic su "acquisisci immagine di sfondo". Al termine dell'operazione, fare clic su "anteprima immagine in campo chiaro" per la misurazione della vitalità A OPI. Mescolare 20 microlitri di campione con 20 microlitri di A OPI e pipettare nella camera di conteggio per il tasso di infezione da Candida albicans.Mescolare bene il campione e pipettarlo direttamente nella camera di conteggio. Dopo che le cellule si sono depositate nella camera, inserire la camera di conteggio nel citometro ad immagini per l'acquisizione delle immagini. Mettere a fuoco il campione, quindi fare clic su "conteggio".Al termine dell'operazione di acquisizione dell'immagine, rimuovere la camera di conta monouso e smaltirla correttamente. Per la misurazione A OPI, i risultati relativi alla concentrazione e alla vitalità vengono visualizzati nella pagina dei risultati di conta per determinare il tasso di infezione da candida albicans. Dopo aver ottenuto i risultati della conta, fare clic su esporta.Quindi inviare i dati a FCS Express 4 per l'analisi della popolazione cellulare di GFP. In FCS Express, importare il file di dati e rappresentare i risultati in un istogramma di fluorescenza. Successivamente, applicare un'area di selezione della popolazione cellulare all'istogramma per determinare le percentuali di popolazione delle cellule infette da candida albicans.Questo esperimento monitora la crescita di cellule macrofagiche infettate dal lievito hcaps Lotum in punti temporali definiti. I campioni vengono colorati e analizzati mediante citometria basata su immagini. Le cellule di lievito liberate dai macrofagi infettati vengono identificate dal software di visione Soter.Qui, il numero assoluto di lieviti vitali rilevati è maggiore rispetto ai lieviti capaci di formare colonie su mezzo solido. Questi dati evidenziano la presenza di un numero significativo di cellule vitali ma non coltivabili. Questi macrofagi derivati dal midollo osseo sono stati infettati con cellule di lievito di C albicans che esprimono la proteina fluorescente verde sotto il controllo del promotore A DH uno.Moltiplicità di infezione comprese tra 0,1 e 10 hanno determinato incrementi progressivi nell'intensità della GFP all'interno dei macrofagi infetti, così come nella percentuale totale di macrofagi infetti. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in soli minuti per campione se effettuata correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di impostare i parametri in modo da contare esclusivamente le cellule fungine e non quelle dell'ospite.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la citometria dell'immagine per quantificare lieviti patogeni in associazione con cellule dell'ospite. Non dimenticare che lavorare con funghi patogeni può essere estremamente pericoloso, quindi indossa dispositivi di protezione individuale e segui le corrette procedure di smaltimento dei rifiuti pericolosi biologici.

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Questo documento descrive in dettaglio un protocollo per la preparazione di una co-cultura delle cellule criptococcali e delle amebe che viene studiata utilizzando immagini ancora fluorescenti e immagini al microscopio elettronico a trasmissione ad alta risoluzione. Di seguito sono illustrati in che modo i dati quantitativi possono integrare tali informazioni qualitative.

Uso complementare di tecniche microscopiche e lettura di fluorescenza nello studio delle interazioni Cryptococcus-Amoeba

Descriviamo un protocollo che utilizza la fluorescenza nell'ibridazione situ (FISH) per visualizzare più RNA herpesvirali all'interno di cellule umane lytically infette, sia in sospensione che aderenti. Questo protocollo include la quantificazione della fluorescenza producendo un rapporto nucleocitoplasmatica e può essere esteso per la visualizzazione simultanea di proteine ospite e virali con immunofluorescenza (IF).

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) e Immunofluorescence (IF) di prodotti genici specifici nelle cellule infette da KSHV

Lo scopo di questo protocollo è quello di visualizzare Candida albicans forma cellulare e localizzazione nel tratto gastrointestinale dei mammiferi.

Visualizzazione degli albicani Candida nel tratto gastrointestinale Murine utilizzando l'ibridazione fluorescente in Situ

Questo protocollo fornisce un metodo veloce e affidabile per misurare quantitativamente la fagocitosi di Aspergillus fumigatus conidia da fagociti primari umani utilizzando la citometria di flusso e per discriminare la fagocitosi di conidia dalla mera adesione ai leucociti.

Misurare la fagocitosi di Aspergillus fumigatus Conidia da parte dei Leucociti Umani utilizzando Flow Cytometry

I coloranti fluorescenti vitali sono strumenti essenziali per l'analisi dell'imaging a cellule vive nella moderna biologia delle cellule fungine. Questo documento descrive in dettaglio l'applicazione di coloranti fluorescenti affermati e meno noti per il monitoraggio della dinamica della membrana plasmatica, dell'endo/esocitosi e della morfogenesi delle pareti cellulari nei funghi filamentosi.

Applicazione di coloranti fluorescenti selettivi a membrana e a parete cellulare per l'imaging a celle vive di Filamentous Fungi

Qui, presentiamo un protocollo per profilare l'interazione tra ospite e agente patogeno durante l'infezione da proteomica a base di spettrometria di massa. Questo protocollo utilizza la quantificazione senza etichette per misurare i cambiamenti nell'abbondanza proteica sia dell'ospite (ad esempio, macrofagi) che dell'agente patogeno (ad esempio, Cryptococcus neoformans)in un singolo esperimento.

Flusso di lavoro proteomica quantitativa senza etichette per interazioni host-patogeno guidate dalla scoperta

Presentiamo un metodo che utilizza un approccio di analisi delle immagini generalizzabile basato sull'area per identificare i conteggi delle cellule. L'analisi di diverse popolazioni cellulari ha sfruttato le significative differenze di altezza e struttura cellulare tra diversi tipi di cellule all'interno di un algoritmo adattivo.

Algoritmo di analisi delle immagini basato sull'area per la quantificazione delle cocolture di macrofagi-fibroblasti

Impara a quantificare i lieviti patogeni nelle cellule ospiti con la citometria a immagini. Questo metodo alternativo all'enumerazione delle unità formanti colonia riduce tempi e lavoro nello studio delle interazioni ospite-patogeno.

L'uso di Citometria immagine per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti

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